一种秋水仙素诱导楸叶泡桐同源四倍体的培育方法

摘要

本发明介绍了一种以二倍体楸叶泡桐组培苗的叶片进行的高效楸叶泡桐同源四倍体的诱导培育方法，楸叶泡桐叶片在预培养6d，附加秋水仙素浓度为30mg·L-1，二甲基亚砜的浓度2%，浸泡时间为48h振荡培养，四倍体楸叶泡桐诱导率达到14.5%；利用染色体计数的方法检测楸叶泡桐变异植株根尖细胞染色体数80，是对应二倍体泡桐的2倍；流式细胞仪检测泡桐四倍体叶片中单细胞DNA含量均是对应二倍体的2倍，表明获得四倍体楸叶泡桐植株。本发明公开的秋水仙素诱导楸叶泡桐同源四倍体培育方法具有取材广泛，操作简单、方便，成本低，诱导率高等优点，对不易获得四倍体的木本植物具有一定的指导意义。

说明书

技术领域

本发明属于林木生物技术育种领域，尤其涉及一种秋水仙素诱导楸叶泡桐同源四倍体的培育方法。

背景技术

泡桐（Paulownia）为玄参科泡桐属植物，落叶乔木,现有9个种，2个变种，在我国25个省（市）、自治区均有分布，是我国重要的速生用材林、防护林和平原绿化的主选树种，在改善生态环境和提高农民收入等方面起着重要作用。但泡桐生产中还存在着大冠低干和丛枝病严重等问题，由于泡桐种质资源少，遗传资源匮乏、满足国民经济建设要求的泡桐新品种严重不足，影响了农民种植泡桐的积极性，极大阻碍了泡桐产业的发展。种种事实表明，利用现代生物技术手段培育多倍体是解决目前泡桐新品种不足的有效途径。

多倍体植株具有生物量大，抗逆能力强等优点。随着组织培养和分子生物学的飞速发展，国内外科技人员经过长期不懈的努力，已诱导出多个林木的多倍体，如杨树等树种培育成了林木新品种在生产中得以推广应用。对泡桐来说，二十世纪四十年代，日本学者利用秋水仙素处理毛泡桐种子多倍体的研究工作，但没有变异植株保存下来。二十世纪九十年代，范国强等利用化学诱变结合组织培养技术分别对兰考泡桐、白花泡桐、南方泡桐、豫杂一号泡桐和毛泡桐等进行了四倍体诱导，创制了其新种质，经过大量地繁育和区试工作，已获得‘毛四桐1号’、‘兰四桐1号’、‘白四桐1号’、‘南四桐1号’和‘杂四桐1号’五个国家植物新品种权，并且在林业生产中推广应用，产生了显著的经济、社会和生态效益。但由于楸叶泡桐叶片细胞内含物的种类和数量与其他泡桐存在一定差异，至今未见国内外有关四倍体楸叶泡桐成功诱导的报道。楸叶泡桐是泡桐属中材质较好的一种，利用秋水仙素结合组织培养方法培育其四倍体，不仅对提高楸叶泡桐的生长速度，增强其抗逆性，克服目前楸叶泡桐生产中存在的问题具有重要的实际意义，而且对扩大泡桐的遗传背景、丰富其种质资源也有一定的理论意义。此外，四倍体楸叶泡桐也是培育其三倍体的重要遗传材料。

发明内容

本发明针对目前泡桐研究和生产中存在的问题，提供一种操作简单、方便高效、成本低，诱导率高的楸叶泡桐同源四倍体的培育方法。

本发明采用以下技术方案实现上述目的：

一种秋水仙素诱导楸叶泡桐同源四倍体的培育方法，该方法包括以下步骤：（1）叶片预处理；（2）秋水仙素诱导处理；（3）芽诱导；（4）根诱导；（5）楸叶泡桐变异植株鉴定；（6）四倍体楸叶泡桐幼苗的移栽。

