一种金纳米-碳纳米管-壳聚糖复合膜细胞传感器在食源性致病菌毒性检测方面的应用

摘要

本发明公开了一种金纳米-碳纳米管-壳聚糖复合膜细胞传感器在食源性致病菌毒性检测方面的应用，属于革兰氏阴性致病菌毒性检测技术领域。本发明通过自组装方法将纳米金-碳纳米管-壳聚糖修饰到磁性玻碳电极上，采用内吞有磁纳米颗粒的小鼠巨噬细胞Ana-1作为传感介质，将其直接吸附到修饰电极，完成传感器的构建；最后应用于革兰氏阴性菌的脂多糖毒性评价，在浓度范围在1～5μg？mL

说明书

技术领域

本发明涉及一种金纳米-碳纳米管-壳聚糖复合膜细胞传感器在食源性致病菌毒性检测方 面的应用，属于革兰氏阴性致病菌毒性检测技术领域。

背景技术

近年来，随着经济全球化进程加快，食品安全已成为当今世界性公共卫生热点。食源性 致病菌的危害是食品安全的一个重要方面，并不随经济发展和技术进步而减少或消失，世界 范围内食源性致病菌引起的食品安全恶性事件接连发生，食源性疾病发生率居高不下。因此， 对于食源性致病菌的毒性评价已经成为食品安全领域的一个重要课题。来自革兰氏阴性细菌 的脂多糖被发现是引起众多感染或疾病的最关键因素之一，是已被确定为危险的人类病原体。

食品在生产、运输、销售过程中容易受微生物污染，因此微生物检测是食品检验中的一 项重要内容。目前常用于检测和鉴定食源性致病菌的方法主要有分离培养鉴定法、生化鉴定、 酶联免疫吸附法(ELISA)及自动酶联荧光免疫检测方法(VIDAS)相结合等一些简单的分子生 物学和免疫学方法。这些检测方法除操作繁琐外，检验时间较长，成本昂贵，具有很大的操 作误差。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种基于金纳米/碳纳米管/壳聚糖复合膜细胞传 感器的制备方法，并优化确定了该发明材料的使用条件，用壳聚糖作为金纳米和碳纳米管的 分散液，取20μl该分散液修饰到磁电极上制备复合膜，获得良好的导电性，并利用磁性吸 附一定浓度的细胞制备细胞传感器，并将该细胞传感器用于快速检测革兰氏阴性致病菌毒性。 本发明利用巨噬细胞是体内免疫细胞，革兰氏阴性菌细胞壁的毒力因子LPS的主要受体是巨 噬细胞表面的标志分子CD₁₄，能快速激活巨噬细胞，引起细胞内钙离子浓度升高，产生大量 活性氧(ROS)及一系列炎症因子引起炎症反应的特点，建立起巨噬细胞体外评价模型并构 建传感器，比常规检测手段更直接、更快捷。本发明采用革兰氏阴性致病菌脂多糖作为检测 对象。LPS是革兰氏阴性菌的主要毒力因子，能够激活巨噬细胞产生炎症反应，使细胞发生 形态变化及凋亡。利用LPS的这一特征，以小鼠巨噬细胞Ana-1为检测介质，通过电化学信 号检测LPS对细胞生长状况的影响，并进行定量分析，从而达到快速检测致病菌的目的。此 外采用生物活性的壳聚糖作为介质分散碳纳米管和金纳米制备复合膜，提高了细胞粘附力和 生命力。

本发明的第一个目的是提供一种用于快速检测革兰氏阴性致病菌毒性的细胞传感器，其 制备方法如下：(1)清洁磁电极磁性玻碳电极；(2)将羧基化多壁碳纳米管分散在壳聚糖溶 液中，超声、离心得到碳纳米管-壳聚糖分散液，然后在室温下强烈搅拌加入HAuCl₄，80℃ 加热搅拌至溶液颜色不发生变化，得到金纳米/碳纳米管/壳聚糖分散液；(3)将金纳米/碳纳 米管/壳聚糖分散液滴加到彻底清洁的磁性玻碳电极表面，红外灯下烘干，得到金纳米-碳纳米 管-壳聚糖复合膜修饰磁电极；(4)然后将磁细胞直接吸附到修饰磁电极表面，即得到金纳米 -碳纳米管-壳聚糖复合膜细胞传感器。

