MicroRNA-4454和MicroRNA-7975在制备检测银屑病试剂或试剂盒中的应用

摘要

本发明涉及医学生物检测技术领域，本发明提供了MicroRNA-4454和MicroRNA-7975在制备检测银屑病试剂或试剂盒中的应用。本发明通过前期应用Real-Time？PCR？Array技术发现了在银屑病患者指甲中MicroRNA-4454和MicroRNA-7975水平存在显著下调，进而提供了从人类指甲提取RNA技术方法和试剂盒及利用该试剂盒提取指甲microRNA进行Real-Time？PCR检测，能够准确发现银屑病患者指甲中MicroRNA-4454和MicroRNA-7975水平的下调。本发明的试剂盒及方法可早期预测银屑病的发生和进行早期诊断，对于银屑病的防治具有重要意义。本发明是一种早期预测难治性皮肤疾病——银屑病提供了新的临床检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，是microRNAs在制备早期筛查或诊 断银屑病试剂或试剂盒中的应用。

背景技术

银屑病(Psoriasis,Pso)，俗称牛皮癣，又名白疪。是一种常见的慢性炎症性 炎症性皮肤病，病程较长，易复发，少数病例几乎终生不愈。该病发病以青壮 年为主，对患者身体健康和精神状况影响较大。临床变现以红斑，鳞屑为主， 全身均可发病，以头皮，四肢伸侧较为常见。发病机制目前尚未完全阐明，普 遍认为与免疫，遗传，环境，心理等因素有着密切的关联。美国皮肤病协会报 道，美国银屑病患者约占人口总数的2％，中国患者发病率约为0.123％，北方 高于南方(参见文献A.B.Gottlieb,A.W.Armstrong.Psoriasisoutcome measures:areportfromtheGRAPPA2012annualmeeting.JRheumatol,40(2013), pp.1428–1433)。当前治疗原则仅以局部药物治疗及紫外线治疗为主，缺乏有 效根治的方法，仅能控制或减少病患复发。银屑病已严重的危害了人类健康和 精神状况，如何早期发现，早期治疗银屑病，成为了当今重要的课题。

目前Pso的研究主要针对Pso的流行病学研究和诱发因素研究，但对其发 生机制的研究探讨涉及很少。由于目前Pso的诊断主要依靠临床表现，而缺乏 特异性实验室指标，因此为临床工作带来很多不便，增加了误诊与漏诊。对患 者而言，面临着经济与精神双方面的负担。因此，从预防和治疗角度，急需寻 找较明确的Pso生物学标记物。

microRNA(miRNA)是一类长度约19～25碱基的非编码蛋白质单链小分子 RNA，广泛存在于多细胞生物和病毒体内，主要通过核酸序列互补匹配结合到 特定的靶mRNA上，抑制靶mRNA翻译过程或降解靶mRNA，是一种起负调 控作用的分子。miRNA调控至少30％以上的基因表达，参与多种病理生理过程。 在多个组织中，例如，正常与皮肤疾患组织中表达差异。因此，通过表达谱分 析寻找疾病相关miRNA并进行发病机理研究，最终应用于皮肤疾患的诊断和 治疗，已经成为目前miRNA研究的重要方向(参见文献JinninM.Various applicationsofmicroRNAsinskindiseases.JDermatolSci.74(1):3-8.2014)。

已有实验证实，miRNA在血浆和血清中非常稳定，它们被有效保护以免 接触RNases，在严酷环境条件下仍能保持稳定。但是，关于指甲中miRNA研 究很少有报道，与血清及血浆miRNA相比，指甲中miRNA更加容易获取， 对患者而言创伤小，更容易被接受。

