一种猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程毒株及其灭活疫苗和疫苗制备方法

摘要

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程毒株及灭活疫苗和疫苗的制备方法，毒株是通过对高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）毒株进行定点突变，使其GP5第35位和第44位的糖基化位点缺失的方式构建而成；灭活疫苗的有效成分为灭活的该毒株病毒液。本发明首次采用过氧化氢为灭活剂，通过过氧化氢灭活浓度、时间优化和免疫佐剂的优化获得新型灭活疫苗。与其他灭活剂和佐剂相比，该毒株制备的新型灭活疫苗可以有效诱导仔猪产生PRRSV细胞免疫应答和中和抗体，保护仔猪抵抗PRRSV强毒攻击的效果更好。该基因工程灭活疫苗比传统灭活疫苗更为有效，相比商品化的PRRSV活疫苗更为安全，具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种对猪繁殖与呼吸综合征病毒进行基因改造的基因工程毒株，一种新的病毒灭活方法，及以该灭活的基因工程毒株作为有效成分的疫苗的制备方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是严重危害世界养猪业的重要病原，主要引起母猪繁殖障碍、仔猪和成年猪呼吸道症状和死亡，给我国养猪业带来了巨大损失。该病毒引起的疾病又称“猪蓝耳病”。目前，该病主要防控技术包括疫苗免疫接种、全进全出饲养管理、生物安全措施、猪群野毒驯化和混合感染控制等综合防控措施。现有的商品化疫苗有活疫苗和灭活疫苗，但都不十分理想。现有的高致病性和传统型猪繁殖与呼吸综合征活疫苗都存在毒力返强和与田间毒株重组的风险，疫苗免疫后诱导产生的中和抗体和细胞免疫应答时间比较晚，免疫高峰产生时间需要70天以上。PRRSV灭活疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫都非常弱，几乎不产生中和抗体，免疫效果很差。此外，PRRSV基因组为单股正链RNA，病毒基因容易变异，不同流行毒株免疫保护基因GP5的糖基化位点存在多种类型，病毒毒力和抗原性发生改变，疫苗对不同基因变异流行毒株保护率不高。因此，国内外很多学者研究筛选该病毒免疫保护基因和抗原表位，采用不同表达系统，研制安全亚单位疫苗；或构建筛选免疫抑制作用低、遗传性稳定的重组PRRSV或自然弱毒株疫苗；或采用新的免疫佐剂研制灭活疫苗。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程毒株，该毒株是在发明自行筛选得到的高致病性PRRSV分离毒株BB0907的基础上进行GP5基因定点突变后拯救获得的。

本发明还提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗，该疫苗以灭活的上述基因工程毒株为有效成分，经该灭活疫苗免疫后中和抗体和细胞免疫应答产生快，能够显著降低PRRSV病毒血症、临床症状和病理变化。

本发明还提供了该灭活疫苗的制备方法，该方法制备简单，便于工业化生产。

传统PRRSV的主要糖蛋白GP5上一般存在2-5个糖基化位点，它们能够隐藏中和性表位，而阻止中和性表位诱导产生中和性抗体，如果将病毒的糖基化位点缺失，那么中和性表位的暴露就可以诱导产生中和性抗体。本发明针对我国猪繁殖与呼吸综合征病毒的特点，选择发明人自行分离的高致病性PRRSVBB0907毒株为研究对象，与我国猪繁殖与呼吸综合征病症符合度更高。高致病性PRRSV病毒的基因序列与传统的PRRSV病毒不一样，其产生了变异，致病性更为强烈，其糖基化位点作用和结构是否产生变化，糖基化位点的位置是否产生变化，是否仍然能够通过糖基化位点缺失的方式获得相应的疫苗不得而知。本发明针对这些问题进行进一步的研究，获得了免疫效果较好的、适合于我国高致病性猪蓝耳病防控的灭活疫苗。

本发明以我国特有的高致病性PRRSV流行毒株BB0907为基础，采用反向遗传技术，构建获得GP5基因两个糖基化位点缺失的重组PRRSV毒株。此外，通过研究筛选新的病毒灭活技术，猪体试验证明其可以有效诱导产生中和抗体和细胞免疫应答，并提供较好免疫保护作用，为研制PRRSV新型灭活疫苗取得了重要技术突破。

本发明采用发明人从患病猪上自行分离的一株高致病性PRRSV毒株BB0907为基础毒株，通过RNA提取试剂盒提取PRRSVBB0907的总RNA，然后采用重叠延伸PCR及PCR扩增技术得到PRRSVBB0907的全长cDNA。通过软件NetNGlyc1.0预测得到PRRSVBB0907毒株的GP5上存在4个糖基化位点，且第35和44位氨基酸所形成糖基化形式更强。因此，利用反向遗传技术，在BB0907感染性cDNA克隆的基础上，通过定点突变的方式拯救获得PRRSVBB0907GP5第35和44位糖基化位点缺失的重组病毒(PRRSV-N3544)，即为本发明保护的基因工程毒株，命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV-N3544。目前，该毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCCNo.10398，保藏日期为2015年2月3日。

本发明上述基因工程毒株PRRSV-N3544是通过对高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株进行定点突变、使其GP5第35位和第44位的糖基化位点缺失的方式而得到的。基因工程毒株PRRSV-N3544是不分节段、正链有囊膜的RNA病毒，其cDNA全序列如SEQNO.1所示。本发明基因工程毒株PRRSV-N3544包含一个ORF5开放阅读框，该开放阅读框是编码GP5蛋白的，其cDNA序列如SEQNO.2所示，其编码的GP5蛋白的氨基酸序列如SEQNO.3所示。