所述磁细胞的制备方法如下：用RPMI1640培养液将合成的磁纳米粒子配制成浓度为 0.05mgmL^-1，将小鼠巨噬细胞以每孔10⁶mL^-1接种于六孔板中，每孔加入2mL上述含磁纳 米颗粒培养液，置于37℃5％CO₂培养箱中培养。

所述磁纳米颗粒的制备：将1.35gFeCl₃·6H₂O溶入40mL乙二醇中，加入3.6g无水醋 酸钠和1.0g聚乙二醇强烈搅拌30min，密封在高压釜中，加热到200℃反应8h，冷却至室 温，产物用无水乙醇和超纯水各洗4次，在真空干燥箱中80℃干燥过夜备用。

本发明还提供一种利用所述细胞传感器快速检测革兰氏阴性致病菌毒性的方法，所述方 法是将细胞传感器置于不同的已知浓度的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)中孵育，冲洗后 将传感器插入电解池中进行测量，得到不同浓度LPS溶液的阻抗值，绘制标准曲线，然后将 提取到的待检测菌株的LPS配制成溶液，使用传感器检测阻抗值，将得到的阻抗值带入标准 曲线即可得到待检测菌株的LPS含量；对同种致病菌而言，LPS含量越高说明待测菌株的菌 含量越多、毒性越强，对不同种类的致病菌而言(对于不同种类致病菌而言，脂多糖结构也 并不相同，毒性也就不同，LPS含量与致病性不具有可比性)，相同菌含量的不同待测菌提取 出来的LPS含量越高、毒性越强；所述细胞传感器是将内吞有磁纳米颗粒的小鼠巨噬细胞 Ana-1，即磁细胞直接吸附到金纳米-碳纳米管-壳聚糖复合膜修饰磁电极上构建的。

所述方法是：通过自组装的方法将壳聚糖分散的纳米金和碳纳米管材料修饰到磁电极上 得到金纳米-碳纳米管-壳聚糖复合膜修饰磁电极，采用内吞磁纳米颗粒的小鼠巨噬细胞Ana-1 作为传感介质，并将磁细胞直接吸附到金纳米/碳纳米管/壳聚糖复合膜修饰磁电极上完成细胞 传感器的构建，最后将制备的细胞传感器应用于LPS的检测；具体步骤为：

(1)磁电极上纳米金-碳纳米管-壳聚糖的自组装修饰；

(2)磁纳米颗粒的制备；

(3)小鼠巨噬细胞的培养和磁细胞的制备；

(4)磁细胞在磁电极上的吸附；

(5)LPS的检测。

所述使用传感器检测阻抗值方法如下：电化学工作站ATUOLAB在初幅0.05V，频率为 1～100kHz的条件下，在反应介质液为2.5mMFe(CN)₆^3-/4-溶液中进行测量，采用EIS法，以 工作电极经修饰后吸附磁细胞的阻抗值作为空白交流阻抗值R_et(Ab)，以此电极与含有不同浓 度LPS刺激后的细胞在同一电解液中所测阻抗值为R_et(Ab-Ag)，求出在不同LPS浓度中R_et的变化值ΔR_et：

ΔR_et＝R_et(Ab-Ag)-R_et(Ab)

R_et(Ab)：空白交流阻抗值；

R_et(Ab-Ag)：与LPS刺激后的细胞的电极电子传递电阻值；

ΔRet：反应前后电极电子传递电阻的变化值；

以电子传递电阻的变化值和LPS溶液浓度的关系作图，即得LPS细胞传感器的检测标准 曲线。

所述细胞传感器进行循环伏安和交流阻抗测试；其中循环伏安条件为：扫描范围：-0.2～ 0.6V，振幅：0.05V；交流阻抗条件为：初始电位：0.2V，振幅：0.05V，频率范围1～100kHz。