目前，对于miRNA的早期诊断作用的研究主要集中在肿瘤方面，与银屑病 相关的microRNAs主要为：在银屑病患者皮肤中高表达的miRNA-203(参见文 献SonkolyE,WeiT,JansonPC,A,LundebergL,Tengvall-LinderM, NorstedtG,AleniusH,HomeyB,ScheyniusA,M,PivarcsiA.MicroRNAs: novelregulatorsinvolvedinthepathogenesisofpsoriasis？PLoSOne.2(7):e610. 2007)，银屑病患者外周血中低表达的miRNA-424和miRNA-1266(参见文献 IchiharaA,JinninM,YamaneK,FujisawaA,SakaiK,MasuguchiS,etal. microRNA-mediatedkeratinocytehyperproliferationinpsoriasisvulgaris.BrJ Dermatol.65:1003–10.2011；IchiharaA,JinninM,OyamaR,YamaneK,FujisawaA, SakaiK,etal.IncreasedserumlevelsofmiR-1266inpatientswithpsoriasis vulgaris.EurJDermatol22:68–71.2012)，以及在银屑病患者发根中高表达的 miRNA-19A(参见文献HiraoH,JinninM,IchiharaA,FujisawaA,MakinoK, KajiharaI,etal.DetectionofhairrootmiR-19aasanoveldiagnosticmarkerfor psoriasis.EurJDermatol[inpress].2014)都具有对银屑病的诊断价值。以上研 究均提示，miRNAs与银屑病有着密切的关系，角质细胞、血清及发根中miRNA 可成为早期特异性潜在标记物。

hsa-mir-4454(MI0016800)与hsa-mir-7975(MI0025751)目前尚无文献报 道与银屑病的发生和诊断相关联。

目前尚未见从指甲中获取microRNAs作为银屑病生物学标记物的报道.

更未见一种用于检测指甲中的hsa-mir-4454，hsa-mir-7975含量来早期预测 银屑病的检测方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于寻找到与银屑病相关的新的分子标记物，本发明的另一 目的在于提供某一种microRNA在制备早期筛查或临床诊断银屑病试剂或试剂 盒中的应用。

由于采血及生检等有创检查容易对患者造成心理负担等问题，所以本发明 的另一发明目的在于提供一种检测指甲中的hsa-mir-4454，hsa-mir-7975含量的 试剂或试剂盒，以及相关的检测方法。

本发明人为了寻找参与银屑病相关的指甲miRNA，利用miRNA芯片技术 筛选了与银屑病相关的miRNA。结果发现与正常人指甲MicroRNA-4454， MicroRNA-7975的表达具有显著差异。

临床上Pso有相对明确的发病时间，为了寻找参与Pso相关的指甲miRNAs， 我们利用miRNA的微阵列技术筛选了与Pso相关的miRNA(表1)并进行了qPCR 验证检测。结果发现与正常人相比，Pso患者指甲中MicroRNA-4454， MicroRNA-7975的表达水平明显降低(如表1、图2、图4、图5所示)。本发明 人认为通过实时定量荧光PCR(Real-timePCR)为基础技术，通过检测Pso患 者中指甲中MicroRNA-4454，MicroRNA-7975的表达来实现早期诊断Pso是完 全可行的。同时检测了其它实验室从外周血和皮肤中检测发现的若干 microRNAs，其中miR-424-5p发生了显著下调，与文献报道的银屑病患者外周 血中检测到的miR-424-5p改变情况一致，但目前为止并没有直接证据表明银屑 病患者外周血的microRNAs表达谱与指甲中的microRNAs表达谱具有相关性。 表1：miRNAs表达微阵列(microRNAmicroArray)技术对正常人群和银屑病

患者指甲中microRNAs表达谱进行检测的数据结果

本发明的第一方面，提供了MicroRNA-4454和/或MicroRNA-7975作为诊 断银屑病的分子标记物的应用。

本发明的第二方面，提供了MicroRNA-4454和/或MicroRNA-7975在制备检 测银屑病试剂或试剂盒中的应用，该应用也即早期筛查或临床诊断银屑病。

MicroRNA-4454和/或MicroRNA-7975在制备检测银屑病试剂或试剂盒中 的应用，所述的试剂，为检测生物样品中MicroRNA-4454表达量的寡聚核苷 酸和/或MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸。

所述的试剂盒，包含上述试剂，即包含检测生物样品中MicroRNA-4454 表达量的寡聚核苷酸和/或MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸。

在本发明的一个优选实施例中，所述的生物样品为指甲。

所述的试剂，可以是单独为检测生物样品中MicroRNA-4454表达量的寡 聚核苷酸；也可以是单独为检测MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸；或者 为检测MicroRNA-4454与MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸的组合。

