用于治疗和预防脑卒中或缺血、阿尔茨海默病和帕金森病和肌萎缩性侧索硬化的甾族硝酮

摘要

本发明涉及神经保护性抗氧化甾族硝酮(血脑屏障对其是高度可渗透的)，其作为用于治疗脑卒中或缺血、阿尔茨海默病和帕金森病和肌萎缩性侧索硬化的潜在药物。

说明书

技术领域

本发明涉及医学领域，特别地涉及甾族硝酮(steronitronas)用于治 疗和预防脑卒中或缺血、阿尔茨海默病和帕金森病和肌萎缩性侧索硬化的 用途。

背景技术

已知脂质细胞膜氧化是卒中过程中发生的最重要的药理学事件之一， 其导致和转化为脑组织和神经元的死亡(Brouns，R.；DeDeyn，P.P.The complexityofneurobiologicalprocessesinacuteischemicstroke.Clin. Neurol.Neurosurg.2009，111，483-495)。因此，对于治疗卒中最活跃的研 究领域之一集中在寻找新的具有强抗氧化能力和强神经保护作用的可渗 透剂，其能够阻断多种类型的氧自由基(ROS)，而氧自由基是由卒中引 起的氧化应激的原因，卒中是发达社会中严重且迅速增长的病理状况，对 其没有有效的治疗，并且其为继癌症、冠心病和阿尔茨海默病之后的第四 大死因(Chan，P.H.Theroleofoxygenradicalsinbraininjuryandedema， inChowCK(编辑)：CellularAntioxidantDefenseMechanisms，第3卷. BocaRaton，Florida，CRCPress，Inc，1988，第89-109页)。事实上，神 经元的膜富含多不饱和脂肪酸，其对于在邻近双键位置处的羟基类、过氧 基类和超氧化物类ROS的作用特别敏感，生成能够产生新的自由基链反 应的非常活泼的烯丙基自由基，即，新的更复杂的自由基，或与金属(例 如铁)相互作用以生成新的甚至更有毒有害的自由基。

因此，基于ROS捕获和阻断剂之发生的用于针对卒中的策略是有持 久兴趣的研究领域。

正是在这样的背景下，其中硝酮类有机化合物在过去三十年中由于其 结构和特性而发挥了关键作用，但遗憾的是，在广泛的所述化合物已经进 行的许多临床测定中，其假定的有利活性还远远没有被证实(Floyd，R.A.； Kopke，R.D.Choi，C.H.；Foster，S.B.；Doblas，S.；Towner，R.A.Nitrones astherapeutics.FreeRadic.Biol.Med.2008，45，1361-1374)。

在这个意义上，(Z)-α-苯基-N-叔丁基硝酮(PBN)抑制脂蛋白氧化 (Kalyanaraman，B.；Joseph，J.；Parthasarathy，S.Thespintrap， α-phenylN-tert-butylnitrone，inhibitstheoxidativemodificationoflow densitylipoproteinFEBSLett.1991，280，17-20)，降低红细胞中的氧化性 损伤、由于苯肼的脂质过氧化(Hill，H.A.；Thornalley，P.J.Theeffectof spintrapsonphenylhydrazine-inducedhaemolysis.Biochim.Biophys. Acta1983，762，44-51)，并保护大鼠免受缺血和MPTP毒性(Margaill，I.； Plotkine，M.；Lerouet，D.Antioxidantstrategiesinthetreatmentofstroke. Free.Radic.Biol.Med.2005，39，429-443)。

硝酮NXY-059(Kuroda，S.；Tsuchidate，R.；Smith，M.L.；Maples，K. R.；Siesjo，B.K.Neuroprotectiveeffectsofanovelnitrone，NXY-059，after transientfocalcerebralischaemiaintherat.J.Cereb.BloodFlowMetab. 1999，19，778-787)是极好的神经保护性ROS捕获剂，但是它在临床试验 中屡次失败(Macleod，M.R.；vanderWorp，H.B.；Sena，E.S.；Howells，D. W.；Dirnagl，U.；Donnan，G.A.EvidencefortheefficacyofNXY-059in experimentalfocalcerebralischaemiaisconfoundedbystudyquality. Stroke2008，39，2824-2829)。

尽管如此，并未停止寻找最佳硝酮的努力[(a)Goldstein，S.；P. Lestage，P.Chemicalandpharmacologicalaspectsofheteroaryl-nitrones. Curr.Med.Chem.2000，7，1255-1267；(b)Dias，A.G.；Santos，C.E.；Cyrino， F.Z.；Bouskela，E.；Costa，P.R.N-tert-ButylandN-methylnitrones derivedfromaromaticaldehydesinhibitmacromolecularpermeability increaseinducedbyischemia/reperfusioninhamsters.Bioorg.Med.Chem. 2009，17，3995-3998；(c)Porcal，W.；P.Hernández，P.；González，M.； Ferreira，A.；Olea-Azar，C.；Cerecetto，H.；Castro，A.Heteroarylnitrones asdrugsforneurodegenerativediseases：Synthesis，neuroprotective properties，andfreeradicalscavengerproperties.J.Med.Chem.2008，51， 6150-6159；(d)Kim，S.；Bouajila，J.；Dias，A.G.；Cyrino，F.Z.；Bouskela， E.；Costa，P.R.；Nepveu，F.α-Phenyl-N-tert-butylnitrone(PBN) derivatives：Synthesisandprotectiveactionagainstmicrovascular damagesinducedbyischemia/reperfusion.Bioorg.Med.Chem.2007，15， 3572-3578；(e)Balogh，G.T.；Vukics，K.；Konczol，A.；Kis-Varga，A.；Gere， A.；Fischer，J.Nitronederivativesoftroloxasneuroprotectiveagents. Bioorg.Med.Chem.Lett.2005，15，3012-3015；(f)Becker，D.A.；Ley，J.J.； Echegoyen，L.；Alvarado，R.Stilbazulenylnitrone(STAZN)：A nitronyl-substitutedhydrocarbonwiththepotencyofclassicalphenolic chain-breakingantioxidants.J.Am.Chem.Soc.2002，124，4678-4684；(g) Dhainaut，A.；Tizot，A.；Raimbaud，E.；Lockhart，B.；Lestage，P.； Goldstein，S.Synthesis，structure，andneuroprotectivepropertiesofnovel imidazolylnitrones.J.Med.Chem.2000，43，2165-2175]。