该方法具体步骤如下：

（1）叶片预处理取楸叶泡桐靠近茎尖处的2~4对叶，将叶片剪成1．0×1．0cm2的方形小块，无菌条件下将其置于MS+0.3mg/LNAA+14mg/LBA的固体培养基中，在温度为20±2℃的人工气候箱内黑暗条件下处理4~8d；

（2）秋水仙素诱导处理无菌条件下将经过步骤（1）预处理后的楸叶泡桐叶片置于含15~45mg/L秋水仙素和1%~5%二甲基亚砜的液体培养基中，然后将盛有液体培养基的培养瓶置于振荡培养箱内，25±2℃、黑暗条件下诱导处理24~52h；

（3）芽的诱导无菌条件下取出步骤（2）诱导处理过的楸叶泡桐叶片，用无菌水冲洗3~5次，而后将其放置到步骤(1)中的MS固体培养基上，在温度为25±2℃、光照强度1300Lx、光照时间16h/d的培养室内进行芽的诱导，30d时统计其诱导率

；

（4）根的诱导经步骤（3）诱导出的芽长到1~3cm时，无菌条件下将幼芽从靠近培养基基部剪下，放入NAA浓度为0~0.3mg/L的1/2MS生根培养基上培养10~30d，观察其生根率

；

（5）楸叶泡桐变异植株鉴定取秋水仙素诱导变异植株长约2~3cm的芽在生根培养基中继代3~5次，待最后一次继代幼芽根长至1.0~3.0cm时，首先通过比较与未处理叶片诱导幼苗的形态差异，初步筛选出变异植株，再用染色体计数法或流式细胞仪测定单细胞DNA含量法对变异植株进行倍性鉴定；

（6）四倍体楸叶泡桐幼苗的移栽挑选出生长健壮、长势齐整，根系生长良好，根系在3cm以上的组培苗，然后炼苗移栽。

所述固体培养基中蔗糖浓度为20g/L，琼脂粉浓度为3.0g/L。

步骤（2）中振荡培养箱转速为50~120rpm。

组培苗在移栽前，先在常温下闭瓶炼苗3d，再去掉瓶塞炼苗7d，然后取出组培苗，用清水洗去沾在根系上的培养基，之后在1%多菌灵溶液中浸泡1min，选择少风的阴雨天移栽，将幼苗移栽到用1%KMnO₄消毒处理过的泥炭土和珍珠岩以3:1混合的基质中，21d后，将幼苗栽植到营养盆中。

采用上述技术方案的本发明具有以下优点：本发明针对泡桐属中楸叶泡桐目前国内外还没有诱导出四倍体楸叶泡桐的问题，以楸叶泡桐为材料，通过用秋水仙素和二甲基亚砜培养液浸泡、振荡培养其外植体，成功获得了楸叶泡桐的四倍体植株。与现有的毛泡桐、白花泡桐、兰考泡桐、豫杂一号泡桐和南方泡桐四倍体诱导相比，该方法操作方便、四倍体泡桐诱导率高。与以泡桐花蕾胎座为诱导材料诱导出的愈伤组织进行秋水仙素处理获得四倍体植株相比，本发明中的方法取材容易、广泛，不受季节限制，并且四倍体泡桐诱导率高；与以兰考泡桐、白花泡桐、南方泡桐、豫杂一号泡桐和毛泡桐叶片为诱导材料，采用秋水仙素固液双层培养获得四倍体植株的方法相比，该方法克服了固液双层培养繁琐的问题，节省了诱导四倍体楸叶泡桐的时间和成本、提高了诱导效率。总之，本发明采用的四倍体泡桐诱导方法，具有取材广泛，操作简单、方便，成本低，诱导率高等优点，对不易获得四倍体的木本植物具有一定的指导意义。

具体实施方式

实施例1

本发明公开的一种秋水仙素诱导楸叶泡桐同源四倍体的培育方法是通过如下步骤实现的：（1）叶片预处理；（2）秋水仙素诱导处理；（3）芽诱导；（4）根诱导；（5）楸叶泡桐变异植株鉴定；（6）四倍体楸叶泡桐幼苗的移栽。

