耐受在维管组织中生长的致病微生物的植物

摘要

本发明涉及耐受由限于韧皮部的微生物引起的感染的转基因植物的产生，其包括诱导嵌合或融合蛋白的表达，该嵌合或融合蛋白包含来檬的韧皮部蛋白(CsPP16)、连接头蛋白和具有抗微生物活性(例如，具有抗菌活性或抗菌水解酶)的蛋白。融合蛋白中与CsPP16蛋白对应的部分可以发挥其共质体移动的功能，共质体移动通过植物的胞间连丝发生以到达韧皮部筛管，并且抗微生物大部分可以作用于消除定殖在韧皮部的微生物。本发明使得可以控制造成柑橘黄化或黄龙病(HLB)的疾病，还适用于治疗由定殖在高等植物维管组织中的细菌和其他微生物引起的其他疾病。本发明包括设计出的携带并表达融合蛋白的分子载体，和通过该融合蛋白的稳定表达而得到的转基因植物，以及转化健康或患病成体植物以表达嵌合蛋白并控制例如HLB疾病的方法。融合蛋白对患病植物的转化是产生不含致病微生物例如不含HLB细菌的健康嫩芽的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及的领域是应用分子生物学技术，通过表达具有抗微生 物活性、并且在翻译水平上与能够超细胞移动和全身移动的蛋白融合 的蛋白来产生耐受植物的维管组织中的植物致病性微生物的植物。在 其一个实施方式中，本发明涉及一种通过组成性地表达与能够经维管 组织而共质体(simplasmic)移动到远端组织的蛋白相融合的组织特异 性维管抗微生物蛋白，来控制造成柑橘黄化或黄龙病(HLB)的细菌 的方法。

背景技术

黄龙病(中文为“黄龙”)是在墨西哥有很大重要性的柑橘疾病。 其也以首字母HLB和英文词Greening或Ex-Greening被人们所知。该 疾病非常有破坏性，因为可造成柑橘生产中的全部损失。HLB症状包 括但不限于叶子黄化，果实的减产以及甚至无种子(图1)。此外，与 农业目标植物的大部分疾病一致的是，对HLB没有有效治理。出于该 原因，早期的诊断较为关键，且治疗对于逆转疾病是必要的。注意到， 自从在东亚检测到之后，该疾病已经在世界范围内快速传播；现在已 经在佛罗里达和墨西哥被检测到。其也被认为是对全世界柑橘生产的 主要威胁(www.senasica.sagarpa.gob.mx)。

HLB疾病首次于1929年在中国报道，其快速传播并于1947年在 南非检测到；其从1951年开始也已经成为台湾柑橘生产中的严重问题。 因此，从1998年以来，其主要分散在热带和亚热带的柑橘生长区域， 包括美国佛罗里达。在墨西哥，从2009年开始，其已经在该国的多个 生产区域有过报道，从锡那罗亚到坎佩切湾。该疾病很可能已经存在 于墨西哥的其他柑橘生产区，使得其控制成为优先考虑的事。

在墨西哥，有23个生产柑橘的州，在其中13个州中已经检测到 HLB细菌和传播该疾病的昆虫载体。该植物病害问题较为紧要，因为 柑橘以549,000公顷生长且年产七百万吨，价值$102.06亿墨西哥比索 (SENASICA，2011)。

在对HLB感染易感的柑橘中，更严重的症状发生在墨西哥青柠檬 (Mexicolime)、橙(oranges(Citrussinensis))、橘(mandarinorange (Citrusreticulata))和葡萄柚(grapefruits(CitrusreticulataxCitrus paradisi))，而不是太严重的症状存在于青柠檬(lime(Citruslimon)) 和柚子(tangerines(Citrusparadisi))、Citruslimonia、巴勒斯坦甜青 柠(Citruslimettioides)(McClean&Schwarz,在EPPOquarantinepest 中引用,1990)。然而，在世界范围内，感染植物的列表更多，其中易 感物种列于以下(HalbertandManjunath,2004)：Aeglopsischevalieri Swingle、AtalantiamissionisOliver、BalsamocitrusdaweiStapf.、 CalodendrumcapensisThunb、长春花(Catharanthusroseus(L.)G.Don) XCitronciruswebberiJ.Ingram&H.E.Moore、Citrusamblycarpa Ochse、Citrusaurantiifolia(Christm.)Swingle、苦橙(Citrusaurantium L.)、扁实柠檬(CitrusdepressaHayata)、Citrusgrandis(L.)Osbeck、 CitrushassakuHort.exTanaka、CitrushystrixDC.、Citrusichangensis Swingle、CitrusjambhiriLushington、CitrusjunosSieb.exTanaka、Citrus kabuchiHort.exTanaka、Citruslimon(L.)Burm.、Citrusxlimonia Osbeck、CitrusxnobilisLour."Ortanique"、Citrusmaxima (pomelo/shaddock)、CitrusxnobilisLour.、CitrusotoHort.exTanaka、 CitrusxparadisiMacfad.、CitrusreticulataBlanco、Citrussinensis(L.) Osbeck、CitrussunkiHort.exTanaka、温州蜜柑(Citrusunshiu(Mack.) Marc)、ClausenaindicaOliver、Clausenalansium(Lour.)Skeels、Cuscuta australisR.Br.(旋花科(Convolvulaceae)，菟丝子科(Cuscutaceae))、 金橘(Fortunellaspp.)、LimoniaacidissimaL.、Microcitrusaustralasica (F.J.Muell.)Swingle、Murrayakoenigii(L.)、千里香(Murrayapaniculata (L.)Jack)、Poncirustrifoliata(L.))Raf.、Swingleaglutinosa(Blanco) Merr.、ToddalialanceolataLam和Triphasiatrifolia(Burm.f.)P.Wilson。

相似地，非宿主包括CitrusindicaTanaka、CitruslimettaRisso、和 CitrusmacropteraMontrons(Gomez,2008)。

已经意识到，该疾病的病因学是细菌性的(韧皮部杆菌属 (Liberibacter))；然而，存在多种相关菌株(表1)。已经发现，HLB 通过木虱类(半翅目)昆虫而传播，木虱类包括其他重要的载体例如 白蚊子(whitemidge)和蚜虫。与其他载体携带的疾病相似，用于控 制该疾病的策略之一是精确地控制与其相关的载体。尽管木虱传播疾 病的机理还没有确切已知，但清楚的是，这些昆虫能够将其非常高效 地传播。此外，木虱与其他蚜虫类似地传播病原体，所以我们可以期 待，细菌传播细节将与限于韧皮部的其他病原体相似。它们也能够传 播病毒，这使得这些载体的控制更加必要。

造成HLB的柑桔黄龙病菌(CandidatusLiberibacterspp)的载体之 一是柑橘木虱(DiaphorinacitriKuwayama)(半翅目：木虱科)；该昆 虫的胚期为15℃下9.7天至28℃下3.5天；卵排在植物嫩芽的尖端， 在新出的折叠叶上和之间，在同一嫩枝中频繁地大量出现；产卵依赖 于嫩芽的存在，而雌性在其一生中排出高达800个卵，幼虫附着于并 定居在嫩枝和叶柄上，形成具有不同数量的个体的群落。幼虫经沉积 在叶上的线而分泌出白色蜡质物，而成体几乎没有承受长距离飞行的 能力，但是可以通过气流而长距离转移。

表1.与黄龙病(HLB)*相关的细菌

参考文献：*StrategicPlanningfortheFloridaCitrusIndustry:AddressingCitrus Greening；^aBové等人,1974；GarnierandBové,1983；Jagoueix等人,1994, 1997；Garnier等人,2000,Duan等人,2008；^bGudmestadandSecor,2007； Hansen等人,2008；Lin等人,2009；^cTeixeira等人,2008；Wulffet等人,2009； ^dChen等人,2009

昆虫的生物周期的持续时间(卵-成体)分别在28℃和15℃下从 14.1天变化至49.3天，其中，25℃～28℃的温度最适合于其发育，因为 木虱在33℃和10℃温度下不发育。昆虫在春末夏初具有群体高峰(与 柑橘的发芽期一致)。木虱的存在并不意味着其感染有细菌，尽管在墨 西哥的病例中，两种元素均存在。

已经确定出，HLB由形成连贯分支(coherentclade)的细菌群体 造成，通常称为韧皮部杆菌(CandidatusLiberibacter)、柑桔黄龙病亚 洲种病原菌(CandidatusLiberibacterasiaticus)、柑桔黄龙病非洲种病 原菌(CandidatusLiberibacterafricanus)、和柑桔黄龙病美洲种病原菌 (CandidatusLiberibacteramericanus)。墨西哥已经报道过，柑桔黄龙 病亚洲种病原菌是由柑橘木虱传输的细菌且存在于芸香科中；然而， 也报道过CandidatusLiberibacterpsyllarous的存在，其宿主植物是茄 科。巴西和中国已经报道过与HLB相关的植原体也限于所感染植物的 维管系统。迄今为止，还无法培养这些细菌群，其阻止了这些病原体 的进一步表征。尽管韧皮部杆菌与其他群体的分类学关系不是完全清 楚，但可得的DNA序列表明，其是α-变形菌。可得的信息表明，其与 根瘤菌例如慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)相关，与农杆菌 (Agrobacterium)更远。这些细菌群具有由肽聚糖构成的细胞壁，因 而其可能对破坏酶例如溶菌酶易感。

韧皮部杆菌(CaL)细菌限于其宿主的韧皮部；存在大量的植物病 原体，其也积聚在韧皮部，或者限于组织，从病毒(例如双粒病毒组 和黄矮病毒组)到细菌(例如，主要是植原体)。真菌的案例几乎没有 研究，但是有可能很多内生菌定植在韧皮部中。对该组织作用的认知 对于开发针对这些病原体的策略是必要的。

