一种青霉噻唑酸和/或脱羧青霉噻唑酸的检测方法

摘要

本发明公开了一种青霉噻唑酸和/或脱羧青霉噻唑酸的检测方法。其包括以下步骤：①将待测样品和乙腈的混合物，离心，收集上清液；②将所述上清液上样至已经活化的Oasis？PRiME？HLB固相萃取小柱，收集流出液；③将流出液去除溶剂，再用溶剂溶解，过滤；④将过滤后料液进行LC-MS/MS检测。本发明的预处理方法快速、简单、经济、可靠，能够有效地提取出待测组分，去除复杂基质影响，有益于待测样品的快速检测；在保持较高提取率的同时，节约了有机溶剂的使用、排放和损失，有利于环境保护，节约了预处理步骤、时间和能耗，方法快速，简单，精密度高，准确性高，具有较强的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种青霉噻唑酸和/或脱羧青霉噻唑酸的检测方法。

背景技术

青霉噻唑酸和脱羧青霉噻唑酸是青霉素类抗生素的降解物。青霉素类药 物的β-内酰胺环化学性质不稳定，与碱、酸、重金属、羟胺和青霉素酶作用 时，均易发生水解反应和分子重排，导致内酰胺环开环而失去抗菌活性。青 霉噻唑酸和脱羧青霉噻唑酸就是β-内酰胺环发生水解反应和分子重排后的 降解产物。

牛奶是一种大众日常的消费品，随着人们对食品安全要求日益提高，牛 奶的安全质量问题也越来越为人们重视。但从我国国内养殖环境来看，在我 国大部分地区，特别是广大农村地区的动物和饲料生产过程中，仍存在超量 或超范围使用抗生素、不严格执行药物配伍禁忌或停药期规定的情况，甚至 会存在使用违禁抗生素等现象。因食物链传递，牛奶中大量残留的抗生素会 对人体造成危害。另外，从乳制品加工的角度来看，原料乳中残留的抗生素 会严重影响干酪、黄油和发酵乳的起酵或后期风味的形成。

现有技术汇中，原料乳和/或液态乳制品中残留的青霉噻唑酸和脱羧青霉 噻唑酸的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱 (HPLC-MS/MS)方法等；其预处理多采用液液萃取等方法。这些预处理方 法存在的主要问题是操作步骤多、耗时长、有机溶剂使用量大、去除基质效 应效果差以及不利于环保的缺陷。该现象亟待解决。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服了现有技术对原料乳和/或液态乳制 品中残留的青霉噻唑酸和/或脱羧青霉噻唑酸的含量进行检测前，其预处理方 法操作步骤多、耗时长以及有机溶剂使用量大的缺陷，提供了一种青霉噻唑 酸和/或脱羧青霉噻唑酸的检测方法。本发明的预处理方法快速、简单、经济、 可靠，能够有效地提取出待测组分，去除复杂基质影响，有益于待测样品的 快速检测。而且在保持较高提取率的同时，节约了有机溶剂的使用、排放和 损失，有利于环境保护，节约了预处理步骤、时间和能耗，具有较强的应用 价值。本发明的检测方法可用于青霉噻唑酸和/或脱羧青霉噻唑酸，且检测方 法快速，简单，精密度高，准确性高。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明提供了一种青霉噻唑酸和/或脱羧青霉噻唑酸的检测方法，其包括 以下步骤：

(1)将待测样品和乙腈的混合物，离心，收集上清液；所述的待测样 品为不含固体颗粒的乳制品；

(2)将所述上清液上样至已经活化的OasisPRiMEHLB固相萃取小柱， 收集流出液，即得预处理后的待测样品；

(3)将所述预处理后的待测样品去除溶剂，再用溶剂A溶解，过滤， 得进料样品；所述溶剂A为甲醇水溶液、乙腈水溶液或水；

(4)将步骤(3)中所述进料样品再进行高效液相色谱-电喷雾串联二 级质谱(LC-MS/MS)检测青霉噻唑酸和/或脱羧青霉噻唑酸，即可。

步骤(1)中，所述的待测样品较佳地为原料乳和/或液态乳制品。

其中，所述的液态乳制品为本领域常规的液态乳制品，较佳地为高钙牛 奶、高铁牛奶、低乳糖牛奶和低脂牛奶中的一种或多种，更佳地为高钙牛奶 和/或低乳糖牛奶。

其中，所述的原料乳为本领域常规的原料乳，较佳地为牛乳和/或羊乳。 除所述待测组分外，所述牛乳的成分及含量一般如表1所示：

表1

其中，上述百分比为各组分相对于牛乳的质量百分比。

步骤(1)中，所述的待测样品可能含有青霉噻唑酸和/或脱羧青霉噻唑 酸。该些组分可能是由于养殖动物和生产饲料过程中，超量或超范围使用抗 生素、不严格执行药物配伍禁忌或停药期规定或使用违禁抗生素等现象造成 的。