本发明对上述基因工程毒株进行构建时，采用病毒拯救技术，即病毒的全长感染性cDNA克隆技术，具体步骤包括：提取PRRSVBB0907的总RNA，采用分段克隆的策略，利用反转录酶，通过PCR扩增得到基因片段A、B、C1、C2和D1。然后利用重叠延伸PCR(SOEPCR)对C1和C2基因进行扩增，获得基因片段C。在扩增D1片段时，利用PCR扩增，分别添加17个Ploy(A)(共21个Ploy(A))和SwaI酶切位点；然后以D1片段为模板，利用PCR扩增获得到D片段，同时引入了SpeI酶切位点。将基因片段A、B、C和D分别连接入不同的质粒载体(例如pEasy-SimpleBlunt)中测序，基因测序正确后，再分别从这些质粒载体中双酶切下A、B、C和D基因片段，将A、B、C和D基因片段依次连接入同一载体(例如pCMV-β)中，即可得到含PRRSVBB0907cDNA的重组质粒。利用定点突变技术突变掉基因片段D上GP5的35和44位糖基化位点，获得基因片段Dm，将A、B、C和Dm基因片段依次连接入同一载体(例如pCMV-β)中，即可得到含PRRSV-N3544cDNA的重组质粒。将此含PRRSV-N3544cDNA的重组质粒采用脂质体转染细胞(例如MARC-145)，培养得到拯救病毒，该拯救病毒即为本发明基因工程毒株CGMCCNo.10398。

本发明还提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗，该灭活疫苗的有效成分为上述基因工程毒株灭活得到的灭活毒株，即有效成分为灭活的基因工程毒株CGMCCNo.10398。

本发明制备的基因工程毒株CGMCCNo.10398因为GP5第35和44位糖基化位点缺失，因此采用新的灭活方法灭活后，可以有效诱导产生PRRSV中和性抗体，该中和抗体产生时间比常规灭活疫苗提早3-4周，突破了PRRSV灭活疫苗种毒筛选技术的难点。

本发明灭活疫苗中，以滴度为10⁷TCID₅₀/ml的基因工程毒株CGMCCNo.10398病毒液为原料。

本发明灭活疫苗，是将病毒含量(也称为滴度)为10⁷TCID₅₀/ml的基因工程毒株病毒液灭活、调整pH为7.0左右，然后与佐剂混合均匀得到的。所述pH可以是6.7-7.4。

本发明灭活疫苗用过氧化氢灭活。灭活在20℃下进行，灭活时间1h以上，优选2h以上，例如2-3h。

本发明灭活疫苗中，灭活时，过氧化氢在病毒液中的浓度为1wt％。

本发明灭活疫苗为注射剂。灭活疫苗中的佐剂优选为卡波姆佐剂。

本发明还提供了该灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：将PRRSV-N3544毒株接种至MARC-145细胞进行培养，得病毒液，获得的病毒液病毒含量(也称为滴度)为10⁷TCID₅₀/ml；取PRRSV-N3544毒株病毒液(10⁷TCID₅₀/ml)，加入过氧化氢至过氧化氢在病毒液中的浓度为1wt％，然后在20℃下灭活2-3h，再加入25wt％Na₂SO₃溶液调节pH值至7.0左右，2-8℃保存备用；向灭活病毒液中加入其体积15％的卡波姆佐剂，混合均匀，2-8℃保存，即制备获得灭活疫苗。

本发明采用1％的过氧化氢灭活，研究发现，采用1％的过氧化氢灭活所得的灭活疫苗可以有效诱导产生PRRSV细胞免疫应答，彻底改变了传统灭活方法制备的灭活疫苗的免疫特性。

上述疫苗制备方法中，所述pH可以是6.7-7.4。

在本发明具体实施方式中，所用卡波姆佐剂为CP974S卡波姆佐剂。

本发明提供的基因工程毒株灭活后可作为疫苗使用。灭活疫苗免疫猪体后诱导的PRRSV特异性中和抗体和细胞免疫应答产生快。相比非免疫攻毒组，本发明灭活疫苗免疫后6周即可产生PRRSV特异的中和抗体和细胞免疫应答，攻毒后能够显著降低PRRSV病毒血症、临床症状和病理变化。同时，本发明灭活疫苗免疫效果明显优于未经基因改造的原始毒株制备的灭活疫苗。

本发明首次采用过氧化氢为灭活剂，通过过氧化氢灭活浓度、时间优化和免疫佐剂的优化获得新型灭活疫苗。与其它文献报道的其他灭活剂和佐剂相比，该毒株制备的新型灭活疫苗可以有效诱导仔猪产生PRRSV细胞免疫应答和中和抗体，保护仔猪抵抗PRRSV强毒攻击的效果更好。该基因工程灭活疫苗比传统灭活疫苗更为有效，相比商品化的PRRSV活疫苗更为安全，具有很好的应用前景。

保藏信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)PRRSV-N3544已于2015年2月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.10398。