检测所述的MicroRNA-4454和/或MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸 包括反转录引物、PCR特异性引物等。

在本发明的一个优选实施例中，检测所述的MicroRNA-4454表达量的寡 聚核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

在本发明的一个优选实施例中，检测所述的MicroRNA-7975表达量的寡 聚核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。

本发明的第三方面，提供了一种检测指甲中的hsa-mir-4454和/或 hsa-mir-7975表达量的试剂或试剂盒。

所述的试剂或试剂盒，是通过检测指甲中的hsa-mir-4454，hsa-mir-7975 水平的变化，监测或早期预测银屑病的可能或进程，以便尽早采取措施或药物 治疗，防止银屑病症状恶化，进而防止累积全身。

本发明通过对银屑病患者与正常人指甲中hsa-mir-4454，hsa-mir-7975的含 量比较发现：银屑病患者指甲中hsa-mir-4454，hsa-mir-7975含量明显低于正常 人，约低于正常人群的10倍左右，这个结果显示了hsa-mir-4454，hsa-mir-7975 的含量变化情况，可以作为银屑病的早期预测手段。

本发明试剂盒中的两个检测分子hsa-mir-4454和hsa-mir-7975是根据已知 的生物信息学查得的成熟体序列(详见http://www.mirbase.org/)

hsa-mir-4454的成熟体序列：GGAUCCGAGUCACGGCACCA(SEQIDNO:1)

hsa-mir-7975的成熟体序列：AUCCUAGUCACGGCACCA(SEQIDNO:2)

所述的试剂，为检测指甲中MicroRNA-4454表达量的寡聚核苷酸和/或 MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸。

所述的试剂盒，包含上述试剂，即包含检测指甲中MicroRNA-4454表达 量的寡聚核苷酸和/或MicroRNA-7975表达量的寡聚核苷酸。

本发明提供了一种早期预测银屑病的hsa-mir-4454和/或hsa-mir-7975检测 试剂盒，该试剂盒由反转录系统、引物系统和扩增系统组成，其中的引物系统 由特异性的hsa-mir-4454，hsa-mir-7975引物组成，具体序列如下：

hsa-mir-4454引物为：5'-GGATCCGAGTCACGGCACCA-3'(SEQIDNO:3)

hsa-mir-7975引物为：5'-ATCCTAGTCACGGCACCA-3'(SEQIDNO:4)

上述试剂盒的反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制 剂组成，扩增系统由Mir-X^TMmiRNAFirst-StrandSynthesisandSYBRqRT-PCR kit试剂组成。

本发明的试剂盒，具体组成如下：

A)非特异反转录引物1管100μl/管

B)hsa-mir-4454或hsa-mir-7975特异性PCR上游引物，1管，浓度:10μM， 100μl/管；

C)通用3’端实时定量PCR下游引物1管100μl/管

D)内参U61管100μl/管

E)标准品1管100μl/管

F)萃取液1管2000μl/管

G)酶1管500μl/管

H)裂解液1管500μl管

I)RNA提取液1管2000μl/管

J)氯仿1管1000μl/管

K)异丙醇1管5ml/管

L)70％乙醇1管10ml管

M)ddH2O1管2000μl/管。

非特异反转录引物：商品化寡聚核苷酸(自动加尾microRNA反转录引物， 制造商：日本TAKARABio)

hsa-mir-4454与hsa-mir-7975特异性引物：即SEQIDNO:3与SEQIDNO:4

通用3’端实时定量PCR下游引物：商品化寡聚核苷酸(制造商：日本 TAKARABio)

内参U6:商品化寡聚核苷酸(制造商：日本TAKARABio)

标准品：50例正常人指甲提取总microRNAs混合物的反转录产物；

萃取液：尿素、Tris-盐酸、十二烷基硫酸钠(SDS)

裂解液：二硫苏糖醇(DTT)

RNA提取液：商品化试剂，制造商：日本NIPPONGENE

使用本发明试剂盒监测或早期预测银屑病，首先，将若干正常人群编组， 用本发明试剂盒检测正常人群指甲中hsa-mir-4454，(orhsa-mir-7975)含量，以 此作为对照的标准数据。再用相同的方法检测未知患者指甲中hsa-mir-4454， (orhsa-mir-7975)含量，对照上述标准数据，即可初步确定该患者是否为银屑病 患者，以便作进一步检查确诊。