另一方面，甾体是具有公认的生物活性的有机化合物，其中其在影响 中枢神经系统的炎性过程(且转化成神经性疾病，例如脑缺血、阿尔茨海 默病和帕金森病和肌萎缩性侧索硬化)中充当神经保护剂的能力突出。

附图简述

图1示出了在再灌注过程中添加1μM或5μM的胆固醇硝酮 (colesteronitrona)F2(而非胆固醇硝酮F3)如何显著地提高了神经元 的生存力，且在5μM浓度时几乎达到了对照值(对于1μM或5μM的胆 固醇硝酮F2分别为89.1％和95.5％；ANOVA，p＜0.0001和p＜0.01，与 R24h相比的Dunnett事后检验)。

图2示出了R5d实验如何诱导了细胞生存力更显著的降低(77.7％； 相对于100％的对照，p＜0.0001，单样本t-检验)。

图3示出了在实验后5天(R5d)，用胆固醇硝酮F2处理的动物在 CA1区(CA1)如何显示出凋亡性死亡的显著降低(对于分别用盐水溶 液和胆固醇硝酮F2处理的动物，每个视野为70.4±2.4个细胞与55.1±3.4 个细胞；ANOVA，p＜0.0001和p＜0.01，Newman-Keuls事后检验)。

图4示出了在CA1区、大脑皮层和外侧皮质中用载体处理的动物 (R5d)的脑切片如何比用胆固醇硝酮处理的动物的脑切片显示出更高水 平的TUNEL阳性细胞。因此，结果表明，在再灌注后5天(R5d)，在 用胆固醇硝酮F2处理的动物的CA1区中神经元凋亡性死亡显著降低(对 于分别用载体和胆固醇硝酮处理的动物，每个视野64.1±7.1个与48.5±0.4 个细胞核；ANOVA，p＜0.0001和p＜0.01，根据Newman-Keuls事后检验)。

图5示出了暴露于OGD和用指定浓度的F2、F3和F2∶F3混合物(以 1∶1的比例，F2+F3)处理的神经元培养物中神经元的生存力。在恢复期 开始时添加F2和/或F3。恢复后24小时评价神经元的生存力。

发明内容

在旨在合成用于治疗卒中的新的硝酮并对其进行生物学评价的近期 研究的背景下[(a)Abdelouahid，S.；Soriano，E.；Revuelta，J.；Valderas，C.； Chioua，M.；Garrido，I.；Bartolomé，B.；Tomassolli，I.；Ismaili，L.； González-Lafuente，L.；Villarroya，M.；García，A.G.；Oset-GasqueM.J.； Marco-Contelles，J.Synthesis，structure，theoreticalandexperimentalin vitroantioxidant/pharmacologicalpropertiesofα-aryl，N-alkylnitrones， aspotentialagentsforthetreatmentofcerebralischemia.Bioorg.Med. Chem.2011，19，951-960；(b)Chioua，M.；Sucunza，D.；Soriano，E.； Hadjipavlou-Litina，D.；Alcázar，A.；Ayuso，I.；Oset-Gasque，M.J.； González，M.P.；Monjas，L.；Rodríguez-Franco，M.I.；Marco-Contelles， J.；Samadi，A.α-Aryl-N-alkylNitrones，asPotentialAgentsforStroke Treatment：Synthesis，TheoreticalCalculations，Antioxidant， Anti-inflammatory，NeuroprotectiveandBrain-BloodBarrier PermeabilityProperties，J.Med.Chem.2012，55，153-168；(c)Arce，C.； Díaz-Castroverde，S.；Canales，M.J.；Marco-Contelles，J.；Samadi，A.； Oset-Gasque，M.J.；González，M.P.Drugsforstroke：Actionof nitrone(Z)-N-(2-bromo-5-hydroxy-4-methoxybenzylidene)-2-methylpropa n-2-amineoxideonratcorticalneuronsinculturesubjectedto oxygen-glucose-deprivation.Eur.J.Med.Chem.2012，55，475-479]，以及基 于上述的当前的现有技术，在实验室中已经开发了将“甾体”基序和另外的 “硝酮”基序相组合和并列的杂合分子，从而产生新的称为为“甾族硝酮” 的化学实体。

尽管甾族硝酮已为人所知多年[(a)Weintraub，P.M.；Tiernan，P.L. Steroidalnitrones，J.Org.Chem.1974，39，1061-1065；(b)Joseph，S.P.， Dhar，D.N.Reactionofchlorosulfonylisocyanatewithnitrones：An efficientmethodforthesynthesisofcyclicenamidesand2H-pyrroles. Tetrahedron1988，44，5209-5214；(c)Hwu，J.R.；Khoudary，K.P.；Tsay， S.-C.Selectivityofthebulkyproton-containingreagent N-methyl-N，O-bis(trimethylsilyl)hydroxylamineintheformationof nitrones，J.OrganometallicChem.1990，399，C13-C17；(d)Barton，D.H. R.；Day，M.J.；Hesse，R.H.Anewrearrangementofketonicnitrones：A convenientalternativetotheBeckmannrearrangement.J.Chem.Soc.； PerkinTrans.1975，1764-1767；(e)Barton，D.H.R.；Choi，L.S.L.； Lister-James，J.；Hesse，R.H.Preparationandreactionsofsteroidal cross-conjugated3-nitrones.J.Chem.Soc.；PerkinTrans.1982， 2599-2606]，但出乎意料的是，在针对给定疾病的有限治疗中，其药理活 性和可能的应用没有被开发和研究[(a)Blasig，L.E.；Mertsch，K.； Haseloff，R.F.Nitronylnitroxides，anovelgroupofprotectiveagents againstoxidativestressinendothelialcellsformingthe blood-brain-barrier，Neuropharmacology2002，43，1006-1014；(b) Robinson，A.J.；ofLucca，I.；Drummond，S.；Bosewell，G.A.Steroidal nitroneinhibitorsof5-reductase，TetrahedronLett.2003，44，4801-4804。