附图说明

图1.PRRSVBB0907毒株的感染性克隆构建示意图。

图2.PRRSVBB0907毒株GP5糖基化位点的预测图。

图3.用XhoI酶切鉴定基因标记的电泳图。

图4.GP5突变位点RT-PCR扩增后的测序鉴定图。

图5.采用PRRSVGP5蛋白单抗进行Westernblot对GP5糖基化形式的鉴定图。

图6.采用PRRSVN蛋白单抗进行IFA对拯救病毒进行鉴定的荧光图(×400)，其中A：rBB；B:PRRSV-N3544；C:模拟感染。

图7.拯救病毒的生长曲线图。

图8.病毒空斑试验图。

图9.灭活不同时间制备的PRRSV-N3544灭活疫苗免疫小鼠的ELISA抗体(A)和中和抗体(B)随免疫时间的变化情况图。

图10.PRRSV-N3544灭活疫苗免疫猪的ELISA抗体(A)和中和抗体(B)随免疫时间的变化情况图。

图11.淋巴细胞增殖实验结果，其中A.刺激指数，B.IFN-γ含量C.IL-4含量。

图12.攻毒后猪体温变化图和临床症状得分统计图，其中A.攻毒后体温变化，B.攻毒后临床症状得分统计。

图13.攻毒后猪PRRSVELISA抗体检测结果图和病毒血症检测结果图，其中A.ELISA抗体，B.病毒血症。

图14.攻毒后猪肺脏大体病变统计图和肺脏病理变化统计图，其中A.肺脏大体病变统计，B.肺脏病理变化统计。

图15.攻毒后肺脏病理变化HE染色图，其中A.rBB；B.PRRSV-N3544；C.DMEM(×200)。

具体实施方式

下面对本发明进行进一步的详细说明，使本领域技术人员能够根据此描述实现本发明的技术方案。但应该明白的是，下述说明仅起到解释说明的作用，并不对本发明保护内容进行限制。

下述实施例中，所用主要材料如下：

高致病性PRRSV毒株BB0907从我国患病仔猪分离获得，在-70℃条件下保存。

MARC-145细胞由本实验室克隆得到并保存，也可市购。

pEASY-SimpleBlunt载体和pCMV-β载体购自Transgene公司。

SuperScript^TMIIIReverseTranscriptase为invitrogen公司产品。

PfuUltra^TMIIFusionHSDNAPolymerase高保真酶购自Stratagene公司。

TRIzolReagent、转染试剂lipofectamine2000购自invitrogen公司。

T4DNA连接酶和限制内切酶以及PNaseF糖基化酶均购自NEB公司。

E.Z.N.A.^TMGelExtractionKit和E.Z.N.A.^TMPlasmidMiniKit、RNA提取盒购自OMEGA公司。

DS2000DNAmarker购自TaKaRa公司。

实施例1PRRSVBB0907毒株全长cDNA克隆质粒pBB0907的构建

pCMV-BB0907构建策略见图1A。PCR引物见表1。采用RNA提取试剂盒提取PRRSVBB0907株总RNA；采用SuperScript^TMIII反转录酶，扩增基因片段A、B、C1、C2和D1。利用重叠延伸PCR(SOEPCR)对C1和C2基因进行扩增，获得基因片段C。如表1所示，设计引物时，A片段的头端引入PacI酶切位点，末端引入XhoI酶切位点；B片段的头端引入PacI和XhoI酶切位点，末端引入AflII酶切位点；C片段的头端引入PacI和AflII，而末端中含有AscI酶切位点。在扩增D1片段时，利用PCR扩增，分别添加17个Ploy(A)(共21个Ploy(A))和SwaI酶切位点；然后以D1片段为模板，利用PCR扩增获得到D片段，同时引入了SpeI酶切位点。因此获得的D片段头端引入了PacI和AscI酶切位点，末端引入了SpeI酶切位点。将基因片段A、B、C和D连接入pEasy-SimpleBlunt载体中，命名为pEasy-A、pEasy-B、pEasy-C和pEasy-D，基因测序正确后，再分别从这些重组载体pEasy中双酶切下A、B、C和D基因片段(其中D片段为PacI和SpeI双酶切；C片段为PacI和AscI双酶切；B片段为PacI和AflII双酶切；A片段为PacI和XhoI双酶切),然后依次以D-C-B-A的顺序连接入载体pCMV-β中，获得PRRSVBB0907cDNA全长质粒，命名为pBB0907(如图1A所示)。另外，在C片段中的6996bp处利用XhoI-BB0907-Fwd/XhoI-BB0907-Rev突变出XhoⅠ酶切位点作为遗传标记。

表1.BB0907毒株感染性克隆构建引物

RT-PCR具体方法如下：

参照Invitrogen公司SuperScript^TMIIIReverseTranscriptase产品说明书，以各片段下游引物为反转录引物，将RNA反转录为cDNA。反转录反应体系如下：RNA模板12μl、10mMdNTPs1μl、下游引物1μl，总体积14μl，混匀后，65℃水浴5min，然后冰浴至少1min。加入下列混合物(5×First-strandbuffer4μl、0.1MDTT1μl、反转录酶1μl)，置于55℃水浴1h，反应结束后70℃水浴灭活15min，将合成的cDNA置于-20℃保存。以cDNA为模板，利用PfuUltra^TMIIFusionHSDNAPolymerase高保真酶扩增目的基因片段，反应体系25μL，含cDNA模板2μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、10×PfuUltraⅡreactionbuffer2.5μL、2.5mMdNTPmixture2.5μL、PfuUltraⅡFusionHSDNApolymerase0.5μL、H2O16.5μL。PCR反应条件为：95℃预变性2min，95℃变性20s；58℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸3min。

重组质粒构建与鉴定方法如下：

连接：将获得的各片段DNA经胶回收试剂盒回收备用。分别将纯化回收后的各片段连接到pEASY-SimpleBlunt载体中(按试剂盒说明书进行)，根据PCR产物纯化回收的浓度调整连接体系(20ng/kb)，调整好体系后，轻轻混合，利用PCR仪连接30分钟。反应结束后，将离心管置于冰上，进行下一步转化。