所述楸叶泡桐同源四倍体的培育方法具体步骤如下：

（1）叶片预处理取楸叶泡桐靠近茎尖处的2~4对叶，将叶片剪成1．0×1．0cm2的方形小块，无菌条件下将其置于MS+0.3mg/LNAA+14mg/LBA的固体培养基中，在温度为20±2℃的人工气候箱内黑暗条件下处理4~8d；所述MS固体培养基中蔗糖浓度为20g/L，琼脂粉浓度为3.0g/L；

（2）秋水仙素诱导处理无菌条件下将经过步骤（1）预处理后的楸叶泡桐叶片置于含15~45mg/L秋水仙素和1%~5%二甲基亚砜的液体培养基中，然后将盛有液体培养基的培养瓶置于50~120rpm振荡培养箱内，25±2℃、黑暗条件下诱导处理24~52h；

（3）芽的诱导无菌条件下取出步骤（2）诱导处理过的楸叶泡桐叶片，用无菌水冲洗3~5次，而后将其放置到步骤(1)中的MS固体培养基上，在温度为25±2℃、光照强度1300Lx、光照时间16h/d的培养室内进行芽的诱导，30d时统计其诱导率

；

（4）根的诱导经步骤（3）诱导出的芽长到1~3cm时，无菌条件下将幼芽从靠近培养基基部剪下，放入NAA浓度为0~0.3mg/L的1/2MS生根培养基上培养10~30d，观察其生根率

；

（5）楸叶泡桐变异植株鉴定取秋水仙素诱导变异植株长约2~3cm的芽在生根培养基中继代3~5次，待最后一次继代幼芽根长至1.0~3.0cm时，首先通过比较与未处理叶片诱导幼苗的形态差异，初步筛选出变异植株，再用染色体计数法或流式细胞仪测定单细胞DNA含量法对变异植株进行倍性鉴定，楸叶泡桐四倍体诱变率4.2%~14.5%；

（6）四倍体楸叶泡桐幼苗的移栽挑选出生长健壮、长势齐整，根系生长良好，根系在3cm以上的组培苗，然后炼苗移栽；组培苗在移栽前，先在常温下闭瓶炼苗3d，再去掉瓶塞炼苗7d，然后取出组培苗，用清水洗去沾在根系上的培养基，之后在1%多菌灵溶液中浸泡1min，选择少风的阴雨天移栽，将幼苗移栽到用1%KMnO₄消毒处理过的泥炭土和珍珠岩以3:1混合的基质中，21d后，将幼苗栽植到营养盆中。

实施例2

本发明公开的一种楸叶泡桐同源四倍体的育种方法是通过如下步骤实现的：

（1）叶片预处理取楸叶泡桐靠近茎尖处的2-4对叶，将叶片剪成1．0×1．0cm2的方形小块，无菌条件下将其置于MS+0.3mg/LNAA+14mg/LBA的培养基中，MS培养基中蔗糖浓度为20g/L，琼脂粉浓度为3.0g/L，在温度为20℃的人工气候箱内黑暗条件下处理6d；

（2）秋水仙素诱导处理无菌条件下将经过步骤（1）预处理后的楸叶泡桐叶片置于含有30mg/L的秋水仙素和2%二甲基亚砜的液体培养基中，然后将盛有液体培养基的培养瓶置于100rpm的振荡培养箱内，温度为25℃的黑暗条件下诱导处理48h；

（3）芽的诱导无菌条件下取出步骤（2）诱导处理过的楸叶泡桐外植体，用无菌水冲洗3~5次，而后将其放置到不含秋水仙素和二甲基亚砜的MS+0.3mg/LNAA+14mg/LBA培养基上，于温度为25±2℃、光照强度1300lx、光照时间16h/d的培养室内进行芽的诱导，30d的时统计其诱导率：；

（4）根的诱导经步骤（3）诱导出的芽长到2cm时，无菌条件下将幼芽从靠近培养基基部剪下，放入NAA浓度为0.2mg/L的1/2MS生根培养基上培养20d，观察其生根率：；

