水稻小分子RNA osa-miRNA530在调控水稻叶夹角及叶片长度中的应用

摘要

本发明公开了水稻小分子RNA？osa-miRNA530在调控水稻叶夹角及叶片长度中的应用。本发明从水稻日本晴中分离克隆到microRNA？osa-miR530，该microRNA的前体基因pre-miR530在水稻中过量表达后，发现转基因株系和野生型对照相比，过表达株系叶夹角和叶片长度均变小。因此，在水稻中过量表达osa-miR530对于减小叶夹角，提高种植密度，促进水稻产量提高具有重要意义，这为水稻高产分子育种提供新的资源和研究方法。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种水稻小分子RNAosa-miRNA530在调控水 稻叶夹角及叶片长度中的应用。

背景技术

水稻是一种重要的粮食作物，也是单子叶植物研究的模式植物。叶片形态是水稻“理想 株型”的重要组成部分，是当前水稻高产育种关注的重点。水稻叶片形态主要包括叶片卷曲 度、叶夹角、披散程度以及叶片大小等方面(徐静等，作物学报，2013,39:767-774)。研究 表明，直立叶片群体的光合效率高于平展或弯垂叶，能够有效促进光合作用和种子灌浆，从 而提高水稻的产量。

前人研究表明，影响植株空间伸展姿态的叶夹角主要通过叶角基因调控油菜素内酯的信 号传导来影响叶枕细胞的生长发育，此外其他多种植物激素，包括乙烯、生长素、赤霉素， 参与调控了植物叶夹角的大小。叶作为一种不对称性的侧生器官，在发育过程中经历了3个 轴向的极性建成：“基－顶”轴向(从叶基指向叶尖)、“近－远”轴向(上表面－下表面)和 “中－侧”轴向(由中脉指向左右两边叶缘)(Hassonetal.,CRBiologies,2010,333:350-360)。 水稻叶片形态建成极性建立是一个复杂过程，参与调控因子间形成相互调节和拮抗网络。从 目前的研究来看，I类KNOX基因家族，以及H-ZIPIII、KANADI和ARFs等基因家族的 成员在水稻叶基顶轴、近远轴极性建立过程中具有重要作用；同时，参与水稻侧生器官极性 建立及发育过程的基因中还受microRNA和ta-siRNA的调控。目前为止，所有已克隆的叶形 调控基因间相互调控关系的研究还不够深入,还不能明确水稻叶形建成和发育的分子调控网 络。本发明从水稻日本晴中分离克隆到一个小分子RNAosa-miR530，研究了其在调控水稻叶 夹角和叶片长度方面的作用。Liu等已经在水稻中预测了该microRNA的序列(LiuBetal., 2005,PlantPhysiol,139:296-305)，但目前还没有任何相关功能研究的报道。

发明内容

本发明从水稻日本晴中分离克隆到microRNAosa-miR530，该microRNA的前体基因 pre-miR530在水稻中过量表达后，发现转基因株系和野生型对照相比，过表达株系叶夹角和 叶片长度均变小。因此，在水稻中过量表达osa-miR530对于减小叶夹角，提高种植密度，促 进水稻产量提高具有重要意义，这也为水稻高产分子育种提供新的资源和研究方法。

本发明申请人以水稻的一个microRNAosa-miR530为研究对象，研究了osa-miR530在改 变水稻叶夹角及叶片大小方面的作用及应用。osa-miR530的成熟体序列为20bp核酸序列(5’ -TGCATTTGCACCTGCACCTA-3’；SEQIDNO：1)。其前体序列大小为157bp(SEQIDNO： 2)。本发明利用水稻日本晴叶片的cDNA作为模板，利用PCR的方法扩增出水稻osa-miR530 的前体基因，将其正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-ubi上，并通过农杆菌介导的遗传 转化方法转化水稻，从而获得超量表达osa-miR530的转基因水稻植株。在T3代转基因植株 中，阳性植株的叶夹角和叶片长度均显著低于非转基因对照植株。叶夹角降低了约50％，长 度降低约20-30％。

本发明的优点在于：

(1)本发明首次分离克隆了osa-miR530及其前体基因，并在水稻中过量表达了 osa-miR530。提供了一种通过调控miRNA的表达来调控叶夹角大小和叶片长度的方法。