转化：将5uL连接产物加入50μLTrans1-T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹管壁混匀后，冰浴30min；将EP管置于42℃水浴中热激30s，然后迅速进行冰浴5min；加入800μL无抗生素LB液体培养基，37℃200rpm/min振荡培养1h；12000rpm离心1min后弃去大部分上清，保留100μL左右上清用于重悬细菌沉淀；将重悬细菌沉淀涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的抗性平板上，37℃温箱中培养12-16h。

阳性重组子的鉴定和测序：根据上述平板上菌落的生长情况挑取分散的单菌落若干，接种于3mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm震荡培养过夜。在无菌条件下吸取相应的菌液1μL作为模板，用各片段上下游引物，进行PCR验证，将鉴定结果为阳性克隆，直接送测序公司测序。

实施例2GP5糖基化的预测以及同时突变GP5的35和44位糖基化位点的全长cDNA克隆质粒pN35/44S的构建

如图2所示，用软件NetNGlyc1.0进行预测，BB0907毒株GP5存在4个潜在的糖基化位点，分别位于第30,35，44和51位氨基酸(aa)，其中，第35aa和44aa处糖基化形式较强。

全长cDNA克隆质粒pN35/44S构建策略如图1B所示，以pEASY-D质粒为模板，利用定点突变试剂盒得到突变掉GP5的35和44位糖基化的质粒，命名为pEASY-Dm。另如图1C所示，将得到的pEASY-Dm用AscⅠ和SpeⅠ进行双酶切得到片段Dm，并替换掉pBB0907质粒中的D片段基因，获得GP5第35和44位糖基化位点基因突变的全长cDNA克隆质粒，命名为pN35/44S(图1C)。所用引物见表2。

表2PRRSVGP5糖基化位点突变引物

引物名称>引物序列(5’-3’)>GP5-S32R-Fwd>TGTGCTCGCCAACGCCAGAAACAGCAACAGCTCTC>GP5-S32R-Rev>GAGAGCTGTTGCTGTTTCTGGCGTTGGCGAGCACA>GP5-N33Y/N35S-Fwd>CTCGCCAACGCCAGCTACAGCAGCAGCTCTCATATTCA>GP5-N33Y/N35S-Rev>TGAATATGAGAGCTGCTGCTGTAGCTGGCGTTGGCGAG>GP5-N44K-Fwd>TTCAGTTGATTTATAAGTTAACGCTATGTGAGC>GP5-N44K-Rev>GCTCACATAGCGTTAACTTATAAATCAACTGAA>GP5-N51S-Fwd>AACGCTATGTGAGCTGAGTGGCACAGATTGGCTG>GP5-N51S-Rev>CAGCCAATCTGTGCCACTCAGCTCACATAGCGTT>GP5-Fwd>ATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGT>GP5-Rev>CTAGAGACGACCCCATTGTTCCGCT>

*Note:Themutationswereinboldandunderlined.

GP5基因定点突变具体方法如下：

首次单点突变时，以pEASY-D为模板，参照Stratagene公司的QuikChangeⅡXLSite-DirectedMutagenesisiKit进行，采用表2中前4对引物，分别将GP5中的4个糖基化位点进行突变缺失，突变质粒命名为pEASY-Dm(如表2所示，为了避免33位的N再次形成糖基化位点，故在进行35位氨基酸缺失突变时，同时将33和35位的N均进行了突变)。突变两个位点时，以第一个突变体质粒为模板，按相同方法进行第二个位点突变。其原理是：将一对包含突变位点的引物(正、反向)，与模板质粒退火后用PfuUltra^TMIIFusionHSDNAPolymerase进行“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎(DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次)，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。

PCR反应体系系25μL，含pEASY-D质粒DNA模板0.5μL、上游引物0.7μL、下游引物0.7μL、10×PfuUltraⅡreactionbuffer2.5μL、2.5mMdNTPmixture1.5μL、PfuUltraⅡFusionHSDNApolymerase0.5μL、H2O18.6μL。PCR反应条件为：95℃预变性2min，95℃变性1min；58℃退火50s，68℃延伸13min，18个循环；68℃延伸7min。

质粒转化和鉴定

取10μLPCR产物加入0.5μLDpnI酶，37℃消化1h，去除模板质粒。再将消化后产物按上述方法转化至Trans1-5α感受态，提取质粒，然后进行测序鉴定。

实施例3病毒的拯救与鉴定

将MARC-145细胞形成80％细胞单层，采用lipofectamine2000脂质体，按试剂盒说明书将重组质粒(pBB0907和pN35/44S)转染至细胞，37℃、5％CO₂培养6h后，弃转染液，加入2％犊牛血清的DMEM无抗维持液继续培养约72h，待出现明显细胞病变时，收取细胞培养液和细胞，冻融2次，即获得拯救病毒，拯救病毒分别命名为(rBB和PRRSV-N3544)。

获得该拯救病毒后，后期病毒的培养可以按照下述方法进行：将MARC-145细胞单层用胰酶消化扩大培养，待细胞长满单层后，弃掉营养液。按5％接种量接种PRRSV-N3544毒株病毒液(10⁷TCID₅₀/ml)，37℃吸附30分钟，加入含2％～3％犊牛血清的DMEM维持液，37℃继续培养3日，收集细胞及其培养液，反复冻融2次，测定病毒TCID₅₀，达10^7.0/ml以上，病毒液在-70℃冰箱中保存备用。