步骤(1)中，所述的待测样品中，青霉噻唑酸的含量较佳地为 20～1000μg/Kg，更佳地为20～50μg/Kg。所述的待测样品中，脱羧青霉噻唑 酸的含量较佳地为10～1000μg/Kg，更佳地为20～50μg/Kg。

步骤(1)中，所述乙腈的添加量为本领域常规的添加量，较佳地为 3～40mL/1～4g待测样品，更佳地为3～10mL/1g待测样品。

步骤(1)中，较佳地，在所述离心的操作之前，先将所述混合物进行 漩涡震荡。所述旋涡震荡的方法和条件为本领域常规的方法和条件，所述的 旋涡震荡的时间较佳地为1～10min，更佳地为5min。所述漩涡震荡的温度本 领域常规，一般为室温。所述旋涡震荡是为了利于提取，使乙腈进一步提取 所述待测成分。

步骤(1)中，较佳地，所述混合物中还包含酸。所述酸为本领域常规 的酸，较佳地为甲酸和/或乙酸。所述酸的添加量为本领域常规，较佳地为 0.1～2％，更佳地为0.8～1.2％，最佳地为1％；上述百分比为所述酸占所述乙 腈的体积百分比。添加所述酸后，所述待测样品中所述青霉噻唑酸或所述脱 羧青霉噻唑酸的提取率至少能提高10％以上。

步骤(1)中，根据本领域常识可使用所述乙腈和酸进行多次离心操作， 较佳地使用所述乙腈和酸进行两次离心操作。所述酸的种类和用量如前所述。 根据本领域常识，将多次离心后所得上清液进行合并。

步骤(1)中，所述的离心的方法和条件为本领域常规的方法和条件。 所述的离心的转速较佳地为5000～15000rpm。所述的离心的时间较佳地为 5～30min。

步骤(1)中，较佳地，将所述上清液先进行定容后再进行步骤(2)的 操作。所述定容的操作过程中，较佳地使用水或乙腈进行定容，更佳地使用 乙腈进行定容。所述定容的终点较佳地为10～25mL/g待测样品，更佳地为 10mL/g待测样品。所述定容的目的是为了使后续进行测试时，用量基本相 同。

步骤(2)中，所述OasisPRiMEHLB固相萃取小柱较佳地为沃特世科 技(上海)有限公司市售产品。

步骤(2)中，所述活化的操作和条件为本领域常规的操作和条件。活 化采用的溶剂种类较佳地为乙腈水溶液。所述乙腈水溶液中，乙腈占水的体 积百分比较佳地为20～90％，更佳地为60％。所述乙腈水溶液的用量为本领 域常规，较佳地为3～10mL，更佳地为4mL。

步骤(2)中，所述上清液在所述固相萃取小柱中的流速为本领域常规 的流速，较佳地为0.025～0.30mL/s，更佳地为0.05mL/s。

步骤(3)中，所述去除溶剂的方法和条件为本领域常规，较佳地使用 平行蒸发仪在20～50℃下浓缩至干，更佳地使用平行蒸发仪在25℃下浓缩至 干。

步骤(3)中，所述乙腈水溶液中，乙腈占水的体积百分比较佳地为1～20％， 更佳地为6％。所述甲醇水溶液中，甲醇占水的体积百分比较佳地为1～20％， 更佳地为6％。

步骤(3)中，所述溶剂A较佳地为乙腈水溶液。所述溶剂A的用量较 佳地为1～2mL/g所述待测样品，更佳地为1mL/g所述待测样品。

步骤(3)中，所述的过滤的方法为采用有机微孔滤膜进行过滤，较佳 地采用孔径为0.22μm或0.45μm的有机微孔滤膜进行过滤。根据本领域常识， 所述的过滤为微滤。

步骤(4)中，所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS) 检测的条件和方法为本领域常规的条件和方法。