（5）楸叶泡桐四倍体植株鉴定将经过诱导的叶片变大、变厚，生长健壮的变异植株在生根培养基中继代5次，待第五次继代幼芽根长至2.0cm时，先通过比较与未处理叶片诱导幼苗的形态差异，初步筛选出变异植株，然后采用染色体计数法检测楸叶泡桐诱变植株根尖细胞染色体数80，是二倍体楸叶泡桐的2倍；流式细胞仪检测楸叶泡桐四倍体叶片中单细胞DNA含量是二倍体楸叶泡桐的2倍，对变异植株进行倍性鉴定，楸叶泡桐四倍体诱变率14.5%；

（6）四倍体楸叶泡桐幼苗的移栽挑选出生长健壮、长势齐整，根系生长良好，根系在3cm以上的组培苗，然后炼苗移栽；组培苗在移栽前，先在常温下闭瓶炼苗3d，再去掉瓶塞炼苗7d，然后取出组培苗，用清水洗去沾在根系上的培养基，之后在1%多菌灵溶液中浸泡1min，选择少风的阴雨天移栽，将幼苗移栽到用1%KMnO₄消毒处理过的泥炭土和珍珠岩以3:1混合的基质中，21d后，将幼苗栽植到营养盆中。

将楸叶泡桐叶片预培养后，在含有适宜浓度的秋水仙素和二甲基亚砜的液体MS培养基中震荡处理48h后，采用常规组织培养首次成功获得了四倍体楸叶泡桐植株。与过去其它种四倍体泡桐诱导采用的方法相比，简化了操作程序、节约了成本、提高了诱导效率，简便、易行。

实施例3

一种秋水仙素诱导楸叶泡桐同源四倍体的培育方法具体步骤如下：

（1）叶片预处理取楸叶泡桐靠近茎尖处的2~4对叶，将叶片剪成1．0×1．0cm2的方形小块，无菌条件下将其置于MS+0.3mg/LNAA+14mg/LBA的固体培养基中，在温度为22℃的人工气候箱内黑暗条件下处理5d；所述MS固体培养基中蔗糖浓度为20g/L，琼脂粉浓度为3.0g/L；

（2）秋水仙素诱导处理无菌条件下将经过步骤（1）预处理后的楸叶泡桐叶片置于含15mg/L秋水仙素和3%二甲基亚砜的液体培养基中，然后将盛有液体培养基的培养瓶置于50rpm振荡培养箱内，24℃、黑暗条件下诱导处理36h；

（3）芽的诱导无菌条件下取出步骤（2）诱导处理过的楸叶泡桐叶片，用无菌水冲洗3~5次，而后将其放置到步骤(1)中的MS固体培养基上，在温度为22℃、光照强度1300Lx、光照时间16h/d的培养室内进行芽的诱导，30d时统计其诱导率

；

（4）根的诱导经步骤（3）诱导出的芽长到1cm时，无菌条件下将幼芽从靠近培养基基部剪下，放入NAA浓度为0.3mg/L的1/2MS生根培养基上培养10d，观察其生根率

；

（5）楸叶泡桐变异植株鉴定取秋水仙素诱导变异植株长约2~3cm的芽在生根培养基中继代3次，待第3次继代幼芽根长至1.0~3.0cm时，首先通过比较与未处理叶片诱导幼苗的形态差异，初步筛选出变异植株，然后采用染色体计数法检测楸叶泡桐诱变植株根尖细胞染色体数80，是二倍体楸叶泡桐的2倍；流式细胞仪检测楸叶泡桐四倍体叶片中单细胞DNA含量是二倍体楸叶泡桐的2倍，对变异植株进行倍性鉴定；

（6）四倍体楸叶泡桐幼苗的移栽挑选出生长健壮、长势齐整，根系生长良好，根系在3cm以上的组培苗，然后炼苗移栽；组培苗在移栽前，先在常温下闭瓶炼苗3d，再去掉瓶塞炼苗7d，然后取出组培苗，用清水洗去沾在根系上的培养基，之后在1%多菌灵溶液中浸泡1min，选择少风的阴雨天移栽，将幼苗移栽到用1%KMnO₄消毒处理过的泥炭土和珍珠岩以3:1混合的基质中，21d后，将幼苗栽植到营养盆中。