因此，本专利描述了式Ia-c的神经保护性抗氧化甾族硝酮及其E和Z 几何异构体(血脑屏障对其是高度可渗透的)作为用于治疗脑卒中或缺血、 阿尔茨海默病和帕金森病和肌萎缩性侧索硬化的潜在药剂和药物的用途， 且其中，

R¹独立地表示经取代或未取代的C1-C10烷基，α-羟基酮，α-甲基酮，或 羟基，卤素，具有经取代或未取代的C1-C10烷基的醚，具有经取代或未 取代的C1-C10烷基的伯胺、仲胺，具有两个经取代或未取代的C1-C10 烷基的叔胺；

R²表示氢原子，经取代或未取代的C1-C10烷基，羟基，卤素，具有经取 代或未取代的C1-C10烷基的醚，具有经取代或未取代的C1-C10烷基的 伯胺、仲胺，具有两个经取代或未取代的C1-C10烷基的叔胺，或酰氧基 (OCOX)，其中X可以是经取代或未取代的C1-C10烷基，苯基，或经卤 素、硝基、氰基、氨基或具有经取代或未取代的C1-C10烷基的醚基取代 的芳环，杂环的吡咯、吡啶、吲哚、呋喃或噻吩(tiofeno)环；

R³表示氢原子，或酰氧基(OCOX)，其中X可以是经取代或未取代的 C1-C10烷基，苯基，或经卤素、硝基、氰基、氨基或具有经取代或未取 代的C1-C10烷基的醚基取代的芳环，杂环的吡咯、吡啶、吲哚、呋喃或 噻吩环；并且

R⁴表示甲基、叔丁基或苄基。

该化合物家族的常规但非限制性的实例是：

-(E)-N-((8S，9S，10R，13R，14S，17R)-10，13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2- 基)-7，8，9，11，12，13，14，15，16，17-十氢-1H-环戊烷并[a]菲-3(2H，6H，10H)-亚基) 甲胺氧化物(F2)，和

-(Z)-N-((8S，9S，10R，13R，14S，17R)-10，13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2- 基)-7，8，9，11，12，13，14，15，16，17-十氢-1H-环戊烷并[a]菲-3(2H，6H，10H)-亚基) 甲胺氧化物(F3)，

它们根据下面的方案由4-胆甾烯-3-酮或5-胆甾烯-3-酮通过与N-甲基羟胺 反应制备。

此外，在整个本发明中作为实例提到的任何化合物可以单独或组合使 用，特别是用作与适用于治疗神经性疾病(例如脑缺血、阿尔茨海默病、 帕金森病和肌萎缩性侧索硬化)的一线治疗同时、交替或相继施用的辅助 治疗。在这个意义上，式Ia-c的甾族硝酮与血栓溶解剂同时、交替或相 继施用导致了特别适合用于治疗脑缺血(特别是急性脑缺血)的治疗。

因此，本发明的一个方面涉及组合物，其包含式Ia-c的甾族硝酮衍 生物及其在双键R⁴N(O)＝C(3)处的E和Z几何异构体，

其中R¹独立地表示经取代或未取代的C1-C10烷基，α-羟基酮，α-甲基酮， 或羟基，卤素，具有经取代或未取代的C1-C10烷基的醚，具有经取代或 未取代的C1-C10烷基的伯胺、仲胺，具有两个经取代或未取代的C1-C10 烷基的叔胺；

R²表示氢原子，经取代或未取代的C1-C10烷基，羟基，卤素，具有经取 代或未取代的C1-C10烷基的醚，具有经取代或未取代的C1-C10烷基的 伯胺、仲胺，具有两个经取代或未取代的C1-C10烷基的叔胺，或酰氧基 (OCOX)，其中X可以是经取代或未取代的C1-C10烷基，苯基，或经卤 素、硝基、氰基、氨基或具有经取代或未取代的C1-C10烷基的醚基取代 的芳环，杂环的吡咯、吡啶、吲哚、呋喃或噻吩环；

R³表示氢原子，或酰氧基(OCOX)，其中X可以是经取代或未取代的 C1-C10烷基，苯基，或经卤素、硝基、氰基、氨基或具有经取代或未取 代的C1-C10烷基的醚基取代的芳环，杂环的吡咯、吡啶、吲哚、呋喃或 噻吩环；并且

R⁴表示甲基、叔丁基或苄基；

所述组合物用作与适合于治疗神经性疾病(例如脑缺血、阿尔茨海默病、 帕金森病和肌萎缩性侧索硬化)的一线治疗作同时、交替或相继施用的辅 助治疗。所述甾族硝酮衍生物优选地选自胆固醇硝酮F2和F3。

或者，本发明的这个方面涉及包含以上限定的甾族硝酮衍生物的组合 物用于制备用作与适用于治疗神经性疾病(例如脑缺血、阿尔茨海默病、 帕金森病和肌萎缩性侧索硬化)的一线治疗同时、替代或相继施用的辅助 治疗的药物的用途。所述甾族硝酮衍生物优选地选自胆固醇硝酮F2和F3。