步骤(4)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相 色谱法检测的色谱柱较佳地为十八硅烷键合硅胶色谱柱(WaterxselectC₁₈column)。所述的十八硅烷键合硅胶色谱柱的规格较佳地为4.6mm×250mm 或4.6mm×150mm。

步骤(4)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相 色谱法较佳地使用梯度洗脱的方法，流动相A为乙腈，流动相B为甲醇水 溶液。所述流动相B中，甲醇的体积分数较佳地为0.05～1％，更佳地为0.1％。

其中，较佳地，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如表2 所示：

表2

时间min 流动相A％ 流动相B％ 0 10 90 10 70 30 12 95 5 15 95 5

其中，百分比为各组分分别占流动相A和流动相B总体积的体积百分 比。

步骤(4)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相 色谱法检测的柱温较佳地为25～35℃，更佳地为30℃。

步骤(4)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，所述的高 效液相色谱法检测的所述待测样品的流速较佳地为0.3～1.5mL/min，更佳地 为0.9mL/min。

步骤(4)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，所述青霉 噻唑酸的高效液相色谱法检测的检测波长较佳地为225nm。所述脱羧青霉噻 唑酸的高效液相色谱法检测的检测波长较佳地为225nm。

步骤(4)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相 色谱法检测的进样体积较佳地为15-25μL，更佳地为20μL。

步骤(4)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，质谱检测 的条件较佳地为：

定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压如表3所示：

表3

离子源：电喷雾离子源；

扫描模式：正离子模式；

毛细管电压：3500伏；

离子源温度120℃；

去溶剂温度：550℃；

检测方式：多反应监测(MRM)。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发 明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的预处理方法快速、简单、经济、可靠，能够有效地提取出待测 组分，去除复杂基质影响，有益于待测样品的快速检测。而且在保持较高提 取率的同时，节约了有机溶剂的使用、排放和损失，有利于环境保护，节约 了预处理步骤、时间和能耗，具有较强的应用价值。

本发明的检测方法可用于青霉噻唑酸和/或脱羧青霉噻唑酸，且检测方法 快速，简单，精密度高，准确性高。

附图说明

图1为实施例1中高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检 测青霉噻唑酸标准物质的多反应监测(MRM)色谱图。

图2为实施例1中高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检 测脱羧青霉噻唑酸标准物质的多反应监测(MRM)色谱图。

图3为实施例2中高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检 测待测样品B的多反应监测(MRM)色谱图。

图4为实施例2中高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检 测待测样品A的多反应监测(MRM)色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

标准曲线的制备

称取青霉噻唑酸和脱羧青霉噻唑酸标准物质各10mg(精确到0.1mg)， 以乙腈：水(50：50，体积比)配制成浓度1000.0mg/Kg的单标储备溶液， 所有溶液于4℃避光储存。使用前移取适量标准溶液，以空白样品提取液逐 级稀释成混合标准工作溶液，混合标准工作溶液中，青霉噻唑酸和脱羧青霉 噻唑酸的浓度均为10μg/Kg、20μg/Kg、30μg/Kg、40μg/Kg、100μg/Kg、 140μg/Kg、200μg/Kg和400μg/Kg。进样进行高效液相色谱-电喷雾串联二级 质谱(LC-MS/MS)检测，制得标准曲线。

高效液相色谱法检测的条件为：

色谱柱：WaterAtlantisT3C₁₈column(3.0mm×150mm)；

柱温：30℃；

流速：0.6mL/min；

进样体积：20μL；

流动相A：乙腈；

流动相B：水和甲酸的混合液，甲酸的用量为混合液总体积的0.1％；

青霉噻唑酸的检测波长：225nm；脱羧青霉噻唑酸的检测波长：225nm； 梯度洗脱条件见表2：

表2

时间min 流动相A％ 流动相B％ 0 10 90 10 70 30 12 95 5 15 95 5

质谱检测的条件为：

离子源：电喷雾离子源；

扫描模式：正离子模式；

毛细管电压：3500伏；

离子源温度：120℃；

去溶剂温度：550℃；

检测方式：多反应监测(MRM)；

定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压如表3所示：

表3

检测结果：图1为高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检 测青霉噻唑酸标准物质的多反应监测(MRM)色谱图。图2为高效液相色谱- 电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测脱羧青霉噻唑酸标准物质的多反应 监测(MRM)色谱图。