实施例4

一种秋水仙素诱导楸叶泡桐同源四倍体的培育方法具体步骤如下：

（1）叶片预处理取楸叶泡桐靠近茎尖处的2~4对叶，将叶片剪成1．0×1．0cm2的方形小块，无菌条件下将其置于MS+0.3mg/LNAA+14mg/LBA的固体培养基中，在温度为18℃的人工气候箱内黑暗条件下处理7d；所述MS固体培养基中蔗糖浓度为20g/L，琼脂粉浓度为3.0g/L；

（2）秋水仙素诱导处理无菌条件下将经过步骤（1）预处理后的楸叶泡桐叶片置于含45mg/L秋水仙素和5%二甲基亚砜的液体培养基中，然后将盛有液体培养基的培养瓶置于120rpm振荡培养箱内，26℃、黑暗条件下诱导处理24h；

（3）芽的诱导无菌条件下取出步骤（2）诱导处理过的楸叶泡桐叶片，用无菌水冲洗3~5次，而后将其放置到步骤(1)中的MS固体培养基上，在温度为26℃、光照强度1300Lx、光照时间16h/d的培养室内进行芽的诱导，30d时统计其诱导率；

（4）根的诱导经步骤（3）诱导出的芽长到3cm时，无菌条件下将幼芽从靠近培养基基部剪下，放入NAA浓度为0.1mg/L的1/2MS生根培养基上培养30d，观察其生根率；

（5）楸叶泡桐变异植株鉴定取秋水仙素诱导变异植株长约2~3cm的芽在生根培养基中继代4次，待第4次继代幼芽根长至1.0~3.0cm时，首先通过比较与未处理叶片诱导幼苗的形态差异，初步筛选出变异植株，再用染色体计数法或流式细胞仪测定单细胞DNA含量法对变异植株进行倍性鉴定；

（6）四倍体楸叶泡桐幼苗的移栽挑选出生长健壮、长势齐整，根系生长良好，根系在3cm以上的组培苗，然后炼苗移栽；组培苗在移栽前，先在常温下闭瓶炼苗3d，再去掉瓶塞炼苗7d，然后取出组培苗，用清水洗去沾在根系上的培养基，之后在1%多菌灵溶液中浸泡1min，选择少风的阴雨天移栽，将幼苗移栽到用1%KMnO₄消毒处理过的泥炭土和珍珠岩以3:1混合的基质中，21d后，将幼苗栽植到营养盆中。

实施例5

一种秋水仙素诱导楸叶泡桐同源四倍体的培育方法具体步骤如下：

（1）叶片预处理取楸叶泡桐靠近茎尖处的2~4对叶，将叶片剪成1．0×1．0cm2的方形小块，无菌条件下将其置于MS+0.3mg/LNAA+14mg/LBA的固体培养基中，在温度为19℃的人工气候箱内黑暗条件下处理4d；所述MS固体培养基中蔗糖浓度为20g/L，琼脂粉浓度为3.0g/L；

（2）秋水仙素诱导处理无菌条件下将经过步骤（1）预处理后的楸叶泡桐叶片置于含25mg/L秋水仙素和1%二甲基亚砜的液体培养基中，然后将盛有液体培养基的培养瓶置于80rpm振荡培养箱内，27℃、黑暗条件下诱导处理52h；

（3）芽的诱导无菌条件下取出步骤（2）诱导处理过的楸叶泡桐叶片，用无菌水冲洗3~5次，而后将其放置到步骤(1)中的MS固体培养基上，在温度为27℃、光照强度1300Lx、光照时间16h/d的培养室内进行芽的诱导，30d时统计其诱导率；

