可溶性牙鲆NPY重组蛋白获得方法

摘要

本发明涉及可溶性牙鲆NPY重组蛋白，具体的说是一种可溶性牙鲆NPY重组蛋白获得方法。具体，构建NPY表达载体，表达载体重组表达，再经蛋白纯化、去内毒素、脱盐，而后于缓冲体系内，得可溶性的牙鲆重组NPY蛋白。本发明是大肠杆菌获得重组蛋白是可溶性的，避免了包涵体蛋白变性、复性过程，保证了蛋白的活性，优化了蛋白保存缓冲液，避免了纯化、去内毒素、脱盐后蛋白变性沉淀，维持了其可溶的状态，从而维持了其活性。

说明书

技术领域

本发明涉及可溶性牙鲆NPY重组蛋白，具体的说是一种可溶性牙鲆NPY重组蛋白获得方法。

背景技术

神经肽Y一种内源性的促食欲因子，属于胰多肽家族，最早由Tatemoto从猪脑中提取的一种含有36氨基酸的单链多肽。NPY的结构与生物活性密切相关。NPY广泛分布在中枢及外周神经系统的神经元中，存在于器官、机体及腺体中，比如心脏、脑中等。大量研究表明NPY能够刺激动物摄食。通过脑室注射和腹腔注射NPY能够促进鱼类摄食。

牙鲆，俗称牙片，为鲆鲽鱼类，录属于鲽形目、牙鲆科、牙鲆属，是我国和日韩等国的重要海水养殖鱼类。提高养殖牙鲆生长速度是提高水产养殖业生产效率中的一个关键过程。

利用细菌进行重组表达蛋白是生物工程中常用方法，其培养简单，时间短，适合于工业化生产。

发明内容

本发明在于提供一种可溶性牙鲆NPY重组蛋白获得方法。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

一种可溶性牙鲆NPY重组蛋白获得方法，构建NPY表达载体，表达载体重组表达，再经蛋白纯化、去内毒素、脱盐，而后于缓冲体系内，得可溶性的牙鲆重组NPY蛋白。

所述构建NPY表达载体以牙鲆NPYcDNA序列为模板f-NPY-F和f-NPY-R为引物进而PCR扩增，产物插入pPROEX^TMHTa质粒的NcoI酶切位点并转化大肠杆菌BL-21(DE3)，即得到NPY表达载体；

所述引物f-NPY-F为5′-ATGCATCCTAACTTGGTGAG-3′；和f-NPY-R为5′-GCAGTGATGTGGATTCAACGTTGATTGC-3′。

将NPY表达载体蛋白于LB培养基中37℃下培养至A600达到0.8，而后经诱导剂诱导表达NPY重组蛋白。

所述NPY重组蛋白的菌体经过B-per(Thermo,US)处理、离心后获得的上清液；将收集的上清液用与其同体积的清洗缓冲液1稀释，得稀释的蛋白样品，稀释的蛋白样品过50％Ni-NTA纯化柱4℃孵育过夜，孵育后依次经清洗缓冲液1、清洗缓冲液2清洗纯化柱，而后经洗脱缓冲液洗脱，即得纯化蛋白；

其中，清洗缓冲液1为5mMNaH₂PO4，30mMNaCl，20mM咪唑；

清洗缓冲液2为5mMNaH₂PO4，30mMNaCl，50mM咪唑；

洗脱缓冲液为5mMNaH₂PO4，30mMNaCl，250mM咪唑。

所述将纯化后的蛋白溶液通过Ultra-15(Millipore，USA)离心柱浓缩脱盐(去咪唑)，将纯化后的蛋白溶液离心浓缩，而后浓缩液中加入含5mMNaH₂PO4，30mMNaCl的PBS缓冲液重悬，再经离心浓缩，直至除去咪唑得可溶性的重组牙鲆NPY蛋白。

本发明的优点：

本发明是大肠杆菌获得重组蛋白是可溶性的，避免了包涵体蛋白变性、复性过程，保证了蛋白的活性，优化了蛋白保存缓冲液，避免了纯化、去内毒素、脱盐后蛋白变性沉淀，维持了其可溶的状态，从而维持了其活性。

附图说明

图1为本发明实施例提供的pPROEX^TMHTa(Lifetechnologies)组成示意图。

图2为本发明实施例提供蛋白可溶性分析。

图3为本发明实施提供的可溶性蛋白纯化分析。

图4本发明实施提供的可溶性蛋白腹腔注射对摄食的影响。

图5本发明实施提供的可溶性蛋白腹腔注射对体重的影响。

具体实施方式

下面结合实施例详述本发明的实验步骤。

本发明是具有活性的牙鲆NPY重组蛋白的获得以及纯化的方法。本发明所获得的可溶性重组蛋白为牙鲆NPY的全长蛋白，获得重组蛋白为可溶性的具有活性的蛋白，经纯化后该蛋白仍然保持可溶性，从而可以制成注射剂，将注射剂腹腔注射到牙鲆等海水鱼中可以促进其摄食,提高生长速度,同时溶液状态下的NPY蛋白可以喷洒到固体颗粒饵料或与其它饵料、药剂等混合。

