一种水生动物的基础代谢状况的测定方法

摘要

本发明公开了一种基于麻醉呼吸率的水生动物基础代谢状况的测定方法，具体包括以下步骤：1)氧电极呼吸仪的预热及校准；2)麻醉状态下的水生动物呼吸速率的测定；3)数据处理分析及基础代谢状况测定。本发明通过测定麻醉状态下水生动物的呼吸代谢速率，来测定不同生长阶段及营养背景下水生动物的基础代谢状况，方法简便，易于操作。本发明首次提出麻醉状态下水生动物的呼吸速率测定方法，采用本发明提供的方法测定水生动物的氧消耗率灵敏度高、可以连续测量，且测定的数据更加稳定、可靠，减少了实验次数，节约了时间和劳动力成本，提高了工作效率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种水生动物的基础代谢状况的测定方法，具体涉及一种基于麻醉状态下利用氧电极测定呼吸速率来测定水生动物基础代谢状况的方法。

背景技术

基础代谢率是指生物体在清醒而又极端安静的状态下，不受肌肉活动、环境温度、食物及精神状态等的影响时，测得的单位时间内生物体能量消耗的水平，通常以氧消耗率为指标。一般通过单位时间内水中氧气的减少量来判定水生动物的呼吸速率。传统方法采用碘量法(GB/T74689-1987)来计算呼吸速率。但是碘量法操作过程复杂，耗时长，并且在麻醉情况下，水生动物呼吸微弱，不易测定，用碘量法很难检测。

近年来，由于氧电极探头的可实时跟踪测量和简便易行的特点，其被越来越广泛地用于测定呼吸率。氧电极实际上是一个电化学电池，由镶嵌在绝缘材料上的银极和铂极构成。银极为阳极，一般制成圆环状，作为参比电极，银极的面积要尽可能大一些，以降低电机表面电流密度，减少阳极的极化现象，使其电机电位不受外加电压的影响。铂极为阴极，一般制成圆点状，位于银极的中央，电解反应即发生在铂极上。在电极的表面用15～20μm的聚乙烯或聚四氟乙烯薄膜覆盖，在电极与薄膜之间充以氯化钾溶液作为电解质。由于水中溶解氧能透过薄膜而电解质不能透过，因而排除了被测溶液中各种离子电解反应的干扰，成为测定溶解氧的专用性电极。线粒体呼吸测定仪即为传统意义上的液相氧电极，它具有灵敏度高、反应快、可以连续测量、记录，能够追踪反应的动态变化过程等优点。

近年来，已有报道将氧电极呼吸仪应用于水生动物的代谢速率的研究。然而，这些研究中的水生动物均在清醒状态下测定。由于水生动物易受人类操作的惊吓从而造成应激，导致呼吸耗氧率极不稳定，往往需要大量实验动物进行多次重复操作才能得到可靠的数据，造成时间和动物的浪费。

同时，由于麻醉状态下鱼体呼吸极其微弱，用传统的碘量法很难测定水体中氧气含量的变化，因此目前尚无测定鱼体基础代谢速率的方法。本发明，利用氧电极，通过改变各种实验条件，从而找到一种鱼体基础代谢速率的测定方法。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明首次创新地提出了一种基于麻醉状态下，测定水生动物的呼吸耗氧率来测定水生动物的基础代谢状况的方法，采用氧电极法，利用氧电极呼吸仪测定麻醉状态下不同生长阶段或不同营养背景的水生动物的呼吸速率，并建立一套基于麻醉动物的呼吸速率对水生动物的基础代谢状况进行测定的方法，本发明的方法在国内外尚未见报道。

本发明提出了一种水生动物的基础代谢状况的测定方法，即基于麻醉呼吸速率的水生动物代谢状况的测定方法，采用在麻醉状态下利用呼吸仪快速，简便地测定水生动物的呼吸速率，来测定水生动物的基础代谢状况。

其中，所述方法包括以下步骤：

1)氧电极呼吸仪的预热和校准；

2)麻醉状态下水生动物呼吸速率的测定；

3)数据处理分析及基础代谢状况测定。

具体地，所述方法包括：

1)呼吸仪的预热和校准；包括以下步骤：打开氧电极呼吸仪，预热1小时；仪器校准：设定水温后，分别用曝气的蒸馏水和饱和亚硫酸钠溶液校准最高点(电流值>200pA)和零点(电流值2pA)。

2)水生动物的呼吸速率的测定，包括：

水生动物的麻醉处理，包括：配置200g/L的MS222母液，再稀释成100-300mg/L的MS222处理溶液，将待处理水生动物放入配置好的麻醉剂中，如鱼类，约3～5分钟后，未见明显鳃张合，并且实验结束后，放入清水中，水生动物恢复游动，则认为麻醉起效。