测定图1和图2的峰面积，以浓度X(μg/Kg)为横坐标，峰面积Y为 纵坐标，绘制青霉噻唑酸和脱羧青霉噻唑酸的混合标准溶液工作曲线，得标 准曲线方程及其相关系数，如表4所示。

表4

化合物 线性方程 相关系数R 线性范围 青霉噻唑酸 Y＝188x-1610 0.991 10-200μg/Kg 脱羧青霉噻唑酸 Y＝4374x-10565 0.997 10-200μg/Kg

实施例2

1、待测样品A、B中青霉噻唑酸和脱羧青霉噻唑酸检测方法

(1)分别称取1g(精确至0.01g)原料牛乳(此为空白样品，不含三种 待测组分)作为样品A和样品B，置于10mL聚丙烯离心管中。样品A中加 入实施例1的50μg/Kg混合标准溶液(最终定容后浓度)，混匀，作为待测 样品A。样品B不做任何处理，作为待测样品B。待测样品A和待测样品B 均进行如下处理：加入0.2％甲酸、乙腈3mL，旋涡震荡1min，以5000rpm 的速度离心5min，移取上清液至10mL容量瓶中，再向待测样品中加入0.2％ 甲酸、乙腈4mL，重复以上提取步骤，合并两次提取液，乙腈定容至10mL； 上述百分比均为甲酸占乙腈添加量的体积百分比；

(2)将步骤(1)所得的两份溶液分别进行下述操作：

取OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，用3mL的80％(百分比为乙腈占 水的体积百分比)乙腈水溶液进行活化；将步骤(1)中上清液上样到Oasis PRiMEHLB固相萃取小柱，保持流速0.05mL/s，收集全部流出液，即得预 处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B；

(3)将步骤(2)预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B分 别进行下述操作：

将预处理后的待测样品在25℃下平行蒸发仪浓缩至干，1mL的1％(百 分比为乙腈占水的体积百分比)乙腈水溶液溶解，经0.22μm的有机微孔滤 膜过滤，得进料样品；

(4)将步骤(3)所得两份进料样品分别进行高效液相色谱-电喷雾串 联二级质谱(LC-MS/MS)检测，即可。

高效液相色谱法检测的方法和条件具体与实施例1中相同。

质谱检测的方法和条件具体与实施例1中相同。

2、检测结果

图3为高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测检测待测 样品B的(即不含有任何的待测组分)多反应监测(MRM)色谱图。图4为高 效液相色谱-电喷雾串联二级质谱(LC-MS/MS)检测待测样品A的多反应 监测(MRM)色谱图。分别检测样品A、B各组分相应的峰面积，由于样品B 为空白样品，其峰面积较小，且与杂质峰重叠。由实施例1表4中标准曲线 计算，样品A中各组分含量如表5所述。

表5

实施例3

1、待测样品A、B中青霉噻唑酸和脱羧青霉噻唑酸检测方法

(1)分别称取1g(精确至0.01g)原料牛乳(此为空白样品，不含三种 待测组分)作为样品A和样品B，置于10mL聚丙烯离心管中。样品A中加 入实施例1的30μg/Kg混合标准溶液(最终定容后浓度)，混匀，作为待测 样品A。样品B不做任何处理，作为待测样品B。待测样品A和待测样品B 均进行如下处理：加入0.1％甲酸、乙腈10mL，旋涡震荡5min，以5000rpm 的速度离心5min，移取上清液至25mL容量瓶中，再向待测样品中加入0.1％ 甲酸、乙腈10mL，重复以上提取步骤，合并两次提取液，乙腈定容至25m； 上述百分比均为甲酸占乙腈添加量的体积百分比；

(2)将步骤(1)所得的两份溶液分别进行下述操作：

取OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，用10mL的60％(百分比为乙腈占 水的体积百分比)乙腈清洗；将步骤(1)中上清液上样到OasisPRiMEHLB 固相萃取小柱，保持流速0.025mL/s，收集全部流出液，即得预处理后的待 测样品A和预处理后的待测样品B；

(3)将步骤(2)预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B分 别进行下述操作：

将预处理后的待测样品在20℃下平行蒸发仪浓缩至干，1mL的20％(百 分比为乙腈占水的体积百分比)乙腈水溶液溶解，经0.45μm的有机微孔滤 膜过滤，得进料样品；