将所得的拯救病毒分别进行如下鉴定：

3.1分子遗传标记的酶切鉴定

将病毒接种MARC-145细胞单层，37℃培养3天后出现明显CPE(细胞病变)，收获病毒液，冻融3次，取少量病毒液接种新的MARC-145细胞单层，按相同方法培养和收获，连续传代至第10代(F10)，每代次病毒液于-70℃冰箱保存。将F10拯救病毒rBB和PRRSV-N3544以及BB097亲本病毒提取病毒总RNA，以GM-Fwd/GM-Rev为引物(表1)进行RT-PCR，扩增拯救病毒包含C片段中的基因标记处基因片段。PCR产物用XhoI酶切，用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果见图3，从图中可以看出拯救病毒中含有XhoI酶切位点。

3.2.传代测序突变位置的鉴定

将F10拯救病毒rBB和PRRSV-N3544提取病毒总RNA，以GP5-Fwd/GP5-Rev为引物(表2)，RT-PCR扩增拯救病毒的GP5。并将PCR产物跑胶回收后连接到克隆载体pEASY-SimpleBlunt中进行测序。测序结果表明在传代过程中，GP5的突变点稳定存在(见图4)。

3.3Westernblot对GP5糖基化形式的鉴定

为了鉴定GP5糖基化位点突变后在PRRSV中的糖基化形式，各取20μl第10代拯救病毒rBB和PRRSV-N3544，加入50U的PNaseF在37℃进行消化3h后进行变形电泳。同样，另取20μl第10代拯救病毒rBB和PRRSV-N3544，不加PnaseF消化直接进行变性电泳。经SDS-PAGE分离蛋白后采用半干转印法转印至NC膜，10％脱脂乳封闭2h；洗涤3次后，将NC膜置于PBST稀释的PRRSVGP5蛋白单抗，4℃孵育过夜；洗涤后，将NC膜置于PBST1:20000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃摇动孵育45min。最后在NC膜上滴加等量混匀的化学发光底物ECL的A、B液，孵育2min，在暗室X-光胶片上曝光，经显影、定影后观察。Westernblot结果表明，在rBB中，自然情况下，GP5的大小为25KD左右，而在突变病毒PRRSV-N3544中，GP5的大小为20KD左右，另外，经PNaseF处理后，GP5的大小为17KD左右。在GP5中，一个糖基化能使大小增加2.5KD左右；相反，消除一个糖基化位点，GP5的大小就减小2.5KD。因此，PRRSV-N3544应该是在rBB的基础上移除了GP5的35位和44位糖基化(见图5)。

3.4间接免疫荧光试验(IFA)

按常规方法进行。待96孔细胞板中的MARC-145细胞长成单层，接种第3代拯救病毒100ul，培养36h后用丙酮甲醛(体积比1:1)混合液固定，洗涤后加入1:100稀释的PRRSVN蛋白单克隆抗体，37℃湿盒作用1h；洗涤后加入1:100稀释的FITC荧光标记羊抗鼠lgG，37℃作用45min。结果见图6，rBB和PRRSV-N3544在感染MARC-145细胞36h后，在胞浆均能产生特异性荧光。

3.5.病毒生长曲线

将第10代rBB和PRRSV-N3544病毒以0.1MOI的剂量接种6孔细胞板MARC-145单层细胞，培养12h、24h、36h、48h和72h，收获病毒培养物，检测TCID50，绘制一步生长曲线，结果见图7。从图中可以看出，PRRSV-N3544比rBB病毒滴度要低1.5log10TCID50/ml左右，表明，GP5糖基化位点对病毒生长有一定的影响。

3.6.病毒空斑试验

按常规方法进行。将第10代rBB和PRRSV-N3544病毒作10²、10³、10⁴和10⁵倍稀释接种于6孔细胞板MARC-145细胞单层中，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育1h。弃培养液后加入含2％低熔点琼脂糖和2％犊牛血清的DMEM溶液，自然凝固后置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养72h后，加入1％的结晶紫染液，观察蚀斑形态和数量，结果见图8。从图中可以看出，rBB和PRRSV-N3544在感染MARC-145细胞后，4天时，用结晶紫染色均能看到清晰的空斑，大小无明显差异。

综合上述鉴定结果，PRRSV-N3544重组病毒ORF1b基因中含有标记基因XhoI酶切位点；GP5基因第35和44位糖基化位点已经缺失，并且稳定传代；病毒感染MARC-145细胞后2-3天，TCID₅₀达10^7.0/ml以上。

实施例4PRRSV过氧化氢灭活方法研究

1、病毒灭活方法选择

取PRRSVN3544毒株病毒液(10^7.0TCID₅₀/ml)中加入终浓度为1％过氧化氢溶液，混匀，20℃条件下进行灭活，分别于0.5、1、2、3、4、5、6、12、18和24h取出少量病毒液样品，接种MARC-145细胞，盲传3代，用PRRSVN蛋白单抗IFA检测PRRSV，结果为：20℃灭活0.5h样品，盲传3代后，有少量较弱的阳性细胞；而20℃作用1h以上者，接种细胞后盲传3代，用IFA检测，结果均为阴性，证明PRRSV用1％过氧化氢溶液20℃作用1h以上，可以被完全灭活。

2、疫苗制备与小鼠免疫试验

2.1疫苗制备：取PRRSVN3544毒株病毒液3份(10^7.0TCID₅₀/ml)，每份50ml，加入过氧化氢溶液至过氧化氢在病毒液中的终浓度为1％，混匀，分别放置于20℃灭活1h、2h和3h，然后分别加入25％Na₂SO₃溶液调节pH值至7.0左右，获得灭活的病毒液；然后再向灭活的病毒液中加入其15％体积的卡波姆佐剂，混合后配置成3种疫苗，2-8℃保存备用。