本发明的另一个方面涉及包含以上限定的甾族硝酮衍生物(优选选自 胆固醇硝酮F2和F3的甾族硝酮衍生物)的组合物用于制备用作与适合 于治疗脑缺血的一线治疗同时、交替或相继施用的辅助治疗的药物的用 途，其中所述初级治疗或一线治疗包括使用血栓溶解剂，优选使用组织纤 溶酶原激活物(rt-PA)。

此外，本发明涉及用于以迅速且任选地机器人式的方式鉴定和评价具 有高神经保护能力且可参与有效治疗神经性疾病(例如脑缺血、阿尔茨海 默病和帕金森病和肌萎缩性侧索硬化)的化合物的方法。

式Ia-c的甾族硝酮衍生物及其在双键R⁴N(O)＝C(3)处的E和Z几何 异构体用于进行所述药物筛选，

其中R¹独立地表示经取代或未取代的C1-C10烷基，α-羟基酮，α-甲基酮， 或羟基，卤素，具有经取代或未取代的C1-C10烷基的醚，具有经取代或 未取代的C1-C10烷基的伯胺、仲胺，具有两个经取代或未取代的C1-C10 烷基的叔胺；

R²表示氢原子，经取代或未取代的C1-C10烷基，羟基，卤素，具有经取 代或未取代的C1-C10烷基的醚，具有经取代或未取代的C1-C10烷基的 伯胺、仲胺，具有两个经取代或未取代的C1-C10烷基的叔胺，或酰氧基 (OCOX)，其中X可以是经取代或未取代的C1-C10烷基，苯基，或经卤 素、硝基、氰基、氨基或具有经取代或未取代的C1-C10烷基的醚基取代 的芳环，杂环的吡咯、吡啶、吲哚、呋喃或噻吩环；并且

R³表示氢原子，或酰氧基(OCOX)，其中X可以是经取代或未取代的 C1-C10烷基，苯基，或经卤素、硝基、氰基、氨基或具有经取代或未取 代的C1-C10烷基的醚基取代的芳环，杂环的吡咯、吡啶、吲哚、呋喃或 噻吩环；并且

R⁴表示甲基、叔丁基或苄基。

为了验证所述式Ia-c的甾族硝酮的神经保护活性以及为了能够选择 具有最高活性的那些化合物，其神经保护能力使用适合于这一目的的任何 体外或体内模型或测定来确定。所述模型或测定是本领域技术人员已知 的；尽管如此，仅通过实施例的方式，用于测定式Ia-c的甾族硝酮的神 经保护活性以及在治疗神经性疾病中可能的有用性之可能的测定是将在 培养了6至8天的取自大鼠的大脑皮层的原代神经元培养物中测定其中的 细胞生存力(Quevedo，C，Salinas，M，Alcázar，A.Initiationfactor2Bactivityis regulatedbyproteinphosphatase1，whichisactivatedbythemitogen-activated proteinkinase-dependentpathwayininsulin-likegrowthfactor1-stimulated neuronalcells.J.Biol.Chem.2003，278，16579-16586)，并根据以下的方案进 行氧糖剥夺(OGD)(ChiouaM，SucunzaD，SorianoE，Hadjipavlou-Litina D，AlcázarA，AyusoI，Oset-GasqueMJ，GonzálezMP，MonjasL， Rodríguez-FrancoMI，Marco-ContellesJ，SamadiA.α-aryl-N-alkylnitrones， aspotentialagentsforstroketreatment：synthesis，theoreticalcalculations， antioxidant，anti-inflammatory，neuroprotective，andbrain-bloodbarrier permeabilityproperties.JMedChem.2012，55，153-168)：

使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定细 胞生存力。因此，将神经元培养物暴露于OGD4小时(OGD4h)诱导 细胞生存力显著减低为67.3％(相对于100％的对照，p＜0.0001，单样本 检验)，在再灌注后24小时其被部分地恢复(R24h，76.1％；相对于OGD 4h，p＜0.0022，t-检验)，但它在24h时没有达到对照值(相对于100％ 的对照，p＜0.0001，单样本t检验)。在这个意义上，为了评价式Ia-c的 甾族硝酮的神经保护能力，在再灌注期开始时将它们添加到原代培养物 中，使用胞磷胆碱(一种公知的神经保护剂)作为参考化合物。选择相对 于胞磷胆碱具有更高神经保护能力的那些式Ia-c的甾族硝酮。

此外，同样通过举例的方式，允许选择具有更高的神经保护能力的那 些式Ia-c的甾族硝酮的第二模型将是通过根据常规的四血管闭塞法诱导 成年大鼠全面缺血[(a)MartíndelaVegaC，BurdaJ，NemethovaM，Quevedo C，AlcázarA，MartínME，SalinasM.Possiblemechanismsinvolvedinthe down-regulationoftranslationduringtransientglobalischaemiaintherat brain.BiochemJ2001，357，819-826；(b)García-BonillaL，CidC，AlcázarA， BurdaJ，AyusoI，SalinasM.Regulationproteinsofeukaryoticinitiationfactor 2-alphasubunit(eIF2a)phosphatase，underischemicreperfusionandtolerance. JNeurochem2007，103，1368-1380；(c)AyusoMI，Hernández-JiménezM， MartínME，SalinasM，AlcázarA.Newhierarchicalphosphorylationpathway ofthetranslationalrepressoreIF4E-bindingprotein1(4E-BP1)in ischaemia-reperfusionstress.JBiolChem2010，285，34355-34363]。