显著地，革兰氏阴性菌在高的流体静压下易感于溶菌酶(例如， 具有10mM磷酸钾的缓冲剂(Marsschalk等人,2001))，其为在植物韧 皮部中的条件。它们感染的症状有时候与营养缺陷混淆，但是随着感 染的进展，疾病中出现的不对称黄化斑将区别于由营养缺陷产生的在 中脉两侧的对称斑(图1)。

具体而言，这些病原体在韧皮部中的积聚似乎造成大多数所观察 到的症状。感染组织的超微结构分析已经示出，韧皮部的自由流动受 到筛板中大量胼胝质(β1-3葡聚糖酶)沉积的阻断。经由阻断维管束 而连通的植物器官发育出萎黄病；这将当然地造成所感染植物的较低 生长速率。胼胝质的积聚是对韧皮部中存在这些细菌的非受控应答， 其还提示着针对疾病的治疗(即，包括例如在韧皮部中表达葡聚糖酶)。

韧皮部中溶质的移动由互相连通的来源组织与消耗组织之间的压 力差引起，因为在这些溶质中，特别是蔗糖或其他糖以及氨基酸被快 速消耗，使得水因为渗透而进入细胞，接着稀释溶质；还存在溶质碳 固定在组织源中的更大积聚。两个组织之间的连通使得溶质可以在这 些组织之间移动。韧皮部也是在参与化学信号通讯的较远器官之间化 学信号传送所经由的管道，其中所述通讯是协调维管植物的生长发育 所必须的，它们都应答于遗传程序和外界刺激。

韧皮部中的传输在感染有韧皮部杆菌的特别是共质体传输经由胞 质通道或胞间连丝发生的植物中被改变。韧皮部杆菌感染造成叶中淀 粉的过度积聚；这让人联想到韧皮部的共质体传输功能突变的突变体， 例如玉米中的sxd(Provencher等人，1999)。sxd突变体在糖的共质体 流通中具有缺陷，造成淀粉糖共聚成淀粉，产生小斑点分散不对称症， 例如在患HLB的柑橘中发现的。

为了解HLB病，描述高等植物的传导组织的功能和结果是重要的， 在高等植物中，其特殊化赋予它们进化优势，其中该组织由木质部(水 和矿物质的单向传导)和韧皮部形成，韧皮部传输光吸收物(photo assimilate)、矿物质、蛋白和核酸，并基本由两种细胞类型构成：伴细 胞(CA)和筛管分子(EC)，筛管分子可以是筛管(TC)，伴细胞和 筛管分子均通过修饰的胞间连丝而连通。被子植物的维管组织不同于 形成层细胞，其在成熟时经历纵向不对称分裂(Esau，1953)，丢失细 胞核，并生成筛管。图2列出高等植物的维管组织和筛管的个体发生、 以及其与伴细胞的关系。图3示出筛管(TC)中细菌的存在，其中它 们建立并定居，而图4示出胞间连丝(PD)的结构，其使筛管和伴细 胞之间的共质体连接通道，其中显微图片示出其被感染引起的纤维状 和无定形材料阻塞时的外观。这些纤维状材料的沉积的生化鉴定表明， 它们是1-3葡聚糖(胼胝质)和称为PP2的“愈合”蛋白，其中两种 分子均随着过敏感应而形成并沉积在胞间连丝上。

胞间连丝是跨越膜和细胞壁的通道；它们不是被动的，而是专门 作用为促进并调节植物细胞之间的通讯以及水、营养物、代谢物和大 分子的传导的通道；它们包含内质网的捕获形式，连通所有植物细胞， 除保卫细胞外。胞间连丝似乎可实现来自两种细胞类型的最高30kD 的分子的移动；相比之下，连通叶肉细胞的胞间连丝具有约1kD的排 出限(exclusionlimit)。

大分子经由胞间连丝传输的机制较为复杂。由Haywood等人，2004 记载的模型考虑易位的结构和促进分子的存在，其中识别分子的系统 性性质的蛋白形成复合物，其由锚定至胞间连丝的开始处的蛋白所识 别；应当存在大量的复合物来识别序列多样化的家族，并且能够跨越 共质体屏障；分子伴侣型分子展开蛋白并起始其向筛管的易位。体系 控制通过细胞核来运作，细胞核转录用于超细胞性质蛋白的编码RNA； 分子在跨越胞间连丝后发生折叠，并进而由据推测将它们表明为靶标 组织的其他分子所识别。已经发现大量的蛋白，其可以经由胞间连丝 而卷起，增加其排出限，其中这些蛋白中的一些具有非特异性地结合 RNA的能力，而在其他情况中，已经表明了其在成花诱导现象中的长 距离通讯作用；还存在RNA穿越异种移植并到达远端组织例如营养和 花分生组织的能力的背景，如RuizMedrano和同事(1999)关于南瓜 小果(squash)的报道。

由于胞间连丝的空间限制，存在如上所述的分子排出限，然而，1 至250kD的更高分子量蛋白和RNA的存在表明，传输高度有选择性， 并通过尚未清楚了解的机制在胞间连丝进入中进行调节。涉及的化学 信号的性质在较大程度上未知，但是已经在韧皮部中找到多种分子， 韧皮部可以提供这些信号；在这当中有小分子量的植物激素和其他分 子、脂质、蛋白、和多种多样的RNA形态。

目前，实验方法正开发用于治疗HLB，包括施用杀虫剂来控制载 体。然而，其毒性和残余活性限制了其应用，而期望在韧皮部内达到 系统性分布的抗生素使用所具有的限制是，其应用要求一定要连续， 其意味着对该策略相当大的投资。

为控制HLB，已报道四环素的使用，其干扰细菌中的蛋白合成， 或青霉素的使用，其抑制细菌细胞壁结构组分肽聚糖的合成。尽管结 果是症状的显著降低，但由于由此产生的植物毒性，已弃用抑菌四环 素；此外，不建议在人消费的植物和动物中使用抗生素。

近来，已获得柑桔黄龙病亚洲种病原菌以及韧皮部杆菌ZC(一种 紧密相关的细菌，其造成土豆中称为斑马片(Zebrachip)的疾病)的 基因组序列；两者相互具有高度相似性(Hartung等人，2011；Lin等 人，2011)。然而，两种病原体的可得序列的比较表明在它们基因组中 相异的重排；其中基因物质的获得和缺失促成基因组差别。无论如何， 可得的信息清楚地示出，韧皮部杆菌以适应植物韧皮部的“生活方式” 形成紧密的分化枝，包括例如合成某些氨基酸和核酸的有限能力。与 草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobiummelitoti)这种根瘤菌的基因组的比 较示出，尽管两种细菌明显相关，但韧皮部杆菌具有更小的基因组， 高得多的A/T含量，以及对由于在其DNA聚合酶上缺乏核酸外切酶结 构域以及存在用于DNA连接酶的单个基因至草木樨中华根瘤菌的10 个基因而产生的DNA进行修复的有限潜在能力(Hartung等人，2011)。

研究表明韧皮部杆菌ZC对β-内酰胺抗生素的易感性，示出其细胞 壁与具有肽聚糖的其他细菌相似并因而易感于溶菌酶。此外，柑桔黄 龙病亚洲种病原菌清楚地显示出典型的革兰氏阴性菌细胞壁，其也示 出用β-内酰胺抗生素治疗是可行的，这种策略正在佛罗里达大学和 USDA进行实验来控制该细菌(Bové,2006)。

另一个已经被考虑的策略是诱导参与系统性获得性抗性或病原体 应答中的基因的表达。然而，从商业角度来看，这不是所期望的，因 为植物在应激条件下将通常降低生产率。已经考虑平行策略，使昆虫 载体中的关键基因沉默。控制木虱的RNA干扰(RNAi)将通过在对 植物供料时将其引入载体而在植物中表达，使得昆虫中的必要基因终 止并由此造成种群减少。

已经提出多种策略来用于控制在共质体结构域中成活的细菌，特 别是HLB的致病因子。多个实验室，主要在美国，已经提供不同的策 略来控制细菌韧皮部杆菌。例如，柑橘的基因转化已经成功地通过根 癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的技术和基因枪而实行。 表2记载有不同的农业目标基因在例如柑橘物种中的表达。

表2.不同农业目标基因在柑橘物种中的表达*

迄今为止，已经使用抗微生物肽的应用、天然免疫应答的诱发和 针对木虱的RNA干扰的应用，但成效有限。

抗微生物肽的实例是(动物来源的)骨髓抗微生物肽、β-防御素、 Polifemusine-1、鲎肽素、protegrin-1、爪蟾抗菌肽、indolicidin；(昆虫 来源的)天蚕素、麻蝇毒素IA、红蝽素(Pirrocoricine)，以及植物和 动物来源的防御素。已评估这些分子的表达，但是结果还未产生期望 的控制效果。

目前，存在用于疾病控制目的的植物基因转化的多种操作指南。

例如，专利US6455759提及在转基因植物中产生多种蛋白，包括 表达由连接头连接并由植物中的酶切割的两个融合蛋白的DNA构建 体，融合蛋白均保持为游离蛋白。

专利US7196057提及保护植物免受病原体昆虫的融合蛋白的产 生，其中这些蛋白的一部分对昆虫有毒性，且其其他部分经由昆虫消 化道改变毒素的位置，该专利仅提及获得表达这些融合蛋白的载体的 转基因植物的可能性，而没有示出其性能的证据。

专利申请WO2009/064255涉及使用使融合蛋白位于植物中维管组 织的质外体的信号锚定物，其可以用于将分泌蛋白经基因改造至植物 细胞的细胞壁和/或质外体并用于在作为生物反应器的转基因植物细胞 中产生分泌蛋白。