(2)本发明的miRNAosa-miR530能成功调控水稻叶夹角和叶片长度，这有助于明确 osa-miR530在调控植物株型形态建成过程中的作用机制。

(3)由于植物microRNA序列和功能的高度保守性，本发明的结果对于研究水稻等禾谷 类作物以及其它植物miR530在植物株型调控中的作用具有重要价值。

附图说明

图1为本发明的osa-miR530表达载体的构建示意图。将克隆在pMD18-T载体上的 osa-miR530利用BamHI和SpeI酶切，替换pCAMBIA1390-ubi植物表达载体上BamHI和SpeI 之间的DNA片段，这样osa-miR530正向插入玉米泛素基因启动子(Pubi)后，即 pCAMBIA1390-ubi-Osa-miR530植物表达载体。

图2为检测T3代转基因水稻阳性植株中osa-miR530转录本相对表达水平结果图。其中 osa-miR530-ox表示转osa-miR530的植株，#a-1、#a-4、#b-1、#b-2和#c-1代表独立的阳性 转基因株系；WT代表野生型水稻植株。EF-1a作为荧光定量PCR分析的内参基因。

图3为转osa-miR530水稻植株和野生型植株在成熟期叶夹角比较图。A图是成熟期植株 剑叶夹角比较图；B图是成熟期植株叶夹角对比统计图。其中osa-miR530-ox表示转 osa-miR530的植株，#a-1、#b-1和#c-1代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植 株。**表示根据TTEST统计学分析差异极显著(P<0.01)。

图4为转osa-miR530水稻植株和野生型植株在成熟期叶片长度对比统计图。A图是成熟 期植株主茎剑叶和倒二叶叶片长度比较图；B图是成熟期植株剑叶和倒二叶叶片长度对比统 计图。其中osa-miR530-ox表示转osa-miR530的植株，#a-1、#b-1和#c-1代表独立的阳性转 基因株系；WT代表野生型水稻植株。**表示根据TTEST统计学分析差异极显著(P<0.01)。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，并描述了本发明在分离克隆osa-miR530、构建表 达载体以及验证功能的方法。根据以下的描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的 基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改， 以使其使用不同的用途和条件。

实施例1：osa-miR530前体基因DNA片段的克隆

采用TRIZOL试剂(Invitrogen)从水稻品种日本晴幼苗叶片中提取总RNA。具体步骤如 下：将20毫克叶片放至液氮预冷的研钵中，加入液氮快速磨成粉末，将粉末装入1.5ml离 心管中，迅速加入1mlTrizol(Invitrogen)颠倒混匀，室温静置5分钟。在4℃，12000rpm 离心10分钟，取上清液移至新的1.5ml离心管中。加入200μl氯仿，用手剧烈摇动15秒钟， 室温静置2-3分钟。4℃，12000rpm离心15分钟。取无色水相至一新的1.5ml离心管中，加 入250μl异丙醇，250μl高盐溶液，颠倒混匀，室温静置10分钟。4℃，12000rpm离心10 分钟，吸除上清液。加入1ml冰冷的75％乙醇，上下倒置几次，然后4℃，7500rpm离心5 分钟，弃上清，在室温下干燥至沉淀变透明。加入适量的DEPC水(一般为60μl)溶解沉淀， 利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。

利用反转录酶SuperScriptII(Invitrogen)将其反转录成cDNA，具体步骤如下：依次加 入1μl500μg/mloligo(dT)12-18、2μg总RNA、1μl10mMdNTP混合物和DEPC水至12 μl，在65℃水浴中5分钟，迅速冰浴5分钟，稍微离心收集样品于管底。然后依次加入4μl 5×第一链缓冲液、2μl0.1MDTT和1μlRNaseOUT(40U/μl)，42℃，2分钟。然后加入1μl SuperScriptII，轻微混合均匀，42℃反应50分钟，然后70℃水浴15分钟使酶失活，这样就 合成了第一链cDNA，以第一链cDNA为模板扩增目的基因。通过网站http://www.mirbase.org 找到osa-miR530的成熟体和前体序列，具体序列信息如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。 根据osa-miR530前体序列，设计带有BamH1酶切位点的上游引物：530-OS (CGGGATCCGTGATAGAGCTGCATTTGCA，SEQIDNO：3)和带有Spe1酶切位点的下游引 物530-OAS(GGACTAGTATGACATAGTTGCATCTGCCT，SEQIDNO：4)。以反转录得到的 水稻日本晴幼叶cDNA为模板，利用530-OS和530-OAS为引物，在TakaraExTaq(TaKaRa) 的作用下扩增目的片段，PCR反应条件是：94℃预变性3分钟；94℃1分钟，54℃30秒， 72℃20秒，30个循环，72℃后延伸10分钟。将扩增产物回收纯化后，连接到pMD18-TSimple 载体(TaKaRa)。筛选阳性克隆并测序，获得所需DNA片段(序列如SEQIDNO：2所示)， 将该克隆命名为pMD18-osa-miR530cDNA。