(4)将步骤(3)所得两份进料样品分别进行高效液相色谱-电喷雾串 联二级质谱(LC-MS/MS)检测，即可。

高效液相色谱法检测的方法和条件具体与实施例1中相同。

质谱检测的方法和条件具体与实施例1中相同。

2、检测结果

分别检测样品A、B各组分相应的峰面积，由于样品B为空白样品，其 峰面积较小，且与杂质峰重叠。由实施例1表4中标准曲线计算，样品A中 各组分含量如表6所述。

表6

实施例4

1、待测样品A、B中青霉噻唑酸和脱羧青霉噻唑酸检测方法

(1)分别称取4g(精确至0.01g)高钙牛奶(市售产品，此为空白样品， 不含三种待测组分)作为样品A和样品B，置于50mL聚丙烯离心管中。样 品A中加入实施例1的20μg/Kg混合标准溶液(最终定容后浓度)，混匀， 作为待测样品A。样品B不做任何处理，作为待测样品B。待测样品A和待 测样品B均进行如下处理：加入1％乙酸、乙腈20mL，旋涡震荡3min，以 10000rpm的速度离心30min，移取上清液至50mL容量瓶中；再向待测样品 中加入1％乙酸、乙腈20mL，重复以上提取步骤，合并两次提取液，水定容 至50mL；上述百分比均为乙酸占乙腈添加量的体积百分比；

(2)将步骤(1)所得的两份溶液分别进行下述操作：

取OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，用7mL的20％(百分比为乙腈占 水的体积百分比)乙腈水溶液进行活化；将步骤(1)中所得溶液上样到Oasis PRiMEHLB固相萃取小柱，保持流速为0.3mL/s，收集全部流出液，即得预 处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B；

(3)将步骤(2)预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B分 别进行下述操作：

将预处理后的待测样品在50℃平行蒸发仪浓缩至干，用1mL的20％(百 分比为乙腈占水的体积百分比)乙腈水溶液溶解，经0.22μm的有机微孔滤 膜过滤，得进料样品；

(4)将步骤(3)所得两份进料样品分别进行高效液相色谱-电喷雾串 联二级质谱(LC-MS/MS)检测，即可。

高效液相色谱法检测的方法和条件具体与实施例1中相同。

质谱检测的方法和条件具体与实施例1中相同。

3、检测结果

分别检测样品A、B各组分相应的峰面积，由于样品B为空白样品，其 峰面积较小，且与杂质峰重叠。由实施例1表4中标准曲线计算，样品A中 各组分含量如表7所述。

表7

实施例5

1、待测样品A、B中青霉噻唑酸和脱羧青霉噻唑酸检测方法

(1)分别称取5g(精确至0.01g)低乳糖牛奶(此为空白样品，不含三 种待测组分)作为样品A和样品B，置于50mL聚丙烯离心管中。样品A中 加入实施例1的20μg/Kg混合标准溶液(最终定容后浓度)，混匀，作为待 测样品A。样品B不做任何处理，作为待测样品B。待测样品A和待测样品 B均进行如下处理：加入2％乙酸、20mL乙腈，旋涡震荡10min，以15000rpm 的速度离心5min，移取上清液至50mL容量瓶中；再向待测样品中加入1％ 乙酸、20mL乙腈，重复以上提取步骤，合并两次提取液，乙腈定容至50mL； 上述百分比均为乙酸占乙腈添加量的体积百分比；

(2)将步骤(1)所得的两份溶液分别进行下述操作：

取OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，用4mL的90％(百分比为乙腈占 水的体积百分比)乙腈水溶液进行活化；将步骤(1)中所得溶液上样到Oasis PRiMEHLB固相萃取小柱，保持流速为0.2mL/s，收集全部流出液，，即得 预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B；