专利申请WO99/28484涉及改善植物及其后代对病原体的抗性或 耐受性的方法，由以下步骤组成：表达包含具有抗病原体活性的第一 结构域、连接头、和具有抗病原体活性的第二结构域的融合蛋白；其 还描述了表达构建体，在大肠杆菌(E.coli)中的表达，其导入农杆菌 (Agrobacteriumsp)来介导植物的转化及其针对病原体线虫的表现。

尽管如上所述，有必要提出解决由经共质体侵入韧皮部的微生物 引起的植物疾病的方法和/或有效控制策略，因为在本发明之前，没有 有效控制和/或应对方法。

发明内容

本发明公开用于治疗由侵入植物韧皮部的病原微生物造成的疾病 的有效方法。具体而言，本发明公开一种对转化有含柑橘CsPP16基因 的根癌农杆菌的柑橘外植体的遗传修饰，CsPP16基因与在南瓜中测试 的CmPP16基因同源(Xoconostle-Cazares等人,1999)。该CsPP16基 因在翻译水平上与选自人α-防御素、人溶菌酶、indolisine、爪蟾抗菌 肽、天蚕素、麻蝇毒素、溶菌酶及其混合中的抗微生物肽融合。出于 该目的，使用使得CsPP16蛋白和抗微生物肽可以独立地弯曲的铰链。 根据本发明，用在韧皮部病原体细菌控制的蛋白经铰链融合至氨基末 端和超细胞移动蛋白CsPP16。

所有如本文所述的基因构建体包含花椰菜花叶病毒CaMV35S的 35S启动子作为启动子1以及NOS序列作为终止序列。此外，另一套 构建体包含拟南芥(Arabidopsisthaliana)的韧皮部特异表达启动子 59880(Ruiz-Medrano等人,2011)，驱动上述抗微生物肽的表达，由此 使得仅在存在有植物致病细菌的维管组织中表达。所有本文所述的构 建体在各端包含农杆菌T-DNA的左右边界，并缺少可选择标记物(图 24)。使用上述构建体转化的第一个方法包括，例如，柑橘茎和嫩芽 (shoot)的基因转化，其在体外再生以获得经遗传修饰的幼苗，将幼 苗接枝到例如Citrusmacrophylla或沃尔卡默檬(Citrusvolkameriana) 种类的酸橙的砧木或模式物(pattern)中。该模式物可以来自于一厘米 的幼苗，例如来自酸橙种子的萌发，或者是年幼柑橘植物的模式物， 其在侧面接枝到生长已经经遗传修饰的芽中。

使用上述构建体转化的第二种方法包括，推进生成小面积的基因 转化的成体植物，不论是健康的还是因造成HLB的细菌而患病的。这 包括将位于消耗组织和产生组织(光合成)之间的茎或枝的维管组织 露出。这通过刮擦(scrapping)直至观察到绿色的光合组织，其中放 置使用经乙酰丁香酮预处理并在具有植物生长诱导剂(植物生长素和 细胞分裂素)的缓冲液中稀释的农杆菌溶液润湿的拭子。将处理后的 植物或枝放置在袋中以保持根癌农杆菌的高湿度，干透3天，在指定 处理后移除敷料。将植物暴露于两天的处理，最高为一个月时间，在 所有情况中均得到抗微生物剂在维管组织中的表达并在消耗组织中积 聚，这些为细菌感染的位点。

根据本发明，在对患病植物进行转化之后，下一步骤是监控造成 HLB的细菌的存在情况，其由于单独或组合施用的抗微生物剂的表达 的处理方式而减少。经本发明处理的患病植物恢复光合成，这表明维 管组织不再阻塞，且植物能够开花并长满果实。同时，用防御素处理 的植物开花，如图21(A)中所见，呈现出101和84g的两个青柠， 将其在横断轴上切片，显示出对称的中果皮。与受感染的那些相比， 这是健康水果的正常外观，而感染的那些示出不对称区域或中果皮(图 21(B))。

在通过本发明对1.20m患病植物进行转化以及对其长达210天的 评估中所获得的结果显示出HLB症状的实质降低和植物正常生理条件 的恢复(生长、嫩芽产生、增加光合成、开花和结果)(图17)。

此外，与用携带质粒但没有编码上述抗微生物剂的基因的农杆菌 转化的对照树木相比，具有卫生控制认证的1.20m年幼树木的基因转 化获得零细菌或少量细菌，其中年幼树木来自认证的埃米利亚诺-萨帕 塔生态园(vivariumEmilianoZapata)并在墨西哥科利马州特科曼市在 生物安全条件下暴露于在田地中感染有韧皮部杆菌的木虱(图22)。所 述的树木暴露于感染有韧皮部杆菌的木虱，并在60天后评测细菌的存 在。该评测包括收集两个成熟光合成树叶和两个称为芽的嫩叶。分离 中央叶脉的总DNA，并使用荧光探针通过韧皮部杆菌16S基因的实时 PCR而测算细菌的数量。将获得的值用青柠的COX内生基因进行归一 化(图23)。获得的结果示出，在用溶菌酶、防御素以及两者组合(Lys 和Def)的处理中，与不表达抗微生物剂的对照植物相比，细菌的数量 减少或检测不到。

此外，根据本发明的包括外植体转化以及经由组织培养而再生的 第二种方法显示出，植物能够再生并且有活力。在这些实验中，通过 表达上述抗微生物剂来获得有活力的接枝植物，其中将十个独立的转 化体选择用于在生物安全条件下的进一步田间测试。

附图说明

图1示出树木(上左)和叶(上右)中HLB的特征病状，以及叶 和果实(底部)中的HLB症状。可以观察到，败育种子引起的畸形果 实以及褐色的维管束(来源于StrategicPlanningfortheFloridaCitrus Industry,AddressingCitrus,2010)。

图2示出高等植物的维管组织，示出维管束的截面(左)；(A)筛 管分子的个体发育；(B)纵向形成层细胞分裂；和(C)不对称生长； (D)细胞核片段化以及(E)其消失；(F)粘性体(mucilaginousbody) 的集聚和筛板贯穿在功能管中。(G)成熟的筛管分子(右)示出在筛 板中的开孔，以胼胝质为界，以及分散在具有ER和质体的外周胞浆中 的P蛋白。

图3示出描绘局限于柑橘树维管韧皮部的韧皮部杆菌的存在的电 镜图(来自StrategicPlanningfortheFloridaCitrusIndustry,Addressing Citrus,2010)。观察到伴细胞(CA)、胞间连丝(PD)和筛管(TC)。

图4示出胞间连丝的位置和结构。(上)胞间连丝贯穿的各个孔或 连丝微管(desmotubulum)的壁位点，其中臂经常更厚；内质网贯通 的内部空间(tank)靠近壁并与两个细胞中的胞间连丝相关。(下左) 也可以观察到筛管(紫)和伴细胞(粉)的绘图，且(下右)存在于 伴细胞(CA)和管或筛管分子(EC)之间的分支胞间连丝的透射图。 注意到，内质网(ER)贯通胞间连丝。

图5示出CmPP16蛋白的移动能力的证据(Xoconostle-Cazares等 人,1999)。观察(a)将蛋白微注射到本氏烟(Nicotianabenthamiana) 叶的叶肉细胞中，且蛋白能够从细胞移动到细胞；(d和g)当蛋白与 RNA复合时，其介导RNA移动到邻近细胞。CmPP16的RNA感测以 及RCNMW的RNA2示为对照，其不易位到细胞之外。用另一荧光分 子(TRITC)标记的蛋白向其他细胞的移动在(e)和(h)中示出。

图6示出CmPP16在伴细胞中合成，并迁移到筛管，与韧皮部杆 菌的位置一致。(左)示出原位杂交的共聚焦显微镜图，其检测对位于 维管束中的蛋白CmPP16(绿)进行编码的RNA；(右)紫色的蛋白免 疫定位。使用针对靶向蛋白CmPP16的多克隆抗体，并用发色碱性磷 酸酶显示，其产生紫色(Xoconostle-Cazares等人,1999)。

图7示出成熟柑橘植株的转化，特别是用根癌农杆菌对茎转化。 最开始(左)，体外培养物在含有编码抗微生物蛋白的基因的细菌下需 氧生长。另外(中间)，除去要转化的树的皮以暴露维管组织。图(右) 示出(1)细胞识别植物信号，其为低分子量的化合物；(2)这些化合 物由细菌通过双组分磷酸接力传递(Phospho-relay)体系而识别；(3) 对存在双元质粒中的T-DNA诱导合成，得到单链T-DNA，其形成蛋白 复合物；(5)将其他毒力基因开启以辅助使(6)T-DNA移动至植物细 胞。在该过程中，一个拷贝的T-DNA稳定插入到植物细胞的基因组中。

图8示出本发明通过根癌农杆菌和发根农杆菌(A.rhizogenes)对 墨西哥青柠檬成熟植株的成熟细胞进行转化的步骤。在温室中(左上)， 去除要感染的树皮(右上)，并用含有根癌农杆菌或发根农杆菌的溶液 润湿拭子。接下来(中间靠左)，将拭子放置在茎上，其(中间靠右) 用柔性塑料包裹并用胶带确保。将植株(左下)转移到塑料袋中以保 持较高的相对湿度，这有利于它们的基因转化。在转化后(右下)，评 测植株的光合成能力，以作为其维管束是可渗透的标示。

图9示出根据本发明接种的植株中愈伤组织(calluses)形式的小 的突出光合成区域的发育(左)。在右板块中，描绘出瘤块以在视觉上 对其定位。

图10示出估算根据本发明处理的植株的光合成。将光合成测量为 500微摩尔光强度。光合成值与固定的CO₂微摩尔数/cm^-1×seg^-1对应。 对照对应于用水接种的五个感染植株的平均值。GUS条对应于用GUS 基因(其编码β-葡糖醛酸酶)感染的转化植株。DEF条对应于编码与 CsPP16融合的防御素的基因的转化，LIS条，溶菌酶-CsPP16，以及 LYD-CsPP16(两种抗菌剂的组合)。将健康的青柠檬植株用作对照。 如图所示，在治疗后，用抗微生物剂感染转化的感染青柠檬植株增加 其光合成能力。