实施例2：osa-miR530前体基因植物表达载体的构建和遗传转化

为了能更好地分析osa-miR530的功能，申请人通过过量表达技术使osa-miR530在水稻 中表达水平提高。根据转基因植株的农艺性状特征研究该基因的功能。

osa-miR530前体基因植物表达载体的构建方法如下：首先将实施例1中得到的阳性克隆 pMD18-osa-miR530cDNA用BamHI和SpeI双酶切，回收插入片段；并用同样的方法酶切 pCAMBIA1390-ubi的植物表达载体，回收载体片段。用回收的插入片段和载体片段做连接反 应，转化大肠杆菌DH5ɑ。通过酶切筛选阳性克隆，获得植物表达载体，命名为 pCAMBIA1390-ubi-Osa-miR530(见图1)。pCAMBIA1390-ubi是在国际常用的植物遗传转化 载体(见图1)。将pCAMBIA1390-ubi-Osa-miR530转化至农杆菌菌株EHA105。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系(参见本发明后面的实施例)将其导入到水稻品种 日本晴中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、移苗得 到转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化体系在Hiei等人报道的方法基础上进行改良(Hiei 等，1994，PlantJ.，6:271-282)。转化共获得16株独立的转基因水稻植株。

具体步骤如下：

(1)愈伤诱导：去壳的野生型日本晴水稻种子，用70％乙醇表面消毒1分钟；5％(活 性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟；无菌水冲洗4-5次；播种于愈伤诱导培养基上诱导 愈伤组织(成分见后)，于25-26℃暗培养4-7天后，将从成熟胚盾片处诱导出初生愈伤组 织，同时用镊子去掉胚上长出的胚芽，继代于愈伤诱导培养基继续培养2周，直至长出色泽 淡黄，质地坚硬呈颗粒状的胚性愈伤组织。

(2)愈伤组织的预培养：将愈伤组织转至新鲜的愈伤诱导培养基培养，于25-26℃暗培 养4天。

(3)农杆菌培养：挑取农杆菌单克隆接种到5mLYEP液体培养基中(含有50mg/L的 卡那霉素)，28℃，220rpm，培养至对数生长晚期(大约培养18-24小时)。将获得的菌液 按1％接种量转接到50mL新鲜的、含有50mg/L卡那霉素的AB液体培养基中(成分见后)； 28℃，220rpm，培养至OD600值为0.5左右(培养5-6小时)。

(4)农杆菌侵染：把50mL菌液转入离心管，4℃，4000g离心10分钟，弃上清， 加入等体积的AAM培养基重悬菌体。把(2)的日本晴胚性愈伤组织浸入上述AAM菌液， 侵染2分钟，缓慢摇动。用无菌吸水纸将愈伤组织吸干，置于共培养培养基上(培养基上铺 一层无菌滤纸)，26℃，黑暗共培养2-3天。

(5)愈伤洗涤和选择培养：共培养后的愈伤组织用无菌水洗4次，然后再用含500mg/L 羧苄青霉素Cb的无菌水洗2次，再用无菌吸水纸吸干后置于工作台吹30分钟。将愈伤组 织置于固体筛选培养基(含有25mg/L潮霉素，400mg/L羧苄青霉素)上，26℃暗培养2 周。然后转移到固体筛选培养基(含有30mg/L潮霉素，300mg/L羧苄青霉素)上，26℃ 暗培养，每2周继代一次，筛选4周。

(6)分化培养：把抗性愈伤组织转移至分化培养基上，28℃光照培养7天，转接一次 后，培养至产生再生苗。

(7)壮苗、移栽：将再生的小植株转至新鲜的1/2MS培养基上，于培养瓶中生根壮苗。 待小苗长至10cm左右，打开封口膜，炼苗2-3天，将再生苗移至土中培养。

试剂配方：

(1)试剂和溶液缩写：本发明中作用到的植物激素的缩写表示如下：Cb(Cabenicillin, 羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthaleneaceticacid，萘乙酸)；2，4-D(2， 4-Dichlorophenoxyaceticacid,2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)；DMSO (Dimethylsulfoxide,二甲基亚砜)。