因此，两个椎动脉被完全烧灼，且在24小时后，用小的夹子通过颈 动脉闭塞诱导缺血15分钟；然后取走夹子并进行再灌注。5天后(R5d)， 将动物处死。为了确定式Ia-c的甾族硝酮的神经保护能力，从再灌注期 开始时用式Ia-c的甾族硝酮处理动物。可用Fluoro-JadeB观察甾族硝酮 针对由于神经元死亡而应激诱导的IR的保护作用(BurdaJ，MatiasovM， GottliebM，DanielisovV，NemethovM，GarcíaL，etal.Evidenceforaroleof secondpathophysiologicalstressinpreventionofdelayedneuronaldeathinthe hippocampalCA1region.NeurochemRes2005，30，1397-1405)，并且其可在 荧光显微镜下观察。这些实验允许示出了使用不同的甾族硝酮处理是否降 低了神经元死亡，因此，选择具有较高的神经保护能力的那些。

因此，本发明的另一方面涉及用于以迅速且任选地机器人式的方式鉴 定和评价具有高神经保护能力且可参与有效治疗神经性疾病(例如脑缺 血、阿尔茨海默病和帕金森病和肌萎缩性侧索硬化)的化合物的方法，所 述方法包括以下步骤：

-选择一种或更多种式Ia-c的甾族硝酮衍生物及其在双键R⁴N(O)＝C(3) 处的E和Z几何异构体；

其中R¹独立地表示经取代或未取代的C1-C10烷基，α-羟基酮，α-甲基酮， 或羟基，卤素，具有经取代或未取代的C1-C10烷基的醚，具有经取代或 未取代的C1-C10烷基的伯胺、仲胺，具有两个经取代或未取代的C1-C10 烷基的叔胺；

R²表示氢原子，经取代或未取代的C1-C10烷基，羟基，卤素，具有经取 代或未取代的C1-C10烷基的醚，具有经取代或未取代的C1-C10烷基的 伯胺、仲胺，具有两个经取代或未取代的C1-C10烷基的叔胺，或酰氧基 (OCOX)，其中X可以是经取代或未取代的C1-C10烷基，苯基，或经卤 素、硝基、氰基、氨基或具有经取代或未取代的C1-C10烷基的醚基取代 的芳环，杂环的吡咯、吡啶、吲哚、呋喃或噻吩环；

R³表示氢原子，或酰氧基(OCOX)，其中X可以是经取代或未取代的 C1-C10烷基，苯基，或经卤素、硝基、氰基、氨基或具有经取代或未取 代的C1-C10烷基的醚基取代的芳环，杂环的吡咯、吡啶、吲哚、呋喃或 噻吩环；并且

R⁴表示甲基、叔丁基或苄基；

-确定所述式Ia-c的甾族硝酮的神经保护活性，这通过允许进行所述 确定的模型或测定来进行；优选地使用整个本发明中举例说明的任 意方法或测定；

-将所述神经保护活性与参考化合物或与参考值进行比较；以及

-选择具有最高活性的那些化合物。

另外，本发明的另一个方面涉及用于获得具有高神经保护力且可参与 有效治疗神经性疾病(例如脑缺血、阿尔茨海默病和帕金森病和肌萎缩性 侧索硬化)的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

-选择一种或更多种式Ia-c的甾族硝酮衍生物及其在双键 R⁴N(O)＝C(3)处的E和Z几何异构体；

其中R¹独立地表示经取代或未取代的C1-C10烷基，α-羟基酮，α-甲基酮， 或羟基，卤素，具有经取代或未取代的C1-C10烷基的醚，具有经取代或 未取代的C1-C10烷基的伯胺、仲胺，具有两个经取代或未取代的C1-C10 烷基的叔胺；

R²表示氢原子，经取代或未取代的C1-C10烷基，羟基，卤素，具有经取 代或未取代的C1-C10烷基的醚，具有经取代或未取代的C1-C10烷基的 伯胺、仲胺，具有两个经取代或未取代的C1-C10烷基的叔胺，或酰氧基 (OCOX)，其中X可以是经取代或未取代的C1-C10烷基，苯基，或经卤 素、硝基、氰基、氨基或具有经取代或未取代的C1-C10烷基的醚基取代 的芳环，杂环的吡咯、吡啶、吲哚、呋喃或噻吩环；

R³表示氢原子，或酰氧基(OCOX)，其中X可以是经取代或未取代的 C1-C10烷基，苯基，或经卤素、硝基、氰基、氨基或具有经取代或未取 代的C1-C10烷基的醚基取代的芳环，杂环的吡咯、吡啶、吲哚、呋喃或 噻吩环；并且

R⁴表示甲基、叔丁基或苄基；

-确定所述式Ia-c的甾族硝酮的神经保护活性，这通过允许进行所述 确定的模型或测定来进行；优选使用整个本发明中举例说明的任何 方法或测定；

-将所述神经保护活性与参考化合物或与参考值进行比较；以及

-选择具有最高活性的那些化合物；

-优选以基本上纯的形式分离所述选择的化合物。

下面的实施例用来举例说明本发明，但在任何情况下都不对其进行限 制。

实施例

在Koffier设备中确定熔点，并且不予校正。室温下在300MHz、400 MHz或500MHz以及在75MHz、100MHz或125MHz分别获得¹HNMR 谱和¹³CNMR谱，使用CDCl₃或DMSO-d₆作为溶剂，这些氘化溶剂的 峰作为内参照(CDCl₃：7.27(D)，77.2(C)ppm；D₂O：4.60ppm和 DMSO-d6：2.49(D)，40(C))。根据在标准NMR实验(¹H，¹³C-DEPT， ¹H，¹H-COSY，gHSQC，gHMBC)中获得的数据来确定化合物的化学 位移归属。在具有API-ES型离子化源的GC/MS设备中进行质谱分析。 在CQO(CSIC，Madrid)中进行微量分析。在F254硅胶板中进行薄层 色谱，并使用紫外线或茚三酮显色剂、茴香醛和磷钼酸-H₂SO₄用于观察。 用无水溶剂进行所有的反应。色谱柱为0.06mm的硅胶柱(230目)。