图11示出根据本发明治疗的植株中的嫩芽的数量。图表明在治疗 植株中的嫩芽的大小，其中具有较大嫩芽的植株是接受本发明抗微生 物剂治疗的那些。治疗为：GUS(表达没有抗微生物能力的报告蛋白 的植株)；DEF/LIS(表达与CsPP16融合的人防御素以及与CsPP16融 合的溶菌酶的植株；两个基因均从CaMV35S启动子表达且侧翼是 T-DNA的左右边界)。

图12.上部表格示出在指定治疗后植株中嫩芽的大小。底部表格示 出嫩芽的平均长度。具有较大嫩芽的植株是接受根据本发明的抗微生 物剂治疗的那些。(左下)示出在用抗微生物剂治疗的植株中没有症状 的新芽的外观。治疗为：GUS(表达没有抗微生物能力的报告蛋白的 植株)；DEF/LIS(表达与CsPP16融合的人防御素以及与CsPP16融合 的溶菌酶的植株；两个基因均从CaMV35S启动子表达且侧翼是 T-DNA的左右边界)。

图13.示出在100天治疗后治疗植株的外观。

图14.示出在用根据本发明的抗微生物剂治疗前后的植株的叶区 的比较。

图15.示出根据本发明通过基因转化产生的植株的茎中的抗微生 物剂的小瘤块高产株(hyperproducer)的发育。

图16.示出根据本发明用抗微生物剂治疗的植株中第60天的韧皮 部杆菌的定量。数据是通过实时PCR计算的任意单位。

图17.示出(A)通过定量PCR检测在感染有HLB的成体植株中 的韧皮部杆菌。通过实时PCR来测量细菌负荷；数据通过COX柑橘 内生基因而归一化。将最高值分配给1的任意值(无处理植株)。黄色 星号示出在健康植株中获得的值。红色星号示出最开始患病的植株的 细菌负荷降低，与健康植株可比较。(B)在治疗第210天的评测简化 图，其中多于三分之一的植株为健康的，而剩余的三分之二减少99％ 的细菌量。

图18.示出墨西哥青柠檬种子的体外培养。我们可以观察在黑暗中 于室温孵育第1天(左)、第3周(中间)以及在光下于室温孵育第5 周(右)。

图19.示出根据本发明用发根农杆菌和根癌农杆菌转化的外植体 的再生过程。我们可以观察在共培养培养基中的外植体(左上)、在黑 暗条件下30天的再生培养基(SRM)上的外植体(右上)以及在光- 暗条件下60天的再生培养基(SRM)上的外植体(底部)。

图20.示出在不同模式中产生移植体后移植体(左)在15天(中 间)和60天(右)的发育和再生。

图21.示出从HLB患病植株获得并接受使用根据本发明的防御素 抗微生物剂的处理的青柠檬。我们可以观察到(A)表达防御素的青柠 檬的外观(注意，它们的重量，101和84g，与平均90g重量的市售 青柠檬的重量相比较)；(B)健康青柠檬(左)；具有不规则区段和更 小果实的感染青柠檬(中间)以及表达CsPP16-防御素的青柠檬(右)， 其中中果皮的对称性与健康果实相当。

图22.示出转化有CsPP16-溶菌酶、CsPP16-防御素、及其组合的 120个健康植株的检测外观。其在HLB发病区墨西哥科利马州特科曼 市用防蚜虫网覆盖的微型隧道中进行(上)。两个左边区块包含160个 用抗微生物剂处理并暴露于感染韧皮部杆菌的蚜虫的植株，抗微生物 剂为CsPP16-防御素、CsPP16-indolisin、CsPP16-爪蟾抗菌肽、CsPP16- 天蚕素、CsPP16-麻蝇毒素、CsPP16-溶菌酶及其成对组合。示出(下) 穴的内部。

图23.示出在暴露于感染木虱后第60天在表达CsPP16-防御素、 CsPP16-溶菌酶以及两者的年幼墨西哥青柠檬树木中的细菌韧皮部杆 菌的定量。根据本发明的抗微生物剂治疗(左)示出较低量的细菌， 并与阴性对照进行比较。相对而言，不具有抗微生物剂的对照植株(右) 示出大体而言较高量的细菌。在防御素治疗中，我们仅在一个植株中 检测到较低水平的细菌，而在使用溶菌酶的治疗中，我们检测到两个 植株有细菌，也在较低水平。在组合中，我们可以看到，在两个植株 中检测到韧皮部杆菌。这些植株与较低的抗微生物水平相关。

图24.示出根据本发明的具有抗微生物活性的蛋白表达单元，其能 够在韧皮部中表达所述蛋白。我们可以看到(上)含有AT5G59880启 动子的表达单元以及(下)含有CaMV35S启动子的表达单元。

图25.示出与HLB疾病相关的CLa细菌的减少，这通过实时 EMA-PCR检测。

图26.示出使用从根据本发明治疗的植株果实得到的青柠檬果汁 在BALB/c小鼠中进行的急性毒理性分析。

图27.示出在3个月的本发明抗微生物剂治疗限制下的成体墨西哥 青柠檬树的外观。

图28.示出在12个月(墨西哥青柠檬)和6个月(波斯青柠檬、 橙、葡萄柚和橘)治疗后在微型隧道(microtunnel)中生长的植株外观。

图29.示出在生物污染下生长的植株外观。

图30.示出根据本发明治疗的青柠檬植株。

图31.示出在根据本发明治疗的感染植株中嫩芽和成熟叶在3个月 治疗时的细菌含量(左)以及用防御素(治疗1)、溶菌酶(治疗2) 和防御素与溶菌酶的混合物(治疗3)治疗的植株的最初和最终光合成 (右)。

图32.示出根据本发明治疗的(A)橙、(B)葡萄柚、(C)波斯青 柠檬和(D)橘植株的叶面积。我们可以看到，在成熟(各组的左边条 状物)和年幼植株(各组的右边条)中的叶面积。

图33.示出从经防御素、溶菌酶及其混合物治疗的树木果实以及对 照树木的青柠檬获得的青柠檬果汁得到的饮食学(bromatological)参 数。

图34.示出在遗传修饰青柠檬的维管组织中的防御素免疫检测。我 们可以观察到(X)木质部、(C)形成层和(F)韧皮部(伴细胞和筛 管)。

图35.示出端点PCR检测，其检测用转化有上述构建体的根癌农 杆菌治疗的植株中表达抗微生物剂的基因。我们可以观察到402bp的 片段，其与编码人溶菌酶的基因对应。

图36.示出(A)来自用防御素(RR09)治疗的植株和未处理的对 照植株的花粉外观；(B)未处理(左边条)和用抗微生物剂处理(溶 菌酶)(右边条)的花粉的平均面积。

具体实施方式

本发明涉及有效治疗由侵入植物韧皮部的病原体微生物引起的疾 病的方法，特别是用于产生耐受于由造成HLB疾病的韧皮部杆菌 (Ca.L.)的分化枝所引起的细菌感染的转基因植物包括柑橘的方法； 这些细菌以受限制的方式位于韧皮部中；因而，使用抗生素的方法未 得到成功。

在本发明之前，还未通过基因工程方法实现该疾病的解决方案， 在该方法中所产生的植株将获得稳定存在并表达的遗传构建体。

人们认为对于韧皮部杆菌属相关疾病的长期治理的最有效方法依 赖于宿主植株中抗性的获得，由此本发明是基于使用基因工程使植株 获得抗性。因此，本发明包括基因转化的方法，其对于柑橘种是足够 的，并且涉及赋予防御机制以消除或对抗由侵入植株韧皮部的至少一 种病原体微生物引起的感染；例如，包含韧皮部杆菌、柑桔黄龙病亚 洲种病原菌、柑桔黄龙病非洲种病原菌和/或柑桔黄龙病美洲种病原菌 的细菌，由此控制与这些感染有关的疾病，例如HLB和斑马片(ZC)。 本发明方法的成功基于使用被植株采用从而使具有抗微生物活性的分 子经由维管组织移位的机制。

本发明基于例如以下事实，即，韧皮部杆菌的细胞壁由肽聚糖构 成，所以我们假设细菌容易被酶例如溶菌酶破坏。同时，本发明涉及 通过利用韧皮部杆菌需要定殖在植株韧皮部中来控制感染的策略。

本发明的方法包括实现编码融合蛋白的嵌合基因的表达，该融合 蛋白具有双功能：作用为植株维管组织内的转运子、以及表现抗微生 物活性；例如，破坏侵入植株韧皮部的病原体细菌例如韧皮部杆菌的 细胞壁。在本发明的研究中，我们实施了转化方案，使用该方案，可 以获得合理的转化效率以及本文提出的嵌合转基因的成功稳定整合 (如通过以下示出的实验数据所证实的)，其还示出本发明方法针对 HLB感染的保护也正是归因于该转基因的转送、表达和功能性。