实施例1

NPY表达载体的构建

根据NCBI数据库中公布的牙鲆NPYcDNA序列(GenBankaccessionNo.AB055211.1)，设计全长NPY(f-NPY)的引物(见表1)，使用Pfu高保真酶扩增目的片段，插入pPROEX^TMHTa质粒的NcoI酶切位点并转化大肠杆菌BL-21(DE3)，经LB+Amp培养基筛选阳性菌落，提取质粒后分别以f-NPY-F/R为引物进行PCR鉴定并进行测序，筛选到编码框正确的阳性重组菌分别命名为f-NPY/HTa(参见图1)。

表1引物序列

引物名称引物序列f-NPY-F5′-ATGCATCCTAACTTGGTGAG-3′f-NPY-R5′-GCAGTGATGTGGATTCAACGTTGATTGC-3′

实施例2

NPY重组蛋白的诱导表达

挑取f-NPY/HTa单菌落于5mLLB培养基中37℃，200rpm过夜培养，次日以1％的接种量接于50mLLB培养基中继续培养至A600达到0.8，此时取出1mL培养液作为非诱导对照样品，然后向剩余培养基中加入诱导剂0.8mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导重组蛋白的表达，培养时间为3小时，而后于6000rpm离心5min后弃上清，用50μLPBS和50μL2×SDS-PAGE上样缓冲液重悬菌体，同时将对照样品也于6000rpm离心5min后弃上清，用50μLPBS和50μL2×SDS-PAGE上样缓冲液重悬菌体，所得重悬菌体分别煮沸5min后进行SDS-PAGE检测使用考马斯亮蓝R-250进行染色。

实施例3

蛋白可溶性检测

将上述大量培养的诱导菌体于6000rpm离心20分钟，弃上清。然后按照2-5mL/克菌体(湿重)比例加入B-per(Thermo,US)缓冲液。混匀后，室温静止30分钟，然后15000rpm离心30分钟，将上清液倒入一个新的离心管中。沉淀中再加入上述溶解菌体所用B-per缓冲液体积的一半的B-per缓冲液，混匀、离心后将上清液倒入新的离心管，重复2次。将上清液混匀，用50μL上清液和50μL2×SDS-PAGE上样缓冲液混合，煮沸5min后进行SDS-PAGE检测，使用考马斯亮蓝R-250进行染色(参见图2)。

由图2可见所提取的蛋白位于上清液中,即为可溶性的。

实施例4

蛋白纯化

在将上述(实施例3)获得上清液中的蛋白纯化的过程中发现蛋白容易发生沉淀，为此将纯化缓冲液进行了优化，经优化后的整个过程如下：

将上述(实施例3)得到的上清液用与其相同体积的清洗缓冲液1(5mMNaH₂PO4，30mMNaCl，20mM咪唑)稀释，得稀释的蛋白样品待用；

将50％Ni-NTA纯化柱加入空柱中，待Ni-NTA保存液流净后加入平衡缓冲液(B-per：清洗缓冲液1(v/v)＝1:1)进行平衡；

按照1：4(柱体积：上样量,v/v)加入稀释的蛋白样品，4℃孵育过夜，待全部通过Ni-NTA纯化柱后，用8倍柱体积的清洗缓冲液1清洗纯化柱，用8倍柱体积的清洗缓冲液2(5mMNaH₂PO4，30mMNaCl，50mM咪唑)清洗缓冲柱，然后用4倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱(5mMNaH₂PO4，30mMNaCl，250mM咪唑)，1mL/管分布收集洗脱液。SDS-PAGE分析蛋白的纯度及管数，最后将所有高纯度的蛋白混在一起(参见图3)。由图3可见纯化后的蛋白纯度很高。

实施例5

浓缩、脱盐(去咪唑)缓冲液优化

将纯化后的蛋白溶液通过Ultra-15(Millipore，USA)离心柱浓缩脱盐(去咪唑)，在此过程中发现蛋白容易产生沉淀，为此对浓缩脱盐(去咪唑)过程进行了优化。比如将24mL蛋白洗脱液离心后，浓缩至3mL，先离心浓缩至3mL，然后加入稀释的PBS缓冲液，离心6次后，每次查看上清液中是否出现蛋白沉淀，结果发现采用1-5倍稀释的PBS缓冲液时都会出现沉淀，而在采用10倍稀释的PBS缓冲液时没有出现沉淀，并且蛋白得到浓缩,因此采用10倍稀释的PBS做为最后的浓缩、脱盐的缓冲液。

具体步骤如下:将上述纯化后的蛋白溶液通过Ultra-15(Millipore，USA)离心柱浓缩脱盐(去咪唑)，将纯化后的蛋白溶液加入超滤管中，4000g，30min，补充加入PBS(5mMNaH₂PO4，30mMNaCl)，多次离心至咪唑浓度很低(<1mM)。

实施例6

腹腔注射分析NPY的促生长效果

将上述得到的浓缩、脱盐的NPY蛋白定量，然后稀释到30ug/ml，然后采用腹腔注射的方法以1ug/g体重的剂量注射到牙鲆中，同时注射同等剂量PBS为对照，30天后分析摄食及体重情况。结果显示注射NPY的牙鲆摄食较对照组有17％的增长(图4)。在注射10天左右，NPY组(20.92g)和对照组(21.03g)没有差别，而在20天时NPY组较对照组出现微小差异，而在30天时NPY组体重达到31.05g，而对照组只有29.05g(图5)。经过ANOVAt-检验分析发现NPY组和对照组的摄食和体重具有明显的差异(p<0.05)。