本发明制备的巨噬细胞细胞电化学传感器检测革兰氏阴性菌脂多糖相比传统方法具有如 下优势：

(1)作为传感介质的巨噬细胞本身就属于免疫系统，当细胞接触LPS时会发生强烈的 免疫反应，表现为形态上细胞膜表面微绒毛减少，细胞内钙离子升高，产生大量活性氧、炎 症因子等，因此将巨噬细胞作为检测致病菌的介质来构建传感器将会大大提高检测的灵敏度 和反应速度；

(2)利用具有生物活性的壳聚糖制备复合膜修饰电极，在一定程度上提高了细胞的粘附 力和活力。本发明采用电化学测定阻抗来作为检测的信号，不仅提高了检测的灵敏度而且加 快了检测的速度，克服了传统方法的弊端，真真正正实现了对致病菌的快速检测。测定阻抗 值与LPS浓度在1～5μgmL^-1范围内呈良好的线性关系，其线性回归方程为：y＝153.27x+120.47, r＝0.9944，检出限为0.3μgmL^-1(S/N＝3)。将检测的阻抗值带入标准曲线方程中即可得到LPS 的检测结果，可以通过检测数据结果和比较LPS的含量来确定革兰氏致病菌的致病性强弱。

附图说明

图1：电化学细胞传感器构建的流程图；

图2：电化学细胞传感器的吸附细胞时间(A)和吸附浓度(B)优化图：(A)a0min；b1min； c3min；d5min；e10min；f15min；(B)a6×10²mL^-1；b6×10³mL^-1；c6×10⁴mL^-1；d6×10⁵mL^-1；e6×10⁶mL^-1；f6×10⁷mL^-1；g6×10⁸mL^-1；

图3：磁电极表面修饰表征循环伏安图(A)和差分脉冲图(B)；

a裸电极；b碳纳米管-壳聚糖修饰后磁电极；c金纳米-碳纳米管-壳聚糖修饰后磁电极，d金 纳米/碳纳米管/壳聚糖修饰后磁电极吸附磁纳米颗粒；e金纳米/碳纳米管/壳聚糖修饰后磁电 极吸附磁细胞

图4：修饰电极表面细胞SEM扫描电镜图；

图5：LPS的检测交流阻抗图和标准曲线。

具体实施方式

实施例1电化学细胞传感器的制备

电化学细胞传感器构建的流程如图1所示，是先将羧基化碳纳米管分散液中加入HAuCl₄制备金纳米/碳纳米管/壳聚糖分散液，滴加到电极上修饰电极，然后将制备的磁纳米颗粒内吞 到小鼠巨噬细胞中，利用磁性将细胞吸附固定到修饰的磁玻碳电极表面，制备得到细胞传感 器。

1、纳米金-碳纳米管-壳聚糖复合膜修饰磁电极

将磁电极磁性玻碳电极的清洁方法如下：将磁电极(Φ＝5mm)置于Piranha溶液中浸泡15 min后，分别用0.3μm，0.05μm的Al₂O₃抛光粉末，将电极表面打磨抛成镜面，再用1:1(V: V)的硝酸、无水乙醇、超纯水依次超声清洗5min，氮气吹干，4℃备用。将10mg纯化后的 羧基化多壁碳纳米管分散在20mL壳聚糖溶液中，超声2h并离心10min，在室温下强烈搅 拌将1mL25mMHAuCl₄加入碳纳米管-壳聚糖分散液中，80℃加热搅拌至溶液颜色不发生 变化。将20μl金纳米/碳纳米管/壳聚糖分散液滴加到彻底清洁的磁性玻碳电极表面，红外灯 下烘干。

2、磁纳米颗粒的制备

将1.35gFeCl₃·6H₂O溶入40mL乙二醇中，加入3.6g无水醋酸钠和1.0g聚乙二醇强烈 搅拌30min，密封在高压釜中，加热到200℃反应8h，冷却至室温，产物用无水乙醇和超纯 水各洗4次，在真空干燥箱中80℃干燥过夜备用。