本发明的第四方面，提供了上述试剂或试剂盒检测指甲中的hsa-mir-4454 和/或hsa-mir-7975表达量的方法，即本发明提供了一种银屑病患者指甲中的 hsa-mir-4454和/或hsa-mir-7975的检测方法，具体步骤如下：

按常规采取指甲，用萃取剂等使指甲融解，再用总RNA提取试剂处理， 加氯仿离心后取上层水相，并富集指甲中的小RNA；由反转录系统反转录 hsa-mir-4454和/或hsa-mir-7975成cDNA；用扩增系统进行Real-timePCR扩 增，测定hsa-mir-4454和/或hsa-mir-7975含量。

本发明的试剂盒，可以是单独检测指甲中MicroRNA-4454的表达量；也 可以是单独检测MicroRNA-7975的表达量；或者是同时检测MicroRNA-4454 和MicroRNA-7975的表达量；当本发明的试剂盒同时检测MicroRNA-4454 和MicroRNA-7975的表达量时，敏感性和特异性更高。

本发明为银屑病的早期筛查和临床诊断提供了新检测手段，而且相比于血 清学检测无创、无痛、快速、灵敏。

附图说明

图1：指甲融解前后比较，其中A为融解前，B为融解后；

图2：miRNA芯片技术筛选了与Pso相关的miRNAs表达谱中具有代表性的若 干microRNAs与正常人群指甲中microRNAs表达谱相比的改变情况，列举的 代表性microRNAs为miRNA-203,miRNA-424，miRNA-1266，miRNA-19A， miR-4454以及miR-7975，其中，miR-4454在银屑病患者中的表达水平降低超 过检测灵敏度范围，其检测数值降至0，有显著改变，另外，miR-7975与 miRNA-424也出现了明显的下调。

图3：标准品倍比稀释法建立标准曲线，其中A为扩增miR-4454的标准曲线， B为扩增miR-7975时的标准曲线；

图4：正常人与银屑病患者指甲中miR-4454的差异表达检测，同时检测了黑色 素瘤患者和特应性皮炎患者的指甲microRNA作为对照，其中，相较于正常对 照人群，银屑病患者指甲中的miR-4454表达水平明显降低。图中，NS：正常 人指甲；Pso：银屑病患者指甲；MM：黑色素瘤患者指甲；AD：特应性皮炎；

图5：正常人与银屑病患者指甲中miR-7975的差异表达检测，同时检测了作为 对照的黑色素瘤患者和特应性皮炎患者的指甲microRNAs表达，其中，相较 于正常对照人群，银屑病患者指甲中的miR-7975表达水平明显降低。图中， NS：正常人指甲；Pso：银屑病患者指甲；MM：黑色素瘤患者指甲；AD：特 应性皮炎；

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限 于此。

实施例1：制备本发明的试剂盒(供一人用)

本发明的试剂盒组成如下：

A)非特异反转录引物1管100μl/管

B)hsa-mir-4454和/或hsa-mir-7975特异性PCR上游引物，1管，浓度:10μM， 100μl/管；

C)通用3’端实时定量PCR下游引物1管100μl/管

D)内参U61管100μl/管

E)标准品1管100μl/管

F)萃取液1管2000μl/管

G)酶1管500μl/管

H)裂解液1管500μl管

I)RNA提取液1管2000μl/管

J)氯仿1管1000μl/管

K)异丙醇1管5ml/管

L)70％乙醇1管10ml管

M)ddH₂O1管2000μl/管。

本发明根据已知的生物信息学查得：

hsa-mir-4454的成熟体序列：GGAUCCGAGUCACGGCACCA(SEQIDNO:1)，

hsa-mir-7975的成熟体序列：AUCCUAGUCACGGCACCA(SEQIDNO:2)