2.2小鼠免疫试验

2.2.1将60只2-3周龄的清洁级小鼠，随机分为4组，每组15只。第1-3组分别接种上述3种灭活疫苗，肌肉注射，0.5ml/只，第4组肌肉注射接种同等量的DMEM。隔离饲养，每间隔3周采用相同方法加强免疫1次，共接种3次。首免后每隔3周采血一次，分离血清，用于PRRSVELISA抗体和中和抗体检测。

2.2.2PRRSVELISA抗体检测：以超离浓缩纯化的PRRSVBB0907毒株抗原2.4μg/mL包被酶标板，37℃2h，后转入4℃包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min；加入1％的BSA，200μL/孔，37℃封闭2h；PBST洗涤3次，每次5min；将采集的小鼠血清作1:100稀释后加入酶标孔，每个样品重复3个孔，同时设定阴、阳性对照，100μL/孔，37℃1h；PBST洗涤3次，每次5min；加入抗鼠IgG-HRP(用PBST作1:20000稀释)，100μL/孔，37℃1h；PBST洗涤3次，每次5min；加入TMB显色液，100μL/孔，37℃15min；加入终止液(2MH₂SO₄)，50μL/孔；测定OD450nm值，计算P/N比值，P/N＝样品OD值/阴性对照OD值，P/N≥2.1判为阳性。结果见图9A,3个疫苗免疫组ELISA产生时间和水平相似(P>0.05)。

2.2.3PRRSV中和抗体检测：采用间接免疫荧光方法测定PRRSV中和抗体。将MARC-145细胞铺于96孔板，待细胞密度为90％左右开始试验。将采集的小鼠血清用10％血清的DMEM进行2倍比稀释，血清体积为100μL/孔。然后每孔加入100TCID₅₀的PRRSVBB0907毒株病毒液，同时设定阳性对照，阳性对照为只加入100TCID50的病毒，不加血清。每个实验组重复4个孔。48h后，用PRRSVN蛋白单抗进行IFA测定。判定标准为：当实验组的荧光数比阳性对照少50％以上，判定为中和抗体阳性孔。结果见图9B，表明3个灭活时间配置的疫苗在首免后6周均能够检测到中和性抗体，中和抗体水平相似(P>0.05)，但首免后9周，灭活1h的疫苗组的中和性抗体浓度有所下降，灭活2h和3h的疫苗组的中和性抗体的水平继续升高。因此，灭活2h以上疫苗的效果更好一些。

上述结果表明，重组PRRSVN3544毒株用1％过氧化氢溶液20℃作用1h以上，可以被完全灭活；该病毒用1％过氧化氢溶液20℃灭活2h和3h后免疫原性优于灭活1h的免疫原性。因此，该病毒灭活方法确定为：1％过氧化氢溶液20℃作用2-3h，加入25％Na₂SO₃溶液，调节pH值至7.0左右即可，考虑到节约成本，灭活时间优选为2h。

实施例5灭活疫苗的制备与免疫效率测定

1.疫苗制备：取PRRSV-N3544毒株病毒液(10^7.0TCID₅₀/ml)和rBB毒株病毒液(10^7.0TCID₅₀/ml)，各50ml，分别加入过氧化氢溶液至过氧化氢在病毒液中的终浓度为1wt％，混匀，放置于20℃灭活2h，然后分别加入25％Na₂SO₃溶液调节pH值至7.0左右，得灭活的病毒液；然后再向灭活的病毒液中分别加入其15％体积的卡波姆佐剂，混合均匀，制得PRRSV-N3544灭活疫苗和rBB灭活疫苗，2-8℃保存备用。

2.猪体疫苗免疫

将15头4周龄PCV2和PRRSV抗原、抗体均阴性的断奶仔猪，随机分为3组，每组5头。第1组接种由rBB灭活病毒配制而成的rBB灭活疫苗，肌肉注射，2ml/头，第2组接种由PRRSV-N3544灭活病毒配制而成的PRRSV-N3544灭活疫苗，肌肉注射，2ml/头，第3组肌肉注射接种同等量的DMEM。隔离饲养，间隔3周后采用相同方法加强免疫一次。首免后每隔2周采血一次，分离血清，用于PRRSVELISA抗体和中和抗体检测。首免后8周，采取抗凝血用于分离外周血淋巴细胞，测定淋巴细胞增殖反应，并测定细胞分泌细胞因子(IL-4和IFN-γ)的量。

3.PRRSVELISA抗体检测

以超离浓缩纯化的PRRSVBB0907毒株抗原2.4μg/mL包被酶标板，37℃2h，后转入4℃包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min；加入1％的BSA，200μL/孔，37℃封闭2h；PBST洗涤3次，每次5min；将猪血清作1:100稀释后加入酶标孔，每个样品重复3个孔，同时设定阴、阳性对照，100μL/孔，37℃1h；PBST洗涤3次，每次5min；将SPA-HRP用稀释液稀释(1:20000)后，加入酶标孔，100μL/孔，37℃1h；PBST洗涤3次，每次5min；加入TMB显色液，100μL/孔，37℃15min；加入终止液(2MH₂SO₄)，50μL/孔；测定OD450nm的值。符合下列条件判为阳性，否则为阴性。S/N＝样品OD值/阴性对照OD值≥2.1。

检测结果如图10A所示，从图中可以看出，灭活疫苗免疫组在首免4周后PRRSV特异性抗体开始转为阳性，而DMEM免疫组PRRSV抗体特异性抗体检测仍为阴性。两组免疫组PRRSV特异性抗体产生并没有明显差异。