我们的研究团队已经详细表征了结合RNA而不依赖于其序列的蛋 白；我们称其为CmPP16，其中该蛋白不仅在体外结合于不同RNA， 而且能够将它们经由胞间连丝从一个细胞转运到另一个细胞 (Xoconostle-Cazares等人,1999)。因而，尽管CmPP16在功能上与 RNA病毒的移动蛋白相似，如其已经表明的，但其在健康植株中的作 用是未知的。该开创性的工作表明健康植株中使蛋白和核酸移位的内 生系统的存在，该系统是被病毒利用用于系统性移动的系统。蛋白 CmPP16的同源物已经在不同植物种中找到，但是其保守性不是很高。 我们的研究还表明，与较大蛋白融合的CmPP16不丧失其经由胞间连 丝而细胞间转运的能力。图5中所示的结果为蛋白CmPP16的移动能 力的证据，其中共聚焦显微镜的图像示出，当将CmPP16蛋白微注射 到本氏烟叶子的叶肉细胞中时，可以在细胞间移动；并且当CmPP16 与RNA复合时，其还介导RNA移动到相邻细胞。图6示出CmPP16 在韧皮部中的定位。

关于通过韧皮部循环流通且在感染过程中几乎不离开韧皮部的病 原体，由这些病原体造成的疾病的治疗方面的局限性在于，化学制剂 (例如，抗生素)无法到达在病原体所在的筛管分子。基于该先例， 对于本发明的开发，我们考虑将蛋白CsPP16作用为将蛋白转运到通常 无法到达的筛管分子中的载体。因而，我们建议，与CsPP16融合的具 有抗微生物活性的蛋白可以到达韧皮部，特别是筛管分子，其中肽发 挥其抗微生物和/或抗菌活性。对于本发明策略方法中的成功，必须设 计出本文所述的融合蛋白CsPP16肽的表达载体并执行转化策略。

本发明提出使用这样的基因，其编码与具有抗微生物活性(例如， 具有抗菌活性)的蛋白(在该情况中，例如人溶菌酶)融合的蛋白 CsPP16。这些融合蛋白的表达由韧皮部特异性启动子(例如我们之前 表征的)引导。上述启动子调节保持韧皮部的高传导性所需的蛋白例 如肌动蛋白-解聚因子3(ADF3)的表达，尽管其他实现相同效果的因 子可以用在本发明中。

基于参考文献，我们选择在其他系统中具有抗微生物活性的蛋白， 选择在植株中具有抗微生物活性的那些。值得注意的是，我们使用人 溶菌酶和人防御素来防止重组在人体内产生免疫问题，因为柑橘果实 意在用于人类消费。

根据本发明，从GenBank数据库(NCBI)获得抗生素蛋白序列， 并将氨基酸序列使用柑橘中更加通用的密码子转化为碱基序列。改变 密码子使用所需的信息在表3中。

为提供能够执行本发明的必要因素，数据库 http://www.kazusa.or.jp/codon/中可得的用于柑橘的常用密码子的列表 呈现如下。

对于用在本发明中的构建体的设计，在获得合成基因的序列后，添 加调节序列，例如花椰菜花叶病毒的启动子35S和NOS终止子。然而， 以相同方式作用的其他调节性序列可以用于本发明的目的。

表3.橙(Citrussinensis)x橘(Citrusreticulata)中常用密码子的使用

注意：当编码GC43.22％时，第一个字母GC51.98％，第二个字母GC34.75％，第 三个字母GC42.94％

所有本文所述的遗传构建体包含作为启动子1的花椰菜花叶病毒 CaMV355的d35S启动子和作为终止子序列的NOS序列。此外，另一 套构建体包含拟南芥的韧皮部特异性表达启动子59880，以用于进行上 述抗微生物肽的表达，由此使得仅在发现例如植物致病有机体的维管 组织中表达。所有本文所述构建体在其端部包含农杆菌T-DNA的左右 边界，且没有选择标记物。

本发明的主要目的是提供获得基因修饰的植物或转基因植物的方 法，上述植物表达融合蛋白，通过该融合蛋白，它们获得针对感染植 株韧皮部并产生疾病的微生物(例如造成HLB的细菌)的感染的抗性。 本发明的方法之一包括以下步骤：

1)将与抗菌分子融合的CsPP16蛋白的DNA表达载体结合至农杆 菌菌株，

2)对易感于引起疾病的微生物因子(例如造成HLB或由感染植 株韧皮部的微生物引起的疾病的细菌因子)所引起的感染的植物接种 上述具有表达载体的农杆菌菌株，

3)核实载体的获得及其表达、其在转化植株及其后代中的稳定性， 并核实所获得的抗性。

在一个实施方式中，上述方法在步骤2)中包括使用本文所述载体， 对先前感染的植株接种抗微生物剂。

根据本发明，提供表达载体的构建，其应当基本具有与编码抗微 生物蛋白的基因相连接的编码CsPP16的基因，上述抗微生物蛋白具有 用于除去感染植株韧皮部的微生物的特异性，上述微生物例如为位于 植株韧皮部中的细菌，具体地，细菌为例如韧皮部杆菌、柑桔黄龙病 亚洲种病原菌、柑桔黄龙病非洲种病原菌和/或柑桔黄龙病美洲种病原 菌，其在柑橘种中造成HLB感染。在本发明的实施方式中，还有那些 促进融合蛋白表达的表达载体，融合蛋白选自具有抗微生物活性的 CsPP16-肽、CsPP16-骨髓抗微生物肽、CsPP16-溶菌酶、CsPP16-β-防御 素-1、CsPP16-鲎肽-1、CsPP16-鲎肽素、CsPP16-Protegrin-1、CsPP16- 爪蟾抗菌肽、CsPP16-indolicidin、CsPP16-天蚕素、CsPP16-麻蝇毒素 IA、CsPP16-红蝽素(CsPP16-pyrrocorycin)、和CsPP16-防御素及其混 合物。

本发明的另一个实施方式是产生对土豆中因Candidatus Liberibactersolanacearum而发生的“斑马片”(ZC)病症的抗性的可 能性。

同时，本发明的其他实施方式是在图24中示出的表达载体的构建； 它们的特征在于具有以下序列：

CsPP16-溶菌酶表达单元，包含根癌农杆菌的T-DNA左边界(SEQ. ID.No.1)、花椰菜花叶病毒的启动子35S的短形式(SEQ.ID.No.2)、 编码柑橘属中直系同源的来檬的韧皮部16K蛋白或CsPP16蛋白的基 因(SEQ.ID.No.3)、柔性多聚连接头(SEQ.ID.No.4)、具有柑橘中密 码子使用的人溶菌酶(SEQ.ID.No.5)以及NOS终止子和根癌农杆菌 的T-DNA右边界(SEQ.ID.No.6)。

CsPP16-防御素表达单元，包含根癌农杆菌的T-DNA左边界(SEQ. ID.No.1)、花椰菜花叶病毒的较大启动子35S(SEQ.ID.No.7)、编码 柑橘属中直系同源的来檬的韧皮部16K蛋白或CsPP16蛋白的基因 (SEQ.ID.No.3)、柔性多聚连接头(SEQ.ID.No.4)、具有柑橘中密码 子使用的人防御素(SEQ.ID.No.8)以及NOS终止子和根癌农杆菌的 T-DNA右边界(SEQ.ID.No.6)。

同时，出于本发明的目的，还包括以下表达单元：

CsPP16-爪蟾抗菌肽表达单元，包含所有表明用于CsPP16-防御素 表达单元的元件，除具有柑橘中密码子使用的人防御素(SEQ.ID. No.8)用具有柑橘中密码子使用的爪蟾抗菌肽(SEQ.ID.No.9)替代 外。

CsPP16-天蚕素表达单元，包含所有表明用于CsPP16-防御素表达 单元的元件，除具有柑橘中密码子使用的人防御素(SEQ.ID.No.8) 用具有柑橘中密码子使用的天蚕素(SEQ.ID.No.10)替代外。

CsPP16-麻蝇毒素表达单元，包含所有表明用于CsPP16-防御素表 达单元的元件，除具有柑橘中密码子使用的人防御素(SEQ.ID.No.8) 用具有柑橘中密码子使用的麻蝇毒素(SEQ.ID.No.11)替代外。

CsPP16-Indolicidin表达单元，包含所有表明用于CsPP16-防御素 表达单元的元件，除具有柑橘中密码子使用的人防御素(SEQ.ID. No.8)用具有柑橘中密码子使用的Indolicidin(SEQ.ID.No.12)替代 外。

在本发明的一个实施方式中，在本发明上述的表达单元CsPP16- 溶菌酶、CsPP16-防御素、CsPP16-爪蟾抗菌肽、CsPP16-天蚕素、CsPP16- 麻蝇毒素和CsPP16-Indolicidin中存在的花椰菜花叶病毒的较短启动子 35S(SEQ.ID.No.2)或较大启动子(SEQ.ID.No.7)可以用维管启动 子AT5G59880(SEQ.ID.No.13)来替代。

上述的表达单元在之后由GenScriptUSAInc.合成，测序以核实没 有突变在组装过程中插入，并将其克隆到具有β-内酰胺抗生素抗性的 载体中。所得的质粒通过电穿孔转化到根癌农杆菌和发根农杆菌中， 用终浓度为100μ/ml的抗生素羧苄青霉素来选择转化细菌。

用上述构建体转化的第一个方法包括，例如基因转化柑橘茎和芽， 将其在体外再生以获得遗传修饰的幼苗，并接枝到砧木或模式物中， 例如酸橙以及volkameria属或macrophylla种。模式物可以来自1cm 的幼苗、来自酸橙种子的萌发，或者模式物是年幼柑橘植株，对其从 侧面接枝遗传修饰的花以用于其生长。

用上述构建体转化的第二种方法包括促进产生健康或因产生HLB 的细菌而患病的成体植株的较小遗传修饰区域。这涉及使位于消耗组 织和生产组织(光合成)之间的茎或枝的维管组织暴露。这通过刮擦 来进行，直至找到绿色光合成组织，并在其中放置用经过乙酰丁香酮 预处理并在具有植物生长诱导剂(植物生长素和细胞分裂素)的缓冲 液中稀释的农杆菌溶液缓冲液润湿的拭子。将处理后的植株或枝放置 在袋中以保持高湿度，使根癌农杆菌干透3天，在该指定处理后移除 敷料。将植株暴露于两天的处理，最高为一个月期间，在所有情况中 均得到抗微生物剂在维管组织中的表达并在消耗组织中积聚，消耗组 织为细菌感染的位点。