水生动物的呼吸速率的测定：在内径为10cm、有效容积为700ml的2个水罐底部放入转子并铺上隔网后分别注入650ml的麻醉剂，置于磁力搅拌器上。打开磁力搅拌器，根据水生动物体大小设定转速为80-120r/min，保证两组水罐中转子的转速一致，并且水流转动但不会影响到静躺在隔网上的麻醉的水生动物。盖紧盖子，将探头从盖子中间的小孔插入到水下3cm处；；待2个氧电极读数稳定后，记录数据10min。实验结束后，取出氧电极探头于清水中保存，打开盖子，取出水生动物，如鱼类，擦干后称量水生动物体重，重复2次，即每组4个平行。

其中，水生动物的投加比例，即有效容积为700ml的水罐中投加的水生动物的重量为2.5～20g。

3)结果计算分析及代谢状况测定，包括：鱼的氧消耗率以呼吸速率表示，其呼吸速率按照如下公式计算：

呼吸速率＝(初氧气浓度‐终氧气浓度)╳麻醉剂体积/测量时间/水生动物总重量

氧气浓度：mg/L，水体积：L，测量时间：h，体重：g；

呼吸速率是通过氧电极呼吸仪测定出的氧变化曲线，截取测定时间段，自动计算出该段曲线斜率，即耗氧率(即氧气的减少量)，是一个负值，变为正数后即是呼吸速率。这个公式算出来的，和软件算出来的值一样。呼吸速率大的表明，基础代谢速率高，反之，呼吸速率小的表明基础代谢速率低。

其中，所述呼吸仪为氧电极呼吸仪。所述初始氧浓度为9.2-10.8mg/L。

优选地，所述水生动物可以为任意一种或几种水生动物的组合，如罗非鱼、斑马鱼、鲫鱼、石斑鱼等中的任意一种或几种组合，优选为罗非鱼、斑马鱼中的任意一种或两种。

作为本发明的一个优选实施例，所述水生动物的重量为0.2-10g/只，优选为0.35-8.5g/只。

作为本发明的一个优选实施例，步骤1)中所述麻醉为MS222麻醉剂麻醉。

作为本发明的一个优选实施例，麻醉水生动物的麻醉剂与水罐中的麻醉剂组成、浓度均相同。

作为本发明的一个优选实施例，所述麻醉剂可以为挥发性麻醉剂、非挥发性麻醉剂、中药麻醉剂中的任意一种或几种组合，优选为非挥发性麻醉剂中的任意一种或几种组合，如间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS222)、苯巴比托钠、氨基甲酸乙酯和水合氯醛中的任意一种或几种组合。

作为本发明的一个优选实施例，所述麻醉剂的浓度为100-300mg/L，优选为100-200mg/L，如应用于2.5-9g体重的罗非鱼的MS222处理溶液浓度为200mg/L，应用于0.35-0.45g体重斑马鱼的MS222处理溶液浓度为100mg/L。

作为本发明的一个优选实施例，所述水生动物的氧消耗率以呼吸速率表示，所述呼吸速率的计算公式为：呼吸速率＝(初氧气浓度‐终氧气浓度)╳麻醉剂体积/测量时间/水生动物总重量；

其中，所述初氧气浓度为开始记录时液体中的氧气浓度，所述末氧气浓度为记录结束时液体中的氧气浓度。

作为本发明的一个优选实施例，所述磁力搅拌器的转动使水流转动且不阻碍水生动物的游动或不影响麻醉的水生动物。

作为本发明的一个优选实施例，所述磁力搅拌器的转速为60-180r/min，如160r/min；优选为80-150r/min，如80r/min、120r/min。

作为本发明的一个优选实施例，所述水罐的形状为圆柱形、内径为8-15cm，有效容积为700ml。

具体地，本发明的方法包括以下步骤：

1)呼吸仪的预热和校准；包括以下步骤：打开氧电极呼吸仪，预热1小时；仪器校准：设定水温后，分别用曝气的蒸馏水和饱和亚硫酸钠溶液校准最高点(电流值>200pA)和零点(电流值2pA)；

2)水生动物的呼吸速率的测定，包括：

水生动物的麻醉处理：配置200g/L的MS222母液，再稀释成100-300mg/L的MS222处理溶液，将待处理鱼放入配置好的麻醉剂中，3-5分钟后，未见明显鳃张合，并且实验结束后，放入清水中，鱼恢复游动，则认为麻醉起效。