4.PRRSV中和抗体检测

采用间接免疫荧光方法测定PRRSV中和抗体。将MARC-145细胞铺于96孔板，待细胞密度为90％左右开始试验。将血清用10％血清的DMEM进行2倍比稀释，血清体积为100μL/孔。然后每孔加入100TCID₅₀的PRRSVBB0907毒株病毒液，同时设定阳性对照，阳性对照为只加入100TCID50的病毒，不加血清。每个实验组重复4个孔。48h后，用PRRSVN蛋白单抗进行IFA测定。判定标准为：当实验组的荧光数比阳性对照少50％以上，判定为中和抗体阳性孔。

检测结果如图10B所示，PRRSV-N3544灭活免疫组在首免后6周能够检测到中和性抗体，并且能够达到1:16以上，而且能够持续到第8周。但是，rBB灭活免疫组在整个免疫周期均没有检测到中和抗体的产生。DMEM免疫组也没有中和抗体的产生。

5.淋巴细胞增殖试验

采用无菌方法，自猪前腔静脉采取血样，保存在肝素锂管中。使用人淋巴细胞分离液进行密度梯度离心分离PBMCs。淋巴细胞分离液与抗凝血按1:1的比例加入10mL玻璃离心管中，将5mL抗凝血小心加于5mL淋巴细胞分离液之液面之上，以1500rmp离心10min。此时离心管中自上而下细胞分四层。第一层为血浆或组织匀浆液，第二层为环状乳白色淋巴细胞或单核细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。用巴氏吸管吸取第二层细胞，用PBS洗涤，以1500rmp离心10min，再用1640洗涤一次，最后用10％的1640营养液重悬细胞，细胞计数后，密度调至5×10⁶个/mL，24孔板每孔铺500μL。然后进行淋巴细胞增殖试验，将超离纯化、浓缩的PRRSVBB0907按20μg/mL的终浓度灭活后作为刺激抗原，每个试验动物的淋巴细胞分为2组，分别为：PRRSV灭活抗原刺激和未加任何刺激，每组设三个重复。加入刺激原后，37℃培养66h，然后每孔加入40μLMTT(5mg/mL)，于37℃继续培养4h。吸取培养液，每孔加入100μLDMSO，振荡融解结晶，测定OD570nm的值。

刺激指数的计算方法如下：刺激指数SI＝刺激孔的OD值/未刺激孔的OD值。

实验结果如图11A所示，相比DMEM免疫组，灭活免疫组均能产生PRRSV特异的T淋巴细胞增殖。并且，两个病毒灭活免疫组的T淋巴细胞增殖应答无明显差异。

6.细胞因子的测定

收集猪体首免后8周时淋巴细胞增殖试验中各组刺激孔培养66h的细胞上清，按美国R&D公司猪IL-4及IFN-γ说明书检测其中IL-4及IFN-γ含量。

检测结果如图11B和11C所示，从图中可以看出，在灭活免疫组中均能产生一定量的IFN-γ，DMEM不能产生IFN-γ。而各组中的IL-4含量较低，且没有明显差异。

7.猪体免疫后攻毒实验

首免后8周后，每头猪通过颈部肌肉接种2×10^5.0TCID₅₀/mlPRRSVBB0907病毒液。攻毒后隔离饲养，每天观察仔猪临床表现，测量直肠温度。攻毒后第3、7、10和14天采血分离血清，用于病毒血症及PRRSV特异性抗体的检测。攻毒后第15天扑杀所有试验猪，采集肺脏组织，并进行病理学检查。

7.1体温变化及临床症状统计

攻毒后每天测量各组猪的体温，并做好记录。临床症状统计具体如下：攻毒后根据猪的临床表现、呼吸及咳嗽状况，对上述三项指标分别进行打分，分值在1～4之间。分值越高代表症状越严重，对上述任一指标而言，1分代表正常，2分代表症状轻微，3分代表症状严重，死亡猪的各项指标都为4分。攻毒后每天分别对各组猪进行打分，将三项指标分数求和得到每头猪每天的临床分数，攻毒后观察15天，得到每头猪15天的临床分数平均值。最后计算每组的平均临床分数统计分数。

攻毒后体温变化如图12A所示，从图中可以看出，DMEM免疫组体温明显升高，而rBB灭活免疫组在前几天体温也明显身高，整体温度高于PRRSV-N3544灭活免疫组。整个攻毒期间，DMEM免疫组攻毒后，出现典型的PRRSV症状，如皮肤发红，厌食，嗜睡，粗毛，呼吸困难，眼周水肿，眼睑水肿和轻度腹泻等。rBB灭活免疫组也出现明显的临床症状，但较DMEM免疫组轻。而PRRSV-N3544灭活免疫组没有出现明显的临床症状。临床症状评价如图12B所示。

7.2.PRRSVELISA抗体检测

以超离浓缩纯化的PRRSVBB0907毒株抗原2.4μg/mL包被酶标板，37℃2h，后转入4℃包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min；加入1％的BSA，200μL/孔，37℃封闭2h；PBST洗涤3次，每次5min；将采集的猪血清作1:100稀释后加入酶标孔，每个样品重复3个孔，同时设定阴、阳性对照，100μL/孔，37℃1h；PBST洗涤3次，每次5min；加入抗鼠IgG-HRP(用PBST作1:20000稀释)，100μL/孔，37℃1h；PBST洗涤3次，每次5min；加入TMB显色液，100μL/孔，37℃15min；加入终止液(2MH₂SO₄)，50μL/孔；测定OD450nm值，计算P/N比值，P/N＝样品OD值/阴性对照OD值，P/N≥2.1判为阳性。结果见图13A,2个疫苗免疫攻毒组ELISA水平相似，但与对照攻毒组有明显差异(P>0.05)。