(2)用于水稻遗传转化的培养基配方：

1)YEP液体培养基：2gBacto-蛋白胨，2g酵母粉，1gNaCl，加水定容至200mL，用 5NNaOH调pH至7.0。

2)愈伤诱导培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30 g/L蔗糖，2mg/L2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH5.8。

3)AB液体培养基：3g/LK₂HPO₄，1g/LNaH₂PO₄，1g/LNH₄Cl，300mg/LMgSO₄·7H₂O， 150mg/LKCl，10mg/LCaCl₂·2H₂O，2.5mg/LFeSO₄·7H₂O，5g/L葡萄糖，pH7.0。

4)AAM培养基：AA大量，AA微量，0.9g/LL-谷氨酰胺，0.3g天冬氨酸，MS维生素， 0.5g/L酸水解酪蛋白，36g/L葡萄糖，68.5g/L蔗糖，20mg/LAS，pH5.2。

5)共培养培养基：N6大量，N6微量，铁盐，N6维生素，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖， 0.5g/L酸水解酪蛋白，2mg/L2,4-D，20mg/LAS，Gelrite(Sigma)4g/L，pH5.8。

6)固体筛选培养基：N6大量、N6微量和N6维生素，0.5g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗 糖，2mg/L2,4-D，Gelrite(Sigma)4g/L，pH5.8，合适浓度的潮霉素和羧苄青霉素。

7)分化培养基：MS大量，MS微量，铁盐和MS维生素，2g/L酸水解酪蛋白，30g/L 蔗糖，30g/L山梨醇，2mg/LKT，0.2mg/LNAA，pH5.8，30mg/L潮霉素B，200mg/L羧 苄青霉素。

8)1/2MS培养基：1/2MS大量，1/2MS微量，MS维生素，30g/L蔗糖，4g/LGelrite， 30mg/L潮霉素B，200mg/L羧苄青霉素，pH5.8。

(3)主要溶液配方：

1)N6大量元素(10×)

2)N6微量(1000×)：

3)N6维生素(1000×)

4)MS大量元素(10×)

5)MS微量(1000×)：

6)MS维生素(1000×)

7)铁盐(200×)

FeSO₄.7H₂O5.56g

Na₂EDTA.2H₂O7.46g；

8)AA大量(200×)

9)AA微量(1000×)

10)2,4-D储存液(2mg/ml)

称取2，4-D100mg，溶于1mlDMSO，加入蒸馏水定溶至49ml，然后加入0.5NNaOH， 至完全溶解，于-20℃保存。

11)Kinetin储存液(0.2mg/ml)

称取Kinetin10mg，溶于1ml1NKOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。

12)NAA储存液(0.2mg/ml)

称取NAA10mg，溶于0.5ml1NKOH，加蒸馏水定溶至50ml，于4℃保存。

13)乙酰丁香酮(100mg/ml)

称取乙酰丁香酮100mg，溶于1mlDMSO，于-20℃保存。

14)卡那霉素(50mg/ml)

称取卡那霉素500mg，溶于8ml蒸馏水中，加蒸馏水定溶至10ml，然后用0.22μm滤 器过滤除菌，于-20℃保存。

实施例3：检测转基因水稻植株和野生型水稻中osa-miR530的表达水平

以水稻野生型日本晴和5个独立的T3代转基因水稻植株为材料，提取四叶期水稻叶片的 RNA，利用RT-PCR检测水稻叶片中osa-miR530的转录本水平。具体方法如下：采用Takara MiniBESTUniversalRNAExtractionKit(Takara)试剂盒，从100mg四叶一心期水稻叶片中 提取总RNA，并通过试剂盒中带有的基因组DNA去除离心柱去除基因组DNA的污染。具 体步骤如实施例1的描述。

