大豆根瘤内生菌及其应用，生防菌剂及生物促生菌剂

摘要

本发明公开了一种大豆根瘤内生菌及其应用，生防菌剂及生物促生菌剂，属于作物栽培种植及作物病害生物防治技术领域。本发明中大豆根瘤内生菌为粘质沙雷氏菌(Serratia？sp.)DSer1305(保藏编号：CCTCC？NO:M？2013624)，是从大豆根瘤样品中分离出的一株内生细菌，为革兰氏阳性菌；菌体呈短杆状，无芽孢，菌落呈乳白色，边缘圆整、突起有光泽，表面有皱褶；该菌能产生铁载体和果胶酶，抗小麦赤霉病菌并促进小麦发芽及幼苗生长，可用于制备生防菌剂和生物促生菌剂。

说明书

技术领域

本发明涉及一种大豆根瘤内生菌，同时还涉及该内生菌的应用，以及采用该内生菌制 备的生防菌剂及生物促生菌剂，属于作物栽培种植及作物病害生物防治技术领域。

背景技术

小麦是我国大宗作物，但是每年仍依靠施用大量化肥来提高产量，而过量施用化肥会 对土壤结构和生态环境产生极大破坏，同时对有益微生物的生存构成威胁，并且化学药剂 过度使用易诱导病菌产生抗药性，给粮食安全带来严重问题。目前，开发和筛选微生物促 生菌来研发生物促生菌剂，对保持绿色农业和生态环境的可持续发展具有重要意义。

土壤微生物如Azospirillumsp.,Enterobactersp.,Pseudomonassp.,Klebsiellasp.,Serratia sp.,Bacillussp.Enterobactersp.,Pantoeasp.,Listeriasp.Xanthomonassp.,Micrococcusspp. 等均对作物生长具有促进作用，其中分离自小麦和草类根际的固氮菌Bacillus能有效提高 作物产量和干物质重量，分离自黑麦草根际的Enterobacterludwgii对提高黑麦草茎、根的 鲜重和高度有明显的促进作用，分离自小麦根部的Xanthomonassp.Xs148对冬小麦具有促 生长作用，等等。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆根瘤内生菌。

同时，本发明还提供一种大豆根瘤内生菌的应用。

最后，本发明再提供一种能够抑制小麦赤霉病菌的生防菌剂，以及促进小麦发芽和幼 苗生长的生物促生菌剂。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

大豆根瘤内生菌，其名称为粘质沙雷氏菌(Serratiasp.)DSer1305，保藏编号：CCTCC NO:M2013624，保藏日期：2013年12月1日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。

粘质沙雷氏菌(Serratiasp.)DSer1305是从大豆根瘤样品中分离出的一株内生细菌， 经革兰氏染色菌体呈紫色，为革兰氏阳性菌。该菌呈短杆状，大小0.5×0.8μm左右，无芽 孢；菌落呈乳白色，大小3～5mm，边缘圆整、突起有光泽，表面有皱褶。

大豆根瘤内生菌的应用，包括：粘质沙雷氏菌(CCTCCNO:M2013624)在制备铁载 体和/或果胶酶中的应用，在制备抑制小麦赤霉病菌的生防菌剂中的应用，以及在制备促进 小麦发芽和幼苗生长的生物促生菌剂中的应用。此外，还包括在防治小麦赤霉病害、促进 小麦发芽和幼苗生长中的应用。

用于防治小麦赤霉病害的生防菌剂，其包含粘质沙雷氏菌(CCTCCNO:M2013624)。

用于促进小麦发芽和幼苗生长的生物促生菌剂，其包含粘质沙雷氏菌(CCTCCNO:M 2013624)。

本发明的有益效果：

本发明中大豆根瘤内生菌为粘质沙雷氏菌(Serratiasp.)DSer1305(保藏编号：CCTCC NO:M2013624)，是从大豆根瘤样品中分离出的一株内生细菌，为革兰氏阳性菌；菌体呈 短杆状，无芽孢，菌落呈乳白色，边缘圆整、突起有光泽，表面有皱褶；该菌能产生铁载 体和果胶酶，抗小麦赤霉病菌并促进小麦发芽及幼苗生长，可用于制备生防菌剂和生物促 生菌剂。

保藏证明和存活证明说明

保藏菌株：粘质沙雷氏菌(Serratiasp.)DSer1305，保藏编号：CCTCCNO:M2013624， 保藏日期：2013年12月1日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地 址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)。