根据本发明，在对患病植株转化后，监测造成疾病的有机体的存 在；例如，造成HLB的细菌，其通过由于单独或组合施用的抗微生物 表达的治疗而减少。用本发明治疗的患病植株恢复其光合成，表明维 管组织不再阻塞，且植株能够开花并进行合适的结果。同时，用防御 素治疗的植株开花；图21A示出获得的两个青柠檬，101和84g，将 其在横轴上切开，示出对称的中果皮。与包含不对称中果皮(区域) 的受感染的那些相比，健康果实中的外观正常(图21B)。

通过本发明对高1.20m的患病植株进行转化并对其评测长达210 天，结果示出HLB症状的实质性减少以及植株正常生理状态的恢复(生 长、芽的生成、增加光合成、开花和结果)(图17)。

而且，具有由埃米利亚诺-萨帕塔生态园认证的卫生证明的1.20m 年幼树木的遗传转化，在墨西哥科利马州特科曼市在生物安全条件下 暴露于在田地中感染有韧皮部杆菌的木虱(图22)，与用携带质粒但不 具有编码上述抗微生物剂的基因的农杆菌转化的对照树木相比，没有 获得或获得较低量的细菌。所述的树木暴露于感染有韧皮部杆菌的木 虱，并在60天后评测细菌的存在。该评测包括收集两个成熟光合成树 叶和两个称为芽的嫩叶。分离中央叶脉的总DNA，并使用荧光探针， 通过韧皮部杆菌16S基因的实时PCR而测算细菌的数量。将获得的值 用COX青柠檬的内生基因进行归一化(图23)。结果示出，在用溶菌 酶、防御素以及两者组合(Lys和Def)的处理中，与不表达抗微生物 剂的对照植物相比，细菌的数量减少或检测不到。

此外，根据本发明的包括外植体转化以及经由组织培养进行再生 的第二种方法显示出，植物能够再生并且有活力。在这些实验中，通 过表达上述抗微生物剂来获得有活力的接枝植物，其中将十个独立的 转化体选择用于在生物安全条件下的进一步田间测试。

以下，我们描述作为实例的所使用的两个包含合成融合序列的构 建体，以及获得耐受HLB的基因转化植株的步骤的实例。我们还包括 使用实施例来确定作为转移所设计的融合基因的载体的构建体性能的 描述。

纳入以下实施例仅是出于示例说明本发明的目的，而不意味着对 其范围的限制。因而，步骤和材料可以具有本领域技术人员可检测的 变型，其在本发明的范围和精神内。

实施例1.获得包含花椰菜花叶病毒的35S启动子的CsPP16表达单元

为获得具有表4列出的序列的表达单元，将它们合成并以所列的 顺序进行组装；对它们进行测序来核实在组装过程中没有插入突变， 并最终克隆到包含羧苄青霉素抗生素耐性的Genscript载体中。

将所得的重组质粒转化到根癌农杆菌和发根农杆菌的感受态细胞 中。我们使用羧苄青霉素抗生素，其是青霉素的合成形式且更加稳定。 从抗性细菌中提取质粒DNA，并在琼脂糖凝胶上核实重组质粒的存在。

为核实插入到载体中或由此转化的植株中的具有抗微生物活性的 目标基因是否存在，使用特定的寡核苷酸引物用于PCR扩增；例如， 在溶菌酶的情况中，正向寡核苷酸 3’-AGGTTTTTCGAAAGATGCGAACTTGCTAGAA-5′(SEQ.ID.No. 14)，以及反向3′-AAACACCGCAACCTTGAACATATTGTCTGC-5′ (SEQ.ID.No.15)；以及在防御素的情况下，正向寡核苷酸3’- ATGAGAGTTCTTTATCTTCTTTTCAGCTTC-5′(SEQ.ID.No.16)，以 及反向3′-ACTTCTTCTTGCAGCATCTTGTACCTGGAA-5′(SEQ.ID. No.17)。

实施例2.获得包含维管启动子AT5G59880的CsPP16表达单元

为获得该表达单元，用维管启动子AT5G59880(SEQ.ID.No.13) 取代表4的表达单元中示出的花椰菜花叶病毒的启动子35S的较短形 式(SEQ.ID.No.2)或较长形式(SEQ.ID.No.7)。如在实施例1中那 样，以所列的顺序来合成序列并进行组装，对它们进行测序来核实在 组装过程中没有插入突变，并最终克隆到包含羧苄青霉素抗生素抗性 的Genscript载体中。

如在实施例1中，将所得的重组质粒转化到根癌农杆菌和发根农 杆菌的感受态细胞中。我们使用羧苄青霉素抗生素，其是青霉素的合 成形式且更加稳定。从抗性细菌中提取质粒DNA，并在琼脂糖凝胶上 核实重组质粒的存在。

表4

表4(续)

为核实插入到载体中或由此转化的植株中的具有抗微生物活性的 目标基因是否存在，使用特定的寡核苷酸引物用于PCR扩增；例如， 在溶菌酶的情况中，正向寡核苷酸 3’-AGGTTTTTCGAAAGATGCGAACTTGCTAGAA-5′(SEQ.ID.No. 14)，以及反向3′-AAACACCGCAACCTTGAACATATTGTCTGC-5′ (SEQ.ID.No.15)；以及在防御素的情况下，正向寡核苷酸3’- ATGAGAGTTCTTTATCTTCTTTTCAGCTTC-5′(SEQ.ID.No.16)，以 及反向3′-ACTTCTTCTTGCAGCATCTTGTACCTGGAA-5′(SEQ.ID. No.17)。

实施例3.使用农杆菌，使本发明的构建体在感染HLB的墨西哥青柠檬 植株中短暂表达

农杆菌在恒定搅拌下于30℃在LB培养基中生长，以达到0.4的 O.D.(600nm)。向细胞加入终浓度为140微摩尔的乙酰丁香酮，在诱 导剂下再孵育两个小时。通过离心收获细菌并再悬浮在转化培养基中 (图7)。

接种成体植株的方法包括用砂纸移除木质化树皮，露出绿色光合 成组织。将具有重组细菌的预先润湿的拭子放置在组织上，并在转化 培养基中重悬，其中重组细菌含有一些实施例1和/2所述的表达载体。 将拭子暂时固定在未盖有塑料的光合成组织周围，并将植株盖上塑料 袋并在高湿度下保持两天。在孵育下，移去袋子和拭子。对植株持续 浇水以保持有利于T-DNA转移到治疗区域的充足水含量。

在检测中使用接枝到墨西哥青柠檬和/或波斯青柠檬的沃尔卡默青 柠檬(volkamerianlime)接穗(patron)而产生的柑橘材料。植株显示 出与HLB相关的症状，且其韧皮部杆菌的细菌负荷通过实时PCR进 行确认。所进行的实验设计显示在表5中。

表5.用于转化成熟青柠檬树木的实验设计

植株的光合成能力使用IRGA系统在恒定光照下测量，每个植株 进行十次测量。

通过用手术刀刮掉木质梗组织来接种植株，其中将包含细菌溶液 的拭子放置在暴露区域。用塑料覆盖拭子，且用较大的塑料袋覆盖整 个植株来保持高湿度并有利于转化组织的生成(图8)。仅用水来冲洗 植株以避免遮蔽HLB的症状。在接种60和120天进行植株分析。

在接种后60天进行植株的分析。我们分析溶菌酶、防御素及其组 合的表达效果，加上健康对照、患病对照和由使用GUS报告基因(基 因转化事件的指示物)构成的对照。

用这些处理接种植株意味着含有目标基因的T-DNA整合到暴露组 织中。通常而言，无致病性的农杆菌种在施用区域中生成小瘤块，为 转化的证据。对所处理的植株针对转化组织的存在进行分析，发现如 图9所示的小瘤块区域。

实施例4.测量根据本发明治疗的植株的光合成和叶面积

进行各个植株的测量，用Excel软件记录并进行平均化；其中为 μmol单位CO₂/cm².s^-1。图10示出所获得值的图。患病植株的CO₂固 定值低于治疗的那些。注意到，在用GUS处理的患病植株中获得的值 显示出明显的非自养。用本发明的包含抗微生物肽的构建体处理的植 株具有更高的光合成能力，其可以促成接种后两个月植株的生理状态 的改善。在那时(60天)，在防御素处理后所得的光合成低于用溶菌酶 获得的光合成。然而，在第210天，两种处理均显示出与健康植株相 似的光合成值。

同时，对在这些植株中的新芽数量及其大小进行定量。如图11所 示，GUS对照植株(不用抗微生物剂处理的患病植株)显示出较少的 新芽，使用CsPP16-防御素和防御素/溶菌酶的处理显示出更多的数量。 处理包括应用转化有含CsPP16-防御素的载体的细菌，CsPP16-溶菌酶 进行的第二处理，以及用含有CsPP16-防御素和CsPP16-溶菌酶的细菌 混合物进行的第三处理。我们一致地观察到，使用防御素的处理产生 更多数量的嫩芽，可能是因为该基因更快速地作用于韧皮部杆菌的控 制。在210天后，处理中的嫩芽数量在统计上近似。同时，图12在图 中示出嫩芽的大小；其中使用CsPP16-防御素和CsPP16-溶菌酶的处理 显示出更大的尺寸。如上所述，随着处理时间的进展，第60天不再观 察到差异。注意到，在该期间，植株不再施肥展现HLB症状，其在植 株遭受营养胁迫时更加明显。图12示出用本发明处理溶菌酶/防御素获 得的嫩芽的外观；新芽没有症状，具有与健康植株相似的叶面积。