(3)将步骤(2)预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B分 别进行下述操作：

将预处理后的待测样品在50℃平行蒸发仪浓缩至干，1mL的10％(百 分比为甲醇占水的体积百分比)甲醇水溶液溶解，经0.22μm的有机微孔滤 膜过滤，得进料样品；

(4)将步骤(3)所得两份进料样品分别进行高效液相色谱-电喷雾串 联二级质谱(LC-MS/MS)检测，即可。

高效液相色谱法检测的方法和条件具体与实施例1中相同。

质谱检测的方法和条件具体与实施例1中相同。

2、检测结果

分别检测样品A、B各组分相应的峰面积，由于样品B为空白样品，其 峰面积较小，且与杂质峰重叠。由实施例1表4中标准曲线计算，样品A中 各组分含量如表8所述。

表8

实施例6

1、待测样品A、B中青霉噻唑酸和脱羧青霉噻唑酸检测方法

(1)分别称取1g(精确至0.01g)原料羊乳(此为空白样品，不含三种 待测组分)作为样品A和样品B，置于10mL聚丙烯离心管中。样品A中加 入实施例1的50μg/Kg混合标准溶液(最终定容后浓度)，混匀，作为待测 样品A。样品B不做任何处理，作为待测样品B。待测样品A和待测样品B 均进行如下处理：加入1.2％甲酸、乙腈5mL，旋涡震荡10min，以15000rpm 的速度离心5min，移取上清液至25mL容量瓶中；再向待测样品中加入0.8％ 甲酸、乙腈5mL，重复以上提取步骤，合并两次提取液，乙腈定容至25mL； 上述百分比均为甲酸占乙腈添加量的体积百分比；

(2)将步骤(1)所得的两份溶液分别进行下述操作：

取OasisPRiMEHLB固相萃取小柱，用3mL的80％(百分比为乙腈占 水的体积百分比)乙腈水溶液进行活化；将步骤(1)中所得溶液上样到Oasis PRiMEHLB固相萃取小柱，保持流速为0.2mL/s，收集全部流出液，即得预 处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B；

(3)将步骤(2)预处理后的待测样品A和预处理后的待测样品B分 别进行下述操作：

将预处理后的待测样品在20℃下平行蒸发仪浓缩至干，1mL的10％(百 分比为甲醇占水的体积百分比)甲醇水溶液溶解，经0.22μm的有机微孔滤 膜过滤，得进料样品；

(4)将步骤(3)所得两份进料样品分别进行高效液相色谱-电喷雾串 联二级质谱(LC-MS/MS)检测，即可。

高效液相色谱法检测的具体方法和条件与实施例1中相同。

质谱检测的具体方法和条件与实施例1中相同。

2、检测结果

分别检测样品A、B各组分相应的峰面积，由于样品B为空白样品，其 峰面积较小，且与杂质峰重叠。由实施例1表4中标准曲线计算，样品A中 各组分含量如表9所述。

表9

效果实施例1

检出限的测定

将实施例1中浓度为10μg/Kg混合标准工作溶液摇匀，进样10μL，按 实施例1中LC-MS/MS条件分析。信噪比S/N＝3时下平行蒸发仪浓缩至干 的检出限，以及信噪比S/N＝10时，青霉噻唑酸和脱羧青霉噻唑酸的定量限 如表10所示。

表10

化合物 检出限 定量限 青霉噻唑酸 5μg/Kg 10μg/Kg 脱羧青霉噻唑酸 3μg/Kg 5μg/Kg

效果实施例2

精密度的测定

取6份实施例1中制备的30μg/Kg的混合标准工作溶液，作为样品液， 每次进样10μL，重复进样8次，按实施例1中LC-MS/MS的条件进行分析。 具体测量结果如表11所示。测定各次的峰面积A，RSD为9.86％(n＝6)， 表明精密度良好。

RSD为相对标准偏差(relativestandarddeviation)，指标准偏差与计算 结果算术平均值的比值。

表11

效果实施例3

稳定性的测定

将实施例1中制备的浓度为100μg/Kg的混合标准工作溶液，连续进样8 次，测定青霉噻唑酸和脱羧青霉噻唑酸的峰面积，外标法定量，计算其浓度， 其结果如表12所示，RSD值为3.25％，表明检测方法稳定性良好。

RSD为相对标准偏差(relativestandarddeviation)，指标准偏差与计算 结果算术平均值的比值。

表12

效果实施例4

本实施例用于证明本发明预处理方法的准确性(测定其回收率)，其结 果如表13所述。

取三组同样的普通牛奶(市售产品)，编号为1、2、3。其中，编号1 为空白样品，不做任何处理；编号2中的牛奶分别加入实施例1的40μg/Kg 的青霉噻唑酸标准溶液1mL、实施例1的40μg/Kg的脱羧青霉噻唑酸标准溶 液1mL；编号3中的牛奶分别加入实施例1的400μg/Kg的青霉噻唑酸标准 溶液1mL和实施例1的400μg/Kg的脱羧青霉噻唑酸标准溶液1mL。将上述 3组分别进行如实施例2中的预处理，按照实施例1中LC-MS/MS进行分析， 上述3组分别重复进样5次，取平均值。计算其回收率，得到结果如表13 所示。

表13加标回收率实验结果

注明：N表示未检出。