其特异性的反转录引物、qRT-PCR的miRNA引物由TAKARA公司负责引 物合成。

(1)miRNA实时定量PCR特异性引物：

hsa-mir-4454上游引物为：5'-GGATCCGAGTCACGGCACCA-3'(SEQIDNO:3)

hsa-mir-7975上游引物为：5'-ATCCTAGTCACGGCACCA-3'(SEQIDNO:4

(2)非特异反转录引物、通用3’端实时定量PCR下游引物、内参U6引物序 列皆为商品化寡聚核苷酸，制造商为日本TAKARABio。

制备包括下列组成成分的试剂盒：总RNA提取试剂、氯仿、异丙醇、70％ 乙醇、特异性hsa-mir-196a引物(100μl/管浓度:10μM)ddH₂O(2000μl/管) ddH₂O的配置：MiliQ纯水经高压灭菌后，配置成Real-timePCR用的ddH₂O。 特异性hsa-mir-4454,hsa-mir-7975引物：由TAKARA公司负责引物合成，纯 度为PAGE级，终浓度为10μM。

实施例2：本发明的试剂盒的检测

一、采集指甲样本及样本准备：

由于指甲具有取材方便、无创伤性、连续检测的优点，因此从指甲中检测 银屑病生物标志物可以将银屑病的转归提高到一个新的水平，从而达到早预 防、早治疗的目的。

指甲样本在日本国立熊本大学附属医院皮肤科采集：13例正常人，11例 银屑病患者，10例黑色素瘤患者，9例皮肤炎患者。根据美国皮肤病协会(AAD, AmericanAcademyofDermatologyAAD,AmericanAcademyofDermatology)诊 断基准进行样品收集：收集病人的指甲(长度约2cm，宽约0.2cm,3-4枚),-80 度保存。

二、采集指甲样本的处理及提取其中的RNA：

(1)指甲样本处理：采集的指甲样品ddH₂O清洗两次,无水乙醇清洗一次， 干燥。加萃取液、酶和裂解液使指甲溶解(见图1)，然后加Isogenreagent (NipponGene公司购买)，使用量800μl。

(2)RNA提取：添加过Isogenreagent的样本摇晃混匀，放置冰上30min，加 氯仿200μl，混匀，放置冰上30min，12000rpm，4℃离心15min，取上清，放 入新的1.5mlEP管中。每管加入500μl异丙醇，摇晃混匀，放置冰上10min左 右，12000rpm、4℃离心10min，除去水相。加70％乙醇1000μl，7500rpm，4℃ 离心10min，除去乙醇。干燥后加ddH₂O50μl使之溶解。使用Eppendorf紫外 分光光度仪测定RNA的A260值和A260/A280的比值(1.8-2.2)，以评估其 浓度和质量。符合定量检测要求的样本进行下一步反应。

三、指甲中miRNA水平再现性

首先，取正常人拇指每7天取一次，共取3次，分别提取RNA，选择 miRNA-4454，miRNA-7975引物以及随机选取miRNA-16引物和内参引物U6， 进行Real-timePCR反应，比较3次正常人拇指指甲中miRNA-4454， miRNA-7975，miRNA-16的水平，(见表2)。Real-timePCR结果，3次提取的 指甲miRNA含量无明显差异。

然后，从正常人拇指，食指，中指，无名指以及小指采取指甲，分别提取RNA， 进行进行Real-timePCR反应，比较正常人五指之间miRNA的水平，(见表3)。

Real-timePCR结果，正常人五指之间指甲中miRNA含量无明显差别。

表2：从正常人指甲中提取miRNA再现性检测

拇指指甲 miR-4454 miR-7975 miR-16 U6 1回Ct 20.99 20.84 31.08 27.75 2回Ct 19.67 19.91 28.81 26.48 3回Ct 19.66 19.91 28.73 26.67

表3：从正常人指甲中提取miRNA

Ct miR-4454 miR-7975 miR-16 U6 拇指指甲 20.47 20.68 30.24 27.99 食指指甲 19.81 20.21 29.45 26.69 中指指甲 20.91 20.94 30.56 28.12 无名指指甲 21.27 21.34 30.96 28.94 小指指甲 22.26 22.38 33.26 29.49

四、miRNA的实时定量

1.反转录成hsa-mir-4454，hsa-mir-7975的cDNA

取富集液50ng为模板，以设计的特异性hsa-mir-4454，hsa-mir-7975反转 录引物进行反转录。按照mRQBuffer(2X)5μl、mRQEnzymeMix1.25μl (Mir-X^TMmiRNAFirst-StrandSynthesisandSYBRqRT-PCRkit)(TAKARA公 司)、富集的小RNA50ng、DEPCddH₂O(补充ddH₂O使总体积达到10μl) 进行反转录，10倍稀释。以上步骤所用的tip头、EP管均经过DEPC水处理后 高压灭菌。