量取曝气的水于水罐中；水罐放在磁力搅拌器上，将对照组和处理组的水生动物分别放入两个罐中，将探头从盖子中间孔插入水下；打开磁力搅拌器，保证两个水罐中转子速度一致；待两个氧电极读数都稳定后，开始记录。取出水生动物，擦干后测体重，重复四次。

在测量麻醉状态下水生动物的呼吸速率时，需先配置MS222的麻醉剂母液，再稀释1000倍为麻醉剂处理液，将处理组的水生动物放入配置好的麻醉剂中麻醉后，放入罐中进行测量，罐中注满同样的麻醉剂溶液。记录10-15分钟后即可停止，重复四次。

3)数据处理分析及基础代谢状况测定，包括：数据分析：打开保存的文件，输入对应罐中待测水生动物的体重(g)，以及盛装水的体积(L)；在记录版面选取测定起始时间和终止时间，点击“calculate”，即自动计算出耗氧率(mg/g.h)。

呼吸速率＝(初氧气浓度‐终氧气浓度)╳麻醉剂体积/测量时间/水生动物总重量

氧气浓度：mg/L，水体积：L，测量时间：h，体重：g；

呼吸速率大的表明，基础代谢速率高，反之，呼吸速率小的表明基础代谢速率低。

更具体地，本发明的方法包括以下步骤：

1)打开氧电极呼吸仪，预热1小时；

仪器校准：设定水温后，分别用曝气的蒸馏水和饱和亚硫酸钠溶液校准最高点(电流值>200pA)和零点(电流值2pA)；

2)呼吸速率的测定：量取曝气24h的水650ml于内径为10cm的圆柱形水罐中，放入转子并在罐底铺上隔网；水罐放在磁力搅拌器上，从对照组和处理组各取一条鱼放于罐中，盖紧盖子，将探头从盖子中间孔插入水下约3cm；打开磁力搅拌器，转速为80-120r/min，保证两个水罐中转子速度一致，水流转动且不会较大阻碍鱼的游动；待2个氧电极读数都稳定后，开始记录10分钟。保存文件后，取出探头于清水中保存，打开盖子，取鱼，擦干后测体重。重复四次。

在测量麻醉状态下鱼的呼吸速率时，需先配置200g/L的MS222母液，再稀释1000倍×200mg/LMS222(或2000倍×100mg/L)处理溶液，将待处理鱼放入配置好的麻醉剂中，约5分钟后，未见明显鳃张合，即可放入罐中进行测量，罐中注满同样的麻醉剂溶液。由于麻醉状态下，鱼的呼吸速率较弱，所以若罗非鱼体重在2.8g左右需放入5条，8.7g左右则需放入3条，斑马鱼需放入8条。记录10-15分钟后即可停止。重复四次。

3)数据分析：打开保存的文件，输入对应罐中待测鱼的体重(g)，以及盛装水的体积(L)；在记录版面选取测定起始时间和终止时间，点击“calculate”，即自动计算出耗氧率(mg/g.h)。

呼吸速率＝(初氧气浓度‐终氧气浓度)╳麻醉剂体积/测量时间/水生动物总重量

本发明还提出了一种测定系统，包括氧电极呼吸仪、水罐和磁力搅拌器。

本发明的另一个目的在于提供麻醉状态下测定水生动物基础代谢状况的方法的应用，所述方法可用于测定不同种类以及不同营养状态下水生动物基础代谢速率，从而可预测水生动物体本身的健康与代谢水平，以反映其对于所摄入营养素的代谢情况，以及对于生长环境如水质溶氧的要求。

本发明还提出了一种测定系统，其特征在于，包括氧电极呼吸仪、水罐和磁力搅拌器，其中，水罐底层放有网状隔层，用于防止水生动物游到罐底而被转子打伤或者影响到静躺在隔网上的麻醉的水生动物。

本发明的有益之处在于：采用本发明提供的方法测定水生动物的氧消耗率灵敏度高、可以连续测量，且测定的数据更加稳定、可靠，减少了实验次数，节约了时间和劳动力成本，提高了工作效率。本发明提供的测定方法可以用以测定水生动物不同生长阶段及营养背景下的基础代谢状况。

本发明的有益效果在于：本发明提出的麻醉状态下水生动物的呼吸速率测定方法，灵敏度高、可以连续测量，且测定的数据更加稳定、可靠，减少了实验次数，节约了时间和劳动力成本，提高了工作效率。