7.3病毒血症的检测

采用标准的TCID₅₀法来测定血清中的病毒含量。在96孔板中铺好MARC-145细胞，待细胞密度约为90％时开始进行血清中PRRSV滴度的测定。实验前先将血清过滤后，然后用10％犊牛血清的DMEM进行10倍比稀释，然后接种到96孔板中，每孔为100μL。同时设定阳性对照，阳性对照为100TCID50的病毒液100μL。每个实验组重复4个孔。5天后，观察统计细胞病变数，采用Reed-Muench法计算。结果如图13B所示，PRRSV-N3544灭活免疫病毒血症组明显低于rBB灭活免疫组和DMEM免疫组(P>0.05)。

7.4肺脏大体病变统计

肺脏大体病变统计按参考文献(HalburPG,PaulPS,FreyML,LandgrafJ,EernisseK,MengXJ,etal.ComparisonofthepathogenicityoftwoUSporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolateswiththatoftheLelystadvirus.Veterinarypathology.1995；32:648-60.)的方法。根据各肺叶所占整个肺的体积比，给其分配相应的分数，两侧肺的尖叶和心叶各分配10分，两侧肺的膈叶各分配27.5分，右侧肺的副叶分配5分，这样整个肺总分100分。如果整个肺病变就是100分，50％表面积病变就是50分，即病变面积越大分数就越高。根据各肺叶的病变程度，按照其所占比重分别打分，最后计算该肺病变程度的总分。

攻毒15天后，剖杀所有猪，观察肺脏大体病变。PRRSV-N3544灭活免疫组猪的肺没有出现明显病变，只有轻微的间质增宽。而DMEM免疫组和rBB灭活免疫组的猪肺部出现明显的蚀变，间质明显增宽。如图所示14A，肺脏大体病变统计，PRRSV-N3544组得分明显低于rBB灭活免疫组和DMEM免疫组。

7.5.病理组织切片的制备

病理组织切片的制备按参考文献(HalburPG,PaulPS,FreyML,LandgrafJ,EernisseK,MengXJ,etal.ComparisonoftheantigendistributionoftwoUSporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolateswiththatoftheLelystadvirus.Veterinarypathology.1996；33:159-70)的方法。从猪肺脏上取下不大于2cm2×4mm厚的组织块，迅速放入固定液中(终浓度4％甲醛PBS溶液)；固定完全后，组织块用流水冲12h，除去多余的固定剂；组织块梯度酒精脱水，75％，1.5h；75％，1.5h；85％，1h；85％，1h；95％，1h；95％，1h；100％，1h；100％，1h；组织块透明，用二甲苯脱去组织中的乙醇，再在新的二甲苯中作用至组织边缘透明为止；透蜡，将透明好的组织放入融化好的蜡中浸1.5h，再转入新的蜡中浸1.5h；石蜡包埋，往包埋模具中加入融化好的石蜡，趁石蜡没有凝固迅速用镊子将组织块放入其中，将组织块平面贴于底部中央，标记好后待室温凝结完全；组织切片制备，将石蜡包埋好的组织块修成合适的大小及形状，夹于切片机上调成切片厚度并进行切片，厚度一般为4μm，将切下的薄片组织在42℃水上展开，使其贴敷于载玻片上，然后将贴有组织的玻片置于60℃温箱中恒温烘烤20min，使组织固定于载玻片。最后进行HE染色。二甲苯脱蜡：切片依次进入二甲苯I5min，二甲苯II5min；组织梯度酒精复水：准备分别盛有100％、95％、85％和75％乙醇的染色杯，切片依次进入100％酒精3～5min，100％酒精3～5min，95％酒精3min，95％酒精3min，85％酒精1～2min，85％酒精1～2min，75％酒精1～2min，75％酒精1～2min，去离子水1～2min；染色：苏木精1～2min，水洗3～5min，伊红0.5～1min；梯度酒精脱水：75％酒精1～2min，85％酒精1～2min，95％酒精3～5min,100％酒精3～5min,100％酒精3～5min。二甲苯透明：二甲苯I3～5min，二甲苯II3～5min；中性树胶封固后观察。

如图15所示，肺部组织切片HE染色后，于显微镜观察。DMEM免疫对照组试验猪主要表现为肺泡壁增厚，有单核细胞浸润，支气管上皮细胞增生；rBB灭活免疫组也有类似的肺脏组织病理学变化，但程度稍微轻于DMEM免疫对照组；而PRRSV-N3544灭活免疫组只有轻微的间质增宽出现。病理变化统计得分如图14B所示。

8.结论

从上述免疫实验和免疫后攻毒实验结果可以看出：PRRSV-N3544毒株采用过氧化氢可以有效灭活并保留免疫原性，猪体后6周即可诱导产生PRRSV中和抗体，同时产生明显细胞免疫应答。免疫后8周能够提供对同源PRRSV毒株的保护作用，有效降低病毒血症和组织病理学变化，免疫效果明显优于原始病毒灭活疫苗。

<110>南京农业大学；江苏南农高科技股份有限公司

<120>一种猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程毒株及其灭活疫苗和疫苗制备方法

<160>3

<210>1

<211>15361

<212>DNA

<213>PRRSV-N3544CGMCCNo.10398

<400>1

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