3、细胞的培养和固定

用RPMI1640培养液将合成的磁纳米颗粒配制成浓度为0.05mgmL^-1，将小鼠巨噬细胞 以每孔10⁶mL^-1接种于六孔板中，每孔加入2mL上述含磁纳米颗粒培养液，置于37℃5％CO₂培养箱中培养。将磁细胞直接吸附到修饰好的磁电极表面。

4、细胞传感器电化学鉴定

对制备好的细胞电化学传感器进行循环伏安和交流阻抗测试，SEM扫描电镜进行表征。 微分脉冲伏安法条件为：扫描范围：-0.2～0.6V，振幅：0.05V；交流阻抗法条件为：初始电 位：0.2V，振幅：0.05V，频率范围1～100kHz。在细胞传感器的构建过程中，对吸附细胞的 浓度进行了优化以获得稳定的细胞传感器，结果如图2所示，由图可以看出，当细胞浓度达 到6×10⁶mL^-1时，电极测得的R_et不再发生持续变化，说明此时电极表面以达到吸附饱和，细 胞的最佳吸附浓度为6×10⁶mL^-1。如图3所示，金纳米/碳纳米管/壳聚糖复合膜修饰磁电极后 的电信号(曲线c)比未修饰的裸电极(曲线a)明显增强，说明了金纳米/碳纳米管/壳聚糖 复合膜良好的导电性，细胞吸附到修饰电极后，由于细胞膜的绝缘性，电信号明显降低(曲 线e)，如图4所示，表明细胞吸附到了修饰电极表面，证明细胞传感器成功制备。

实施例2电化学细胞传感器的应用

1、LPS的检测

称取1mgLPS用PBS溶解为1mgmL^-1溶液。用RPMI1640培养液稀释成浓度分别为 1，1.5，2，2.5，3，5μgmL^-1的LPS溶液。将修饰好的细胞传感电极，分别置于不同浓度 LPS溶液37℃孵育3h后，用PBS冲洗后将电极插入电解池中进行测量。

2、分析条件与方法

分析方法如下：电化学工作站ATUOLAB在初幅0.05V，频率为1～100kHz的条件下， 在反应介质液为2.5mMFe(CN)₆^3-/4-溶液中进行测量，采用EIS法，并通过最佳等效电路计 算，以工作电极经修饰后吸附磁细胞的阻抗值作为空白交流阻抗值R_et(Ab)，以此电极与含有 不同浓度LPS刺激后的细胞在同一电解液中所测阻抗值为R_et(Ab-Ag)，求出在不同LPS浓度 中R_et的变化值ΔR_et：

ΔR_et＝R_et(Ab-Ag)-R_et(Ab)

R_et(Ab)：空白交流阻抗值；

R_et(Ab-Ag)：与LPS刺激后的细胞的电极电子传递电阻值；

ΔRet：反应前后电极电子传递电阻的变化值；

以电子传递电阻的变化值和LPS溶液浓度的关系作图，即得LPS细胞传感器的检测标准 曲线。

3、结果判断

通过配制一系列的LPS溶液，测量用以得到不同浓度LPS溶液的阻抗值，做标准曲线(如 图4所示)。其测定阻抗值与LPS浓度在1～5μgmL^-1范围内呈良好的线性关系，其线性回归 方程为y＝153.27x+120.47，r＝0.9944,检出限为0.3μgmL^-1(S/N＝3)。

将检测的阻抗值带入标准曲线方程中即可得到LPS的检测结果，可以通过检测数据结果 和比较LPS的含量来确定革兰氏致病菌的致病性强弱。

使用本方法可以在3h内快速测定微量级别的LPS，灵敏度高、准确性好，因此可以为 快速定量检测与鉴定食品中存在的革兰氏阴性致病菌进行提供技术支持。本发明的细胞传感 器是依靠磁性将内吞磁纳米的细胞直接吸附到含有可拆卸磁芯的磁电极上，将磁芯拆除后电 极失去磁性，细胞失去磁性将从电极表面脱落，因此该细胞传感器可以通过控制磁性实现循 环重复使用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。