附图说明

图1为不同大小罗非鱼体重。

图2为正常生理情况下，不同大小罗非鱼在水中溶解氧浓度的变化曲线(A)及呼吸速率(B)。

图3为麻醉状态下，不同大小罗非鱼在水中溶解氧浓度的变化曲线(A)及呼吸速率(B)。

图4为正常状态下，高脂和饥饿处理组斑马鱼水中溶解氧曲线(A)及呼吸速率(B)。

图5为麻醉情况下，高脂和饥饿处理组斑马鱼水中溶解氧曲线(A)及呼吸速率(B)。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实例1测定不同大小罗非鱼基础代谢状况

1)打开氧电极呼吸仪，预热1小时；

仪器校准：设定水温后，分别用曝气的蒸馏水和饱和亚硫酸钠溶液校准最高点(电流值>200pA)和零点(电流值2pA)。可先将氧电极安装在测细胞液的小罐中校准，校准最高点后，可直接在小罐中加入固体亚硫酸钠，自动搅拌溶解后，校准零点；

2)水生动物的麻醉处理；

3)水生动物的呼吸速率的测定：

量取曝气24h的水650ml于内径为10cm的圆柱形水罐中；水罐放在磁力搅拌器上，从对照组和处理组各取一条鱼放于罐中，盖紧盖子，将探头从盖子中间孔插入水下约3cm；打开磁力搅拌器，转速为120转/分钟，保证两个水罐中转子速度一致，水流转动且不会阻碍鱼的游动；待2个氧电极读数都稳定后，开始记录10分钟。保存文件后，取出探头于清水中保存，打开盖子，取鱼，擦干后测体重。重复上述实验步骤，保证每组有4个重复。

麻醉状态下罗非鱼呼吸速率的测定：需先配置200g/L的MS222母液，再稀释1000倍成200mg/LMS222处理溶液，将待处理鱼放入配置好的麻醉剂中，约5分钟后，未见明显鳃张合，即可放入罐中进行测量，罐中注满同样的麻醉剂溶液。由于麻醉状态下，鱼的呼吸速率较弱，所以小罗非鱼(2.7g左右)需放入5条，大罗非鱼(8.7g左右)需放入3条。待溶解氧曲线趋于平稳后，开始测量10分钟。测量结束后，称量鱼的体重。重复上述实验步骤，保证每组有4个重复。

4)结果计算分析及代谢状况测定

打开保存的文件，输入对应呼吸罐中待测鱼的体重(g)，以及盛装水的体积(L)；在记录版面选取测定起始时间和终止时间，点击“calculate”，即自动计算出耗氧率(mg/g.h)。

呼吸速率＝(初氧气浓度‐终氧气浓度)╳麻醉剂体积/测量时间/水生动物总重量

氧气浓度：mg/ml；水体积：L；测量时间：h；体重：g

从图2A中可以看出，水中氧气浓度随着时间逐渐减小，换算成呼吸速率后，得到图2B中柱形图，可以看出正常状态小罗非鱼呼吸速率高于大罗非鱼呼吸速率。同样地，图3A中，水中氧气浓度缓慢下降，换算成呼吸速率后得到图3B中柱形图，可以看出麻醉后小罗非鱼的呼吸速率高于大罗非鱼呼吸速率。这表明小鱼的基础代谢率高于大鱼。

实施例2不同营养背景下，斑马鱼代谢状况的测定

选取雌性斑马鱼96条，分为3组，每组32条。其中2组分别用脂肪含量为13％(高脂组)和7％(对照组)饲料饲喂，剩余1组(饥饿组)不饲喂。一周后测定各组斑马鱼呼吸速率，具体方法如实施例1中步骤1-4。其中，测定正常状态下斑马鱼的呼吸速率时，每个呼吸罐中需放入4条斑马鱼，测定10分钟，重复四次；麻醉状态下，每个呼吸罐中放入8条斑马鱼，测定15分钟。重复上述实验步骤，保证每组有4个重复。

图4A中，水中氧气浓度随着时间逐渐下降，其中饥饿组较对照组和高脂组下降缓慢，对照组和饥饿组下降速率大体相当。换算成呼吸速率后，得到图4B柱形图，可以看出正常状态下对照组和高脂组斑马鱼呼吸速率高于饥饿组，而高脂组和对照组之间没有明显区别。同样地，图5A中，水中氧气浓度随着时间逐渐下降，其中饥饿组下降较为平缓，对照组和饥饿组下降速率大体相当，换算成呼吸速率后，得到图5B柱形图，可以看出麻醉状态下对照组和高脂组斑马鱼呼吸速率高于饥饿组，而高脂组和对照组没有明显区别。这表明，饥饿一周会显著降低斑马鱼基础代谢率，而13％高脂饲喂一周对斑马鱼基础代谢率基本没有影响。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。