在接种的第60天，与先前萌出的嫩芽相比，新芽不再显示出与 HLB相关的症状，在先前萌出的嫩芽中，尽管进行了接种，HLB相关 的症状仍存在。这对我们表明，可能是由于韧皮部中胼胝质的过量积 聚引起的，蛋白的自由移动由于该物质而阻塞，阻碍它们到达那些组 织。这与早些时候示出的光合成分析一致，在那些组织中，非自养是 明显的。不呈现出任何可见的疾病症状的新芽使我们得出以下结论， 其是由本发明的抗微生物剂的处理引起的；图13示出根据本发明处理 的植株在处理100天后的外观。其还示出对照植株与用抗微生物剂处 理的那些的比较，其中观察到在处理植株中嫩芽症状的明显改善。

在各个处理的新芽中，在60天处理之前和之后进行叶面积的测量， 分析各个植株的10个叶子。将各个植株的叶面积平均化并通过图14 所示的图进行分析，其中我们可以观察到，用抗微生物剂处理的植株 有着与健康植株的叶面积相似的叶面积增加，这与在我们所观察的叶 面积减少的对照植株中发生的情况相反，其可能是由疾病进展引起的。 同时，在接种农杆菌的植株中，我们在茎中观察到接种区域的小瘤块 的发育，其表明抗微生物剂的高度生产者区域的存在，如图15所示。

实施例5.测量转化植株中抗微生物剂的含量

我们获得由先前存在的叶和新叶构成的植株样本。根据由Servicio NacionaldeSanidad，InocuidadyCalidadAgroalimentariaofSAGARPA, México建立的测试程序来处理植株。

简单来说，使用一次性剃刀将叶的中脉切开并切割成小块。对组 织称重(100mg)并以两种方式处理，一个使用市售纯化试剂盒获得 总DNA，另一个用单叠氮乙啡啶(Monoethidiumazide，MEA)处理 并接着进行DNA纯化，以辨别用作模板的DNA是否存在于活的或死 的细菌中。

图16示出分析结果。可以看出，活的细菌数量在治疗中减少，尽 管没有完全破坏。应当注意到，该暂时表达检测在使用抗微生物剂的 植株的离散区域中表现，且所产生的量无法控制。图形示出作为总细 菌检测的标示的条状物的总大小，蓝色为死细菌的数量，而红色显示 活细菌的数量。通常而言，治疗具有最多为患病对照植株中六分之一 的负荷。考虑到这些植株是抗微生物剂的嫁接杂种产生者(chimera producer)，该结果已经非常有前景；通过使用基因转化来获得植株的 方法，对于完全转化的植株，在所有组织中，有可能实现接近100％的 疾病耐受性。

图17中的图表示出在处理60天之后活的/死的细菌负荷的相关性， 其中我们可以观察到，在用抗微生物剂处理的植株中，活细菌的数量 比对照植株低4倍，对照植株中死的和活的细菌的数量均远超出经处 理的植株。

实施例6.在感染有HLB的墨西哥青柠檬植株中的稳定表达测试

溶菌酶在墨西哥青柠檬中的稳定表达通过转化青柠檬外植体并使 其再生来完成；将它们接枝到青柠檬模式物中，这使得可以获得在短 时间内表达目标蛋白的成熟转基因植物。

墨西哥青柠檬种子的体外萌发在含有无菌萌发培养基的检测管中 进行，如图18所示。在培养基的组成中包含矿物元素、水、激素、有 机物、维生素和蔗糖，这促使青柠檬种子萌发。种子在先前用30％氯 溶液灭菌半小时，接着用无菌水清洗三次。在无菌条件下进行种子的 播种。一旦种植，种子在黑暗中于室温孵育约2～3周。在这之后，观 察子叶的嫩芽，并再次在光周期下(16小时光照和8小时黑暗)于室 温孵育1周；这使得可以活化植株的光合成活性。

之后，将如此获得植株用于获得外植体，其通过含有CsPP16-溶菌 酶构建体的根癌农杆菌和发根农杆菌转化。

对于用根癌农杆菌和发根农杆菌转化青柠檬外植体，首先将这些 细菌在LB培养基中在搅拌下于30℃生长，达到0.4的O.D.(600nm)。 对细胞添加乙酰丁香酮至终浓度为140微摩尔并与诱导剂孵育另外两 小时。通过离心来收获细菌，并在转化培养基中重悬。在无菌条件下 用预先浸在转化培养基中的刀，将体外萌发的青柠檬的茎切割成约1 cm长度。通过使用无菌吸水纸除去切割的外植体上多余的液体。将外 植体转移到共培养培养基(CM)，它们在该培养基中在黑暗中于室温 孵育1～2天。在此之后，将外植体再转移到再生培养基(SRM)中并 在黑暗中于室温孵育4周。接下来，将外植体在光周期(光照16小时 和黑暗8小时)下于室温孵育另外4～6周，直至完全再生。将外植体 每4周或在污染的情况下更换至新鲜SRM中。图7、8和19示出墨西 哥青柠檬外植体的转化和再生过程。

对于转化外植体在墨西哥青柠檬的不同模式物中的增殖，将它们 接枝到沃尔卡默青柠檬、citrangetroyer或roughSchaub的模式物中。

对上述模式物中的接枝在距离模式物底部15cm的地方以“V”形 切割，并小心地在切割处放入整个转化外植体。用石蜡膜包封接枝物。 仅用水对植株浇水，并用塑料袋覆盖接枝物来保持高相对湿度并使得 可以再生。在接枝移植60天后，通过终点PCR和qRT-PCR使用寡核 苷酸例如在实施例1和2中所述的那些来分析溶菌酶表达。

用于墨西哥青柠檬转化的培养基的组成为：LB培养基(950mL 蒸馏水；10g蛋白胨；5g酵母提取物；10gNaCl，用1N的NaOH调 节至pH7(该溶液用去离子水调节为1升终体积并进行灭菌)；用于萌 发青柠檬种子的培养基(1升MS培养基，其中溶解有30g蔗糖和2g 的Rite凝胶)；MC共培养培养基(1升MS培养基，其中溶解有2mg 吲哚-3-乙酸、1mg2-异戊基-腺嘌呤、2mg1,4-二氯苯氧基乙酸、和8g 琼脂；用1N的NaOH调节至pH5.2并灭菌)；SRM再生培养基(1 升MS培养基，其中溶解有3mg6-苄基氨基嘌呤和10g琼脂；用1N 的NaOH调节至pH5.2并灭菌；一旦培养基温热，加入250mg/L的万 古霉素和500mg/L头孢噻肟抗生素)。

实施例7.通过接枝的抗微生物剂传输

波斯青柠檬和墨西哥青柠檬柑橘的基因转化在沃尔卡默檬(C. volkameriana)和阿利莫莱(C.macrophylla)酸桔的砧木模式物上进行。 在这些检定中，进行包含防御素、溶菌酶及其混合物的抗微生物砧木 的转化，其中防御素、溶菌酶及其混合物各自在翻译水平上与蛋白 CsPP16(其为柑橘16KDa系统蛋白的蛋白)融合。通过将茎组织暴露 于磨料而进行转化，接着将组织与包含上述基因构建体的根癌农杆菌 或发根农杆菌的溶液接触(图8)。将所用的植株接枝到HLB感染嫩芽 中，该嫩芽呈现出疾病的特征症状。

对植株进行以下的分析：接枝物中的蛋白存在及其农业特征例如 植株高度、光合成、液面积以及细菌定量。

对之前处理的植株监测一年，发现相对于初始计数而言，产生出 细菌量减少的新芽和果实。监测原有和新长的叶；发现在原有叶而不 是新芽中具有最高浓度。应当注意，弥散性斑块症状没有从成熟叶上 消失。该事实被解读为，由斑块症状产生的叶淀粉聚合物无法移动。 图25示出HLB患病植株在分析中一年的表现，这些植株在沃尔卡默 檬和阿利莫莱的砧木以及接枝物的枝上转化所述的构建体。

收集具有症状的叶样本例如无症状系统性叶片，提取其DNA，通 过实时PCR技术对CLa和COX内生基因的存在进行定量。用于监测 所分析组织中的活细菌的方法变型是进行EMAPCR技术。有趣的是， 已经示出，活细菌降低约70％，并局限于老的组织。相对而言，年幼 组织显示出非常低的值或在技术的检测限以下。图25示出对照植株中 存在活细菌的表现，范围为100～87％的CLa细菌。光合成在健康植株 与年幼叶之间是相当的。注意到，植株能够产生具有放射对称的球状 果实，其为具有健康维管组织的植株的特征(图21)。

这些证据使得我们推测，具有超细胞特性的蛋白的基因转化模式 物的使用足以赋予对造成HLB的细菌或其他存在于植株维管组织中的 细菌的耐受性。

由使用本发明抗微生物剂处理的感染植株所产生的果实显示出商 业级别，并用于进行毒性测试。

从根据本发明治疗的植株获得的果实显示出健康果实的特征对称 性(图21)，显示出HLB病青柠檬的截面，其呈现出不对称腔室，而 来自用根据本发明的抗微生物剂治疗的患病植株的果实显示出与健康 植株果实相当的对称性。

实施例8.在小鼠中的急性毒性测试

对每个处理10只BALB-c小鼠以正常饮食饲喂，给予它们具有来 自根据本发明治疗(RR09防御素和RR18溶菌酶)的植株的果实的2％ 果汁的青柠檬水来替代自来水。在实验的开始对小鼠称重。在30天实 验后，对它们进行再次称重，并通过尾静脉穿刺来获得外周血样本。