（4）根的诱导经步骤（3）诱导出的芽长到2cm时，无菌条件下将幼芽从靠近培养基基部剪下，放入NAA浓度为0~0.3mg/L的1/2MS生根培养基上培养15d，观察其生根率；

（5）楸叶泡桐变异植株鉴定取秋水仙素诱导变异植株长约2~3cm的芽在生根培养基中继代5次，待第5次继代幼芽根长至1.0~3.0cm时，首先通过比较与未处理叶片诱导幼苗的形态差异，初步筛选出变异植株，然后采用染色体计数法检测楸叶泡桐诱变植株根尖细胞染色体数80，是二倍体楸叶泡桐的2倍；流式细胞仪检测楸叶泡桐四倍体叶片中单细胞DNA含量是二倍体楸叶泡桐的2倍，对变异植株进行倍性鉴定；

（6）四倍体楸叶泡桐幼苗的移栽挑选出生长健壮、长势齐整，根系生长良好，根系在3cm以上的组培苗，然后炼苗移栽；组培苗在移栽前，先在常温下闭瓶炼苗3d，再去掉瓶塞炼苗7d，然后取出组培苗，用清水洗去沾在根系上的培养基，之后在1%多菌灵溶液中浸泡1min，选择少风的阴雨天移栽，将幼苗移栽到用1%KMnO₄消毒处理过的泥炭土和珍珠岩以3:1混合的基质中，21d后，将幼苗栽植到营养盆中。

实施例6

一种秋水仙素诱导楸叶泡桐同源四倍体的培育方法具体步骤如下：

（1）叶片预处理取楸叶泡桐靠近茎尖处的2~4对叶，将叶片剪成1．0×1．0cm2的方形小块，无菌条件下将其置于MS+0.3mg/LNAA+14mg/LBA的固体培养基中，在温度为21℃的人工气候箱内黑暗条件下处理8d；所述MS固体培养基中蔗糖浓度为20g/L，琼脂粉浓度为3.0g/L；

（2）秋水仙素诱导处理无菌条件下将经过步骤（1）预处理后的楸叶泡桐叶片置于含40mg/L秋水仙素和4%二甲基亚砜的液体培养基中，然后将盛有液体培养基的培养瓶置于70rpm振荡培养箱内，23℃、黑暗条件下诱导处理30h；

（3）芽的诱导无菌条件下取出步骤（2）诱导处理过的楸叶泡桐叶片，用无菌水冲洗3~5次，而后将其放置到步骤(1)中的MS固体培养基上，在温度为23℃、光照强度1300Lx、光照时间16h/d的培养室内进行芽的诱导，30d时统计其诱导率；

（4）根的诱导经步骤（3）诱导出的芽长到1~3cm时，无菌条件下将幼芽从靠近培养基基部剪下，放入NAA浓度为0.3mg/L的1/2MS生根培养基上培养25d，观察其生根率；

（5）楸叶泡桐变异植株鉴定取秋水仙素诱导变异植株长约2~3cm的芽在生根培养基中继代3次，待第3次继代幼芽根长至1.0~3.0cm时，首先通过比较与未处理叶片诱导幼苗的形态差异，初步筛选出变异植株，然后采用染色体计数法检测楸叶泡桐诱变植株根尖细胞染色体数80，是二倍体楸叶泡桐的2倍；流式细胞仪检测楸叶泡桐四倍体叶片中单细胞DNA含量是二倍体楸叶泡桐的2倍，对变异植株进行倍性鉴定；

（6）四倍体楸叶泡桐幼苗的移栽挑选出生长健壮、长势齐整，根系生长良好，根系在3cm以上的组培苗，然后炼苗移栽；组培苗在移栽前，先在常温下闭瓶炼苗3d，再去掉瓶塞炼苗7d，然后取出组培苗，用清水洗去沾在根系上的培养基，之后在1%多菌灵溶液中浸泡1min，选择少风的阴雨天移栽，将幼苗移栽到用1%KMnO₄消毒处理过的泥炭土和珍珠岩以3:1混合的基质中，21d后，将幼苗栽植到营养盆中。