2.Real-timePCR定量miRNA

采用TaKaRa公司的Mir-X^TMmiRNAFirst-StrandSynthesisandSYBR qRT-PCR试剂和TP800实时定量PCR仪，按照下述体系进行PCR反应：

经过预实验确立了hsa-mir-4454，hsa-mir-7975引物的合适退火温度，最终确定 以下条件：

Denaturation

DissociationCurve

95℃60s

55℃30s

95℃30s

本实验采用标准反转录产物倍比稀释法建立标准曲线，反转录产物10倍， 100倍，1000倍稀释。按照上述Real-timePCR条件，对前期制备的各样本的反 转录产物进行检测。每批次PCR均设立标准曲线作为批次间参照，并依据标准 曲线设立CT值阈值。每样本均做3个平行复管，取其平均值分析，每个PCR测 定中都包括阴性(水)对照(见图3)。为防止污染，所有反应均在专区的清洁 实验台进行，模板添加和引物添加不在同区操作。为防止引物二聚体和非特异 性扩增，所有反应均在冰上操作。

获得的各样本hsa-mir-4454，(orhsa-mir-7975)表达量均由标准曲线转换为相 对定量值，目标基因表达量/持家基因cel-miR39表达量进行标准归一化处理。 最终获得比值进行比较和统计分析。通过法计算hsa-mir-4454，(or hsa-mir-7975)在银屑病患者指甲当中的相对表达量，银屑病患者指甲中 hsa-mir-4454，(orhsa-mir-7975)的表达平均水平比正常人表达水平低数倍，正 常人指甲中的hsa-mir-4454，(orhsa-mir-7975)量视为1。

实施例3：银屑病患者指甲当中hsa-mir-4454含量检测

按照实施例2相同的方法，把采集的11例银屑病患者指甲中hsa-mir-4454 与正常人指甲中的hsa-mir-4454作比较，结果为银屑病患者指甲中hsa-mir-4454 的含量低于正常人指甲中的10倍左右。采用t检验，结果P<0.01,认为银屑病 患者指甲中hsa-mir-4454的含量明显低于正常人，而其他皮肤疾患无显著差异。 (见图4)

实施例4：银屑病患者指甲当中hsa-mir-7975含量检测

按照实施例3相同的方法，把采集的11例银屑病患者指甲中hsa-mir-7975 与正常人指甲中的hsa-mir-7975作比较，结果为银屑病患者指甲中hsa-mir-7975 的含量低于正常人指甲中的10-20倍左右。采用t检验，结果P<0.001,同样认 为银屑病患者指甲中hsa-mir-7975的含量明显低于正常人，而其他皮肤疾患无 显著差异。(见图5)

实施例5：检测实例1

用实施例1的试剂盒，按照实施例2相同的方法，对于某皮炎患者(发病 8天，膝关节附近皮肤呈红色斑块隆起，表面有层状银白色鳞屑)进行指甲中 hsa-mir-4454含量的检测，通过法计算数值，与正常人指甲中的 hsa-mir-4454作比较，低于10倍；

再测hsa-mir-7975含量，通过法计算数值，与正常人指甲中的 hsa-mir-7975作比较，低于10-20倍；

再结合临床现在的诊断标准，确认为银屑病患者。

实施例6：检测实例2

用实施例1的试剂盒，按照实施例2相同的方法，对某皮炎患者(发病7 天，躯干部皮肤边缘损害不明显，基底浸润较轻，皮疹上的鳞屑呈糠秕状，症 状疑似银屑病患者)进行指甲中hsa-mir-4454含量的检测，通过法计算 数值，与正常人指甲中的hsa-mir-4454作比较，无显著差别；

再测hsa-mir-7975含量，通过法计算数值，与正常人指甲中的 hsa-mir-7975作比较，无显著差别；

再结合临床上已有的诊断标准，排除为银屑病患者。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业 的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中 描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还 会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发 明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。