利用miRcutemiRNAcDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN)合成miRNA对应的cDNA 第一链。根据PrimeScriptTMRTEnzymeMixI(TaKaRa)说明书合成cDNA第一链。具体 步骤如下：在冰预冷RNasefree的反应管内加入TotalRNA2μg，E.coliPoly(A)Polymerase0.4 μl，10×Poly(A)PolymeraseBuffer2μl，5×rATPsolution4μl，加入RNase-freeddH₂O将总体 积补至20μl)。移液器轻轻混匀上述反应液，短暂离心后在37℃反应60分钟。所得反应液可 直接用于下游实验，也可放入-20℃或-80℃冻存。在一新的RNase-free离心管中加入2μl Poly(A)反应液，10×RTPrimer2μl，10×RTBuffer2μl，超纯dNTPMixture(2.5mMeach)1μl， RNasin(40U/μl)1μl，QuantRTase0.5μl，RNase-freeddH₂O11.5μl，用移液器将上述反应液 轻轻混匀后，短暂离心后在37℃反应60分钟。

以上述cDNA为模板，根据miRcutemiRNA荧光定量检测试剂盒(TIANGEN)，对四叶 一心期野生型和转入pCAMBIA1390-ubi-osa-miR530的转基因水稻中osa-miR530的表达水平 进行鉴定，荧光定量所用反向引物均为试剂盒自带引物。设计合成osa-miR530的正向引物 osa-miR530-RF(5’-cgccTGCATTTGCACCTGCACCTAC-3’，SEQIDNO：5)。osa-miR530的 定量PCR具体操作步骤如下：室温融化2×miRcutemiRNAPremix和ReversePrimer，使用时 将2×miRcutemiRNAPremix上下颠倒混匀，避免起泡，并经轻微离心后使用。在灭菌离心管 中配置如下组分进行荧光定量PCR分析：2×miRcutemiRNAPremix(含SYBR和ROX)10μl， osa-miR530-RF(10μM)0.4μl，ReversePrimer(10μM)0.4μl，50×ROXReferenceDye1.6μl， miRNA第一链cDNA不超过2μl，补充ddH₂O至20μl。同时用水稻5.8srRNA作为荧光定 量PCR分析的内参基因，其特异上游引物为5.8s-RF(5’-GAACGACTCTCGGCGGCTA-3’， SEQIDNO：6)。PCR反应条件是94℃预变性2分钟，94℃变性20秒，60℃退火延伸34秒， 40个循环。PCR反应结束后，分析各个样品的扩增曲线和溶解曲线以确定实验结果的可信度。 然后用Excel通过2-ΔΔCt法处理荧光定量PCR获得的Ct值并计算标准误差，对最终处理结 果作图。结果表明过表达株系中osa-miR530的转录本水平是非转基因水稻植株的3-7倍，从 而证明osa-miR530前体基因已整合到水稻基因组中并且在水稻中大量表达(图2)。

实施例4：osa-miR530转基因水稻的叶夹角变小

本实施例分析了转基因水稻植株和野生型水稻植株在成熟期的叶夹角。具体步骤如下： 将转基因植株(#a-1、#b-1和#c-1)和非转基因野生型植株的种子用70％乙醇表面消毒1分 钟；5％(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟，然后无菌水冲洗4-5次，在暗条件下 萌发3天。随后转移到土壤中生长至三叶期，移栽至大田中培养至成熟期，于成熟期测定转 基因植株和野生型植株的叶夹角，拍照，并通过TTEST进行统计学分析野生型和转基因植株 叶夹角差异的显著性。以非转基因野生型植株的株高作为100％，在成熟期(图3A、3B) osa-miR530转基因水稻植株的叶夹角降低了约50％。

上述结果表明，osa-miR530过量表达导致水稻叶夹角显著变小。

实施例5：osa-miR530转基因水稻植株和野生型植株成熟期叶片长度比较

本实施例分析了转基因植株和野生型植株成熟期叶片长度。具体步骤如下：转基因和野 生型水稻种子用70％乙醇表面消毒1分钟；5％(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟； 无菌水冲洗4-5次，在暗条件下萌发3天。随后转移到土壤中生长至三叶期，移栽至大田中 培养至成熟期，测定转基因植株和非转基因野生型植株的叶片长度、拍照，并利用TTEST进 行统计学分析野生型和转基因植株叶片长度差异的显著性(图4)。结果表明，osa-miR530过 量表达能够导致成熟期水稻植株叶片变短。同时我们测定了成熟期水稻植株剑叶和倒二叶叶 片的长度，结果显示转基因水稻的剑叶和倒二叶长度均小于非转基因水稻(图4A和4B)，长 度降低约为20-30％。这些结果表明，osa-miR530过量表达能够抑制水稻叶片的长度。