如图26中所示的，在进行的处理中(溶菌酶和防御素，以及在对 照组中)，没有动物死亡。相似地，在测试的最终，小鼠在处理之间显 示出统计学上相似的重量。

从小鼠收集的血通过血液学生物微测定(hematologicmicro biometry)进行分析。当将从对照组和处理获得的值进行比较时，这些 均在提呈为正常值的范围内(表6)。可以看出，接受处理的小鼠的血 液学生物微测定与对照组中的小鼠相似，得到的值在对于10～14周龄 BALB-c小鼠报告为正常值的范围内。注意到，在急性毒性测试的最后， 在处理和对照动物中均得到100％的成活率。

表6.HLB青柠檬.血液学生物微测定

实施例9.在处理植株的花粉中未检测到转基因

收集根据本发明用抗微生物剂处理的植株的花粉和花，对从处理 植株和对照植株中收集的花粉和花提取总DNA。扩增内生基因，其不 编码抗微生物剂，表明植株产生花粉和野生型花。该实验证据示出， 转基因不会不利地扩散到潜在的受体植株；相似地，转基因将不会存 在果实中，其使得可以获得非遗传修饰的果实，因而例如不用接受当 前墨西哥法律的遗传修饰有机体(GMO)生物安全法的监管。

实施例10.在其他柑橘中的测试

a)接枝到volkamerikana的波斯青柠檬、瓦伦西亚橙、葡萄柚和橘的 基因转化

除在带刺的墨西哥青柠檬中的测试外，我们在波斯青柠檬、瓦伦 西亚橙、葡萄柚和橘(均接枝到阿利莫莱和沃尔卡默檬)中进行了根 据本发明的抗微生物剂的表达诱导(表7)。对各个品种测试100个植 株，其中25个用溶菌酶处理，25个用防御素处理，且25个用其混合 物处理。剩余的25个用作实验对照，并用水接种。

表7

对于墨西哥青柠檬，对具有1.5m平均大小的来自墨西哥塔毛利帕 斯州VivariumFranciscoVilla安全认证的一年龄树木进行接种，如上所 述。植株在高湿度箱中3天，之后移植到准备有防蚜虫网的微型隧道 中。

移去网，使得感染有CLa的木虱可以进入，因为生物污染区位于 墨西哥科利马州特科曼市的HLB特有地区。监测感染木虱的存在以及 在提及的栽培品种中的处理感染和对照植株的可能感染。在8个月的 种植后，当使用检测Cla的分子学方法时，在处理植株中没有观察到 症状或细菌的阳性检测，但在对照植株中并不如此，对照植株受到感 染且显示出与存在HLB相关的症状。

结合细菌的定量，监测生长和光合成能力，其中在处理植株和对 照植株之间没有观察到显著的差异。在处理后一年，细菌水平非常低， 或低于所用技术(使用Taqman探针的实时PCR)的检测限。

b)接枝在沃尔卡默檬中的生产性墨西哥青柠檬树木的基因转化

在墨西哥科利马州特科曼市的HLB特有地区选择24株生产性3 年龄树木，对它们进行HLB致病细菌的存在的定量，在具有弥散性斑 点的有症状叶片样本中产生高滴定度。使植株如上所述进行抗微生物 剂表达的诱导处理，分布如表8所示。

表8

在种植三年后的树木具有3m的平均大小。将树木包含在以铝为 框架且具有防蚜虫网的穴道中。通往内部的两个入口限制通行，且温 室具有锁住的门。

通过在其树干中放置具有处理颜色(表8)的丝带和具有树木编号 的铝标牌来标记树木。

如图27所示，在管控下第3个月的墨西哥青柠檬成体树木产生分 枝；其中第一批叶中的一些显示出症状。然而，症状的程度限制在那 个区域。同时，还观察到，在根据本发明处理后4个月，新枝不具有 疾病症状。在处理后第9个月的评估显示出具有新芽和正常开花的对 称树木。新芽具有更少的症状例如弥散性斑点或没有症状。它们的光 合成率较高，表明良好的生理状况。

在根据本发明处理12个月(墨西哥青柠檬)和6个月(波斯青柠 檬、橙、葡萄柚和橘)后，在微型隧道中生长的植株的外观显示出生 长，且出现没有HLB症状的分枝(图28)。

而且，在生物污染下生长的植株，当接受根据本发明的抗微生物 剂处理时，生成没有CLa的嫩芽(图29)。

测量光合成参数显示出，根据本发明处理的植株具有与在没有木 虱情况下生长的植物园植株相似的光合成值。同时，处理的植株生成 花和商业级别的果实(图30)。

用抗微生物剂处理的植株的外观在木虱接触的第5个月是正常的， 它们在原有叶和新芽中不显示HLB症状。相比之下，没有抗微生物剂 处理的对照植株在同一批次中显示出在其叶中存在症状，且平均而言 具有较少分枝。图28(下右区块)显示出未处理植株的症状，呈现出 疾病的特征症状。

图21示出在健康青柠檬的果实(其呈现出具有放射对称的果瓣， 左区块)之间的显著差异，而由患病树木产生的果实显示出果瓣的非 对称发育以及出现两个近端着丝染色体(中间区块)。作为初始患病并 随后根据本发明处理的青柠檬树木的治疗结果，所获得的果实与来自 健康树木(右区块)的那些相似。

而且，估算在第三个月的细菌含量，显示出细菌同时存在于成熟 叶和新芽中。相比之下，尽管在从处理开始时就存在的成熟叶中检测 到细菌，但新叶中的数量显著减少。对于光合成，未处理的对照植株 显示出与所测试的三个处理(处理1：防御素，处理2：溶菌酶，以及 处理3：防御素和溶菌酶的混合物)相比更低的光合成(图31)。

关于波斯青柠檬、橘、葡萄柚和橙树，对植株评测其农业参数， 发现在处理后6个月，在其叶面积方面没有显著差异。然而，在对照 植株中，CLa含量不同，对照植株已经显示出细菌以及HLB特征症状 的存在(图32)。

实施例11.青柠檬果汁的测算分析

收集从用防御素、溶菌酶及其混合物处理的树木分离的青柠檬果 实，以及对照树木的青柠檬。使用榨汁机来提取果汁并集中用于确定 根据墨西哥和FDA对于果汁规范的测算参数。结果显示在图33中。 可以观察到，钙、铁、能量、灰分、可得碳水化合物、钠、维生素C (抗坏血酸)和水分的浓度在接受本发明处理的果汁以及对照果汁之 间相似，表明在它们之间几乎等同。

实施例12.在转基因青柠檬中防御素蛋白的免疫检测以及转基因存在的证据

对根据本发明的表达抗微生物剂防御素或溶菌酶的遗传修饰青柠 檬植株进行处理以包埋在石蜡中并进行免疫检测测试。进行半薄切片， 脱石蜡，并水合，接着将其用抗人-β-防御素抗体孵育。在山羊中产生 的一抗用与碱性磷酸酶结合的山羊抗兔抗体进行免疫检测并用BCIP 和NBT显色，其生成紫罗兰色，表明免疫检测蛋白的存在。如图34 所示，防御素位于转化植株的韧皮部中。

同样通过端点PCR，在根据本发明的转化植株中，我们检测到上 述编码抗微生物剂的基因(图35)，其构成所述转基因存在于经组织培 养而成的遗传修饰植株中的分子学证据。使用PCR技术，已经鉴定出 在GM柑橘基因组中的插入位点。

实施例13.从处理植株获得的花粉的形态

收集来自根据本发明处理的植株的花粉，对其拍照和测量以评估 其实质等同性。图36(区块A)显示出花粉的代表性图片，我们可以 看到，其形态特征与对照植株相似。

获得花粉的平均面积，且在它们之间不存在统计学上显著的差异 (图36，区块B)。结果显示，在从处理植株获得的花粉在面积或形态 上没有变化。

从以上可以看出，根据本发明，可以获得表达具有抗微生物活性 的蛋白的遗传修饰植株，例如所测试的柑橘，其具有保护其自身免受 柑桔黄龙病亚洲种病原菌引起的感染的能力；例如，墨西哥青柠檬、 波斯青柠檬、橙、橘和葡萄柚。

而且，本发明使得可以获得表达抗微生物蛋白的遗传修饰柑橘的 砧木(模式物)。经实验测试的模式物为沃尔卡默檬和阿利莫莱，其耐 受于柑橘速衰病毒。遗传修饰的砧木可以经由维管组织将抗微生物剂 移动到易感于感染的植株接枝物，例如墨西哥青柠檬、波斯青柠檬、 橙、橘和葡萄柚，如经由实验验证的，从而提供对接枝物的保护。砧 木具有的优势是，产生常规果实而不存在编码抗微生物剂的基因，且 果实不用面对例如遗传修饰有机体生物安全使用的墨西哥法律。这也 意味着在其消费和生产中的较高安全性。

根据本发明，对于在认证生态园中生成的健康植株，抗微生物剂 的暂时表达通过根癌农杆菌的接种而进行，根癌农杆菌在其T-DNA中 包含抗微生物剂的表达单元。接种可以在健康植株中进行以作为预防 方法。在种植地方性区域例如HLB区域时，植株将不会感染，或者将 显示出非常低水平的细菌，从而使得可以产生常规果实，其将不用面 对例如遗传修饰有机体生物安全使用的墨西哥法律。同时，产品可以 用在新的种植中或替代患病植株。

对于患有HLB的生产性树木，抗微生物剂的短暂表达根据本发明 经由根癌农杆菌的接种而进行，根癌农杆菌在其T-DNA中包含抗微生 物剂的表达单元。接种可以在健康植株中进行以作为预防方法。在种 植地方性区域例如HLB区域时，植株将不会感染，或者将显示出非常 低水平的细菌，从而使得可以产生常规果实，其将不用面对例如遗传 修饰有机体生物安全使用的墨西哥法律。同时，产品可以用在新的种 植中或替代患病植株。

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