实施例1.用于硝酮合成的一般方法

将酮(1mmol)、Na₂SO₄(3mmol)和三乙胺(2mmol)的溶液混 悬于EtOH中并用盐酸羟胺(1.5mmol)处理。将混合物搅拌30秒并在 微波炉中(250W)于90℃下进行辐照。当确定反应已结束(TLC分析)， 在真空下除去溶剂，用水稀释，用AcOEt萃取，用Na₂SO₄干燥，过滤并 蒸发。通过柱色谱纯化残余物。

方法A.按照一般方法，将4-胆甾烯-3-酮(385mg，1mmol)、Na₂SO₄(426mg，3mmol)、Et₃N(0.30mL，2mmol)和N-甲基羟胺盐酸盐(126 mg，1.5mmol)在乙醇(10mL)中进行反应，反应3小时，在柱色谱 (CH₂Cl₂/MeOH，1％至2％)之后得到ChNF2和ChNF3的可分离混 合物(396mg，96％，以1∶3的比例)。

方法B.按照一般方法，将5-胆甾烯-3-酮(385mg，1mmol)、Na₂SO₄(426mg，3mmol)、Et₃N(0.30mL，2mmol)和N-甲基羟胺盐酸盐(126 mg，1.5mmol)在乙醇(10mL)中进行反应，反应2小时，在柱色谱 (CH₂Cl₂/MeOH，1％至2％)之后得到ChNF2与ChNF3的可分离混 合物(407mg，98％，以3∶1的比例)。

ChN(F2)：白色固体；Rf(0.21，CH₂Cl₂/MeOH，5％)；mp139-141 ℃；IR(KBr)ν2939，2868，2849，1466，1215cm^-1；¹HNMR(400MHz， CDCl₃)δ5.97(d，J＝2.0Hz，1H，⁴CH)，3.72(s，3H，NCH₃)，3.23(d，J＝18.4 Hz，1H，²CH)，2.34(m，2H，⁶CH₂)，2.21(m，1H，²CH)，1.99(m，2H，CH₂)， 1.80(m，2H，CH₂)，1.60(s，3H，CH₃)，1.36(m，10H，⁵CH₂)，1.12(m，6H， 6CH₂)，1.04(s，3H，¹⁹CH₃)，0.99(m，2H，CH₂)，0.91(d，J＝6.4Hz，3H， ²¹CH₃)，0.88(d，J＝1.3Hz，3H，²⁶CH₃)，0.86(m，3H，²⁷CH₃)，0.70(s，3H， ¹⁸CH₃)；¹³CNMR(101MHz，CDCl₃)δ156.8(³C)，146.4(⁵C)，112.9(⁴CH)， 56.1(¹⁷CH)，55.9(¹⁴CH)，53.5(⁹CH)，46.0(¹³C)，42.3(NCH₃)，39.6(C)，39.4 (C)，37.9(¹⁰C)，36.1(C)，35.77(C)，35.73(C)，34.4(C)，33.4(C)，32.2 (²⁵CH₂)，28.1(¹⁶CH₂)，27.9(²CH₂)，24.2(¹⁵CH₂)，23.8(²⁴CH₂)，22.7(²⁶CH₃)， 22.5(²⁷CH₃)，21.4(CH₂)，21.3(¹¹CH)，18.6(¹⁹CH₃)，17.8(²¹CH₃)，11.9 (¹⁸CH₃).MS(EI)m/z：413(M，37％)+，398(M-CH₃，27％)，397(M-O，70)， 137(C₈H₁₁NO，100％)；MS(ESI)m/z：414.2(M+H)⁺，436.2(M+Na)⁺， 827.8(2M)+，849.7(2M+Na)⁺，C₂₈H₄₇NO的分析计算值：C，81.29；H， 11.45；N，3.39。实测：C，80.98；H，12.19；N，3.44。

ChN(F3)：白色固体：Rf(0.20，CH₂Cl₂/MeOH，5％)；mp153-5℃。 IR(KBr)ν2936，2868，1629，1214cm^-1；¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ 6.78(s，1H，⁴CH)，3.66(s，3H，NCH₃)，2.44(m，4H，2CH₂)，1.88(m，4H， 2CH₂)，1.37(m，14H，7CH₂)，1.04(s，3H，¹⁹CH₃)，0.98(m，2H，CH₂)，0.91(d， J＝6.4Hz，3H，²¹CH₃)，0.88(d，J＝1.4Hz，3H，²⁶CH₃)，0.85(d，J＝1.4Hz， 3H，²⁷CH₃)，0.70(s，3H，¹⁸CH₃)；¹³CNMR(101MHz，CDCl₃)δ123.7(³C)， 120.3(⁵C)，113.7(⁴CH)，56.0(¹⁷CH)，55.9(¹⁴CH)，53.5(⁹CH)，46.4(¹³C)， 42.3(NCH₃)，39.6(C)，39.4(C)，37.9(¹⁰C)，36.0(C)，35.72(C)，35.71(C)， 35.4(C)，32.9(C)，32.2(C)，28.1(C)，27.9(C)，24.1(¹⁶CH₂)，23.7(¹⁵CH₂)， 23.6(²⁴CH₂)，22.7(²⁶CH₃)，22.5(²⁷CH₃)，21.3(¹¹CH₂)，18.6(¹⁹CH₃)，17.8 (²¹CH₃)，11.9(¹⁸CH₃).MS(EI)m/z：413(M，37％)⁺，398(M-CH₃，27％)， 397(M-O，70)，137(C₈H₁₁NO，100％)；MS(ESI)m/z：414.2(M+H)⁺，827.8 (2M)+，849.7(2M+Na)⁺。C₂₈H₄₇NO的分析计算值：C，81.29；H，11.45；N， 3.39。实测：C，81.03；H，11.33；N，3.30。

针对缺血的神经保护作用的药理学评价

已经确定了胆固醇硝酮F2和F3在培养了6至8天的取自大鼠大脑 皮层的原代神经元培养物中的神经保护能力(Quevedo，C，Salinas，M， Alcázar，A.Initiationfactor2Bactivityisregulatedbyprotein phosphatase1，whichisactivatedbythemitogen-activatedprotein kinase-dependentpathwayininsulin-likegrowthfactor1-stimulated neuronalcells.J.Biol.Chem.2003，278，16579-16586)，并根据以下的方案 进行氧糖剥夺(OGD)(ChiouaM，SucunzaD，SorianoE， Hadjipavlou-LitinaD，AlcázarA，AyusoI，Oset-GasqueMJ，GonzálezMP， MonjasL，Rodríguez-FrancoMI，Marco-ContellesJ，SamadiA. α-aryl-N-alkylnitrones，aspotentialagentsforstroketreatment：synthesis， theoreticalcalculations，antioxidant，anti-inflammatory，neuroprotective， andbrain-bloodbarrierpermeabilityproperties.JMedChem.2012，55， 153-168)：

使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定细 胞生存力。因此，将神经元培养物暴露于OGD4小时(OGD4h)诱导 细胞生存力显著降低为67.3％(相对于100％的对照，p＜0.0001，单样本 检验)，在再灌注24小时后其被部分恢复(R24h，76.1％；相对于OGD4h， p＜0.0022，t-检验)，但它在24小时时并没有达到对照值(相对于100％ 的对照，p＜0.0001，单样本t检验)(图1)。

在再灌注期开始时添加浓度范围分别为0.1μM至100μM以及0.5 μM至10μM的胆固醇硝酮F2和F3以评价它们的神经保护能力，使用 胞磷胆碱(一种公知的神经保护剂)作为参考化合物(Adibhatla，RM， Hatcher，JF，Dempsey，RJ.Citicoline：neuroprotectivemechanismsin cerebralischemia.J.Neurochem.2002，80，12-23)。在1μM至1mM的不 同的浓度下测试胞磷胆碱，在10μM和100μM发现神经保护作用(分别 为87.4％和88.1％)，在R24h获得的值相比，100μM的作用具有显著性 (方差分析(ANOVA)，p＜0.0021和p＜0.01，Dunnett事后检验)。

在再灌注期间添加1μM或5μM的胆固醇硝酮F2(而非胆固醇硝酮 F3)显著地提高神经元的生存力，且在5μM浓度几乎达到对照值(对于 1μM或5μM的胆固醇硝酮F2分别为89.1％和95.5％；ANOVA，p＜0.0001 和p＜0.01，与R24h相比Dunnett事后检验)(图1)。

将由胆固醇硝酮F2诱导的神经保护作用与由5μM胞磷胆碱诱导的 神经保护作用进行了比较，与胞磷胆碱所观察到的相比，由胆固醇硝酮 F2诱导导致显著更高的神经保护作用(表1)。

表1.胆固醇硝酮F2和F3在OGD条件下在神经元培养物中的神经 保护作用。

胆固醇硝酮 浓度(μM) 神经保护作用(％) F2 0.1 9.6±0.5 0.5 49.3±3.6 1.0 54.3±1.3＊ 5.0 80.7±2.7＊＊＊ 10 47.2±1.4 50 ＜0 100 ＜0 F3 0.5 ＜0 1.0 18.8±1.1 5.0 21.7±1.2 10 0.8±0.07 胞磷胆碱 100 50.2±1.26

与此相反，胆固醇硝酮F3没有表现出显著的神经保护能力。

为了评价在培养的神经元中胆固醇硝酮F2和F3对缺血损伤的神经 保护作用和模拟长期灌注条件，使培养物暴露于OGD4小时，然后使细 胞进行再灌注5天(R5d)。

在再灌注期开始时添加胆固醇硝酮F2和F3(以1.0μM和5.0μM的 浓度)，在再灌注48小时后，根据MTT的方案(见上文)，由此以评价 其长期的神经保护能力，再次使用参照分子胞磷胆碱。

R5d实验诱导细胞生存力更显著降低(77.7％相对于100％的对照， p＜0.0001，单样本t检验)(图2)。当在再灌注开始时(实心柱)或在再 灌注48小时后(条纹柱)二种情况下添加100μM的浓度测验的胞磷胆 碱(分别为76.0％和74.6％；ANOVA，p＝0.786)，在R5d实验中没有产 生任何神经保护作用。

与此相反，添加1μM和5μM的胆固醇硝酮F2(或F3)没有产生 神经元生存力的大幅提高，超过了在第5天时观察到的对照值(对于1μM 和5μM的胆固醇硝酮F2，分别为110.6％和118.2％；对于1μM和5μM 的胆固醇硝酮F3分别为105.6％和118.6％；ANOVA，p＜0.0001和p＜0.01， Dunnett检验)(图2，实心柱)。

此外，在R5d实验中，在再灌注的48小时后(条纹柱)添加胆固醇 硝酮F2(1μM)或胆固醇硝酮F3(5μM)显著地提高了神经元的生存 力(对于1μM和5μM的胆固醇硝酮F2和F3，分别为95.7和97.8％； ANOVA，p＜0.0001和p＜0.05，根据与R5d相比的Dunnett检测)(图2， 条纹柱)。

总之，缺血后通过胆固醇硝酮的神经保护作用具有长期效力，并且当 胞磷胆碱不再显示任何作用时，甚至在处理48小时后仍可维持神经保护 作用。

根据常规的四血管阻塞法在成年大鼠中诱导全面缺血[(a)Martínde laVegaC，BurdaJ，NemethovaM，QuevedoC，AlcázarA，MartínME， SalinasM.Possiblemechanismsinvolvedinthedown-regulationof translationduringtransientglobalischaemiaintheratbrain.BiochemJ 2001，357，819-826；(b)García-BonillaL，CidC，AlcázarA，BurdaJ， AyusoI，SalinasM.Regulationproteinsofeukaryoticinitiationfactor 2-alphasubunit(eIF2a)phosphatase，underischemicreperfusionand tolerance.JNeurochem2007，103，1368-1380；(c)AyusoM1， Hernández-JiménezM，MartínME，SalinasM，AlcázarA.New hierarchicalphosphorylationpathwayofthetranslationalrepressor eIF4E-bindingprotein1(4E-BP1)inischemia-reperfusionstress.JBiol Chem2010，285，34355-343631。

因此，两个椎动脉被完全烧灼，且在24小时后，用小的夹子通过颈 动脉闭塞诱导缺血15分钟；然后取走夹子并进行再灌注。5天后(R5d)， 将动物处死。用在以盐溶液作为载体的10％乙醇中进行稀释的胆固醇硝 酮F2处理动物，从再灌注期开始时经腹膜内施用。对10只动物进行了测 试；再灌注后2天用载体处理的5只动物中的一只死亡。在实验中对动物 使用的所有方案是根据经RamónyCajal医院(马德里)的伦理委员会批 准的指导方针进行的。在四血管闭塞的脑缺血的大鼠模型中，在缺血的短 时间后，在海马CA1区产生延迟的神经变性[(a)KirinoT.Delayed neuronaldeath.Neuropathology2000，20，S95-S97；(b)PulsinelliWA， BrierleyJB，PlumF.Temporalprofileofneuronaldamageinamodelof transientforebrainischaemia.AnnNeurol1982，11，491-498；(c)BurdaJ， MatiasovM，GottliebM，DanielisovV，NemethovM，GarcíaLetal. Evidenceforaroleofsecondpathophysiologicalstressinpreventionof delayedneuronaldeathinthehippocampalCA1region.NeurochemRes 2005，30，1397-1405)]。在这个模型实验中，缺血后再灌注3至7天在CA1 中诱导显著的神经元死亡(AyusoMI，Martínez-AlonsoE，CidC，de MA，AlcázarA.ThetranslationalrepressoreIF4E-binding protein2(4E-BP2)correlateswithselectivedelayedneuronaldeathafter ischemia.JCerebBloodFlowMetab.Atpress，doi： 10.1038/jcbfm.2013.60)。与在大脑皮层中所观察到的相比，在CA1区的 神经元的选择性神经变性是明显的。

从再灌注期最开始时，用剂量为0.1mg/kg的胆固醇硝酮F2处理动 物，在第5天(R5d)中诱导神经元死亡。用Fluoro-JadeB观察胆固醇 硝酮F2针对由于神经元死亡而应激诱导IR的保护作用(BurdaJ， MatiasovM，GottliebM，DanielisovV，NemethovM，GarcíaLetal. Evidenceforaroleofsecondpathophysiologicalstressinpreventionof delayedneuronaldeathinthehippocampalCA1region.NeurochemRes 2005，30，1397-1405)，且其可在荧光显微镜下进行观察。这些实验表明用 胆固醇硝酮进行处理显著地降低了海马CA1区中神经元的死亡。结果表 明，用胆固醇硝酮处理的动物在5天实验(R5d)中显示在CA1区(CA1) 中显著降低的凋亡性死亡(对于分别用盐水溶液和胆固醇硝酮F2处理的 动物，每个视野55.1±3.4个细胞与70.4±2.4个细胞；ANOVA，p＜0.0001 和p＜0.01，Newman-Keuls事后检验)(图3，CA1)。在大脑皮层(C) 和外侧皮质(LC)中也观察到由缺血诱导的神经元死亡，但是作用比在 CA1区更加有限。此外，在大脑皮层(对于分别用载体和胆固醇硝酮处 理的动物，大脑皮层每个视野6.7±3.5个细胞与0±0.1个细胞；p＜0.05，t- 检验)和外侧皮质(分别用载体和胆固醇硝酮处理的动物为13.4±3.6与 6.3±2.2)可观察到由于胆固醇硝酮F2引起的神经元缺血损害的降低(图 3)。

在用TUNEL法的R5d实验中在CA1区中特异性地显示了凋亡的诱 导(AyusoMI，Martínez-AlonsoE，CidC，deMA，AlcázarA. ThetranslationalrepressoreIF4E-bindingprotein2(4E-BP2)correlates withselectivedelayedneuronaldeathafterischemia.JCerebBloodFlow Metab.Atpress，doi：10.1038/jcbfm.2013.60)。在CA1区、大脑皮层和外 侧皮质中，用载体(R5d)处理的动物的脑切片比用胆固醇硝酮处理的动 物显示出更高水平的TUNEL阳性细胞(图4)。结果表明用胆固醇硝酮 F2处理的动物，在灌注后5天(R5d)在CA1区的神经元凋亡性死亡显 著降低(分别用载体和胆固醇硝酮处理的动物，每个视野64.1±7.1个细胞 核与48.5±0.4个细胞核；ANOVA，p＜0.0001和p＜0.01，Newman-Keuls 事后检验)(图4，CA1)。同时，在大脑皮层和外侧皮质也观察到胆固醇 硝酮引起的凋亡性细胞死亡的降低，与上述的结果一致(对于分别用载体 和胆固醇硝酮治疗的动物，在大脑皮层每个视野7.2±3.8和1±0.5个细胞 核；对于分别用载体和胆固醇硝酮处理的动物，在外侧皮质，13.3±6.2和 4.3±1.4)(图4)。

总之，可以得出结论用以证明对神经元培养物和CA1区具有神经保 护作用之浓度的胆固醇硝酮F2对缺血动物的药理学处理显著地降低了缺 血再灌注后在这个区域内凋亡性神经元死亡。