附图说明

图1为粘质沙雷氏菌DSer1305经革兰氏染色后的菌体形态；

图2为菌株DSer1305的菌落形态；

图3为菌株DSer1305的生长规律曲线图；

图4为菌株DSer1305对小麦赤霉病菌的抑制效果；

图5为菌株DSer1305产铁载体的图片；

图6为菌株DSer1305产果胶酶的图片；

图7为接种菌株DSer1305对小麦幼苗生长的影响。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

大豆根瘤内生菌的分离、纯化和保存，包括：

1)取河南栽培型大豆根瘤，先用无菌水冲洗根瘤表面4次(3～5次均可)，以去除表 面灰尘，再用无水乙醇浸泡25s(20～30s均可)，以去除表面极性物质，使用4％次氯酸钠 (3％～5％均可)消毒4min(3～5min均可)，然后用无菌水冲洗6次(5～8次均可)，用无 菌镊子夹碎根瘤，将汁液划在牛肉膏蛋白胨培养基表面(配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g， NaCl5g，琼脂18g，水1000mL；自然pH)，28℃倒置培养4d(3～5d均可)；

2)根据菌落特征挑取单菌落反复划线(菌落典型特征为乳白色，边缘圆整、突起有 光泽，表面有皱褶)，经染色、镜检，直至获得纯种单菌落；

3)将纯种单菌落接种在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，培养至菌苔饱满，短期保存在4℃ 冰箱内，长期保存在30％(v/v)甘油中并置于-80℃冰箱内；同时吸取100μL最后一次冲 洗过根瘤的水，涂布在牛肉膏蛋白胨培养基表面，28℃培养48h，观察有无菌落长出，以 验证表面消毒的彻底性。

1、菌体特征

大豆根瘤内生菌经革兰氏染色菌体呈紫色，为革兰氏阳性菌(见图1)。该菌呈短杆 状，大小0.5×0.8μm左右，无芽孢；菌落呈乳白色，大小3～5mm，边缘圆整、突起有光泽， 表面有皱褶(见图2)。接种在YM液体培养基中，30℃、130rpm振荡培养72h，每小时测 定600nm波长的吸光度值(OD)，生长规律曲线见图3。

2、菌株分子鉴定

大豆根瘤内生菌经16SrDNA序列扩增(引物P1、P6为通用引物，序列见SEQIDNO.2、 SEQIDNO.3，扩增序列大小为1406bp，序列见SEQIDNO.1，基因序列号KT964299)， 送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。根据测序结果，将扩增得到的序列在GenBank中 进行BLAST分析，用DNAMAN6.0进行序列相似性分析，16SrRNA结果表明该菌株与 SerratiamarcescensN-2(JX868557)的相似率为100％。

结合分子鉴定结果及菌体特征，命名该菌株为粘质沙雷氏菌(Serratiasp.)DSer1305， 并送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCCNO:M2013624，保藏日期：2013 年12月1日，保藏地址：中国武汉.武汉大学(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中 心)。

试验例

1、粘质沙雷氏菌DSer1305抑制小麦赤霉病菌特性

采用对峙培养法测定菌株DSer1305对小麦赤霉病菌的抑制作用，包括：

1)制备菌悬液：在超净工作台上用无菌接种环挑取适量DSer1305接种到灭过菌的牛 肉膏蛋白胨液体培养基内(不含琼脂)，置于恒温摇床30℃震荡130rpm培养4d后(4～5d 均可)，10000r/min冷冻离心10min收集菌体，使用0.9％无菌生理盐水调整菌悬液OD₆₀₀≈1， 置于4℃冰箱备用；

2)待PDA平板上事先接种的赤霉病菌菌落长至直径2.5cm(2～3cm均可)，用移液 器取同一株菌的菌悬液5μL接种到距离平皿边缘2.5cm处病原菌落周围，接种3次，呈“等 边三角形”，对照接种等量无菌水；

3)每隔24h测量和照相一次，重复3次，并计算抑菌效果，结果见图4及下表1。图 4中A为对照，B为培养72h处理组。

抑菌率的计算公式见下式1：

式1：抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)×100％/(对照菌落直径)。

表1菌株DSer1305对小麦赤霉病菌的抑制作用

注：CK代表对照；¹为培养24h,²为培养48h,³为培养72h。表中数据为平均值±标准 差，同列数据后面不同字母表示在p<0.05水平差异显著。

由表1可知，在平板上接菌后培养至72h时，菌株DSer1305对小麦赤霉病菌的抑制 率为65.57％，明显高于48h和24h的抑制作用，和对照组相比对小麦赤霉病菌的抑制作用 效果差异显著。

2、粘质沙雷氏菌DSer1305产生铁载体特性

采用CAS检测平板法检测菌株产生铁载体能力，包括：在铁载体检测培养基(刃天青 (CAS)60.5mg/L，FeCl₃.6H₂O1mmol/L，十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)72.9mg/L，pH7.0， 琼脂20g/L。)平板上点接同一株菌，均匀接种三点，菌悬液(OD₆₀₀≈1)每次接种量为4μL (3～5μL均可)，置于28℃恒温培养箱培养1h后再倒置培养3d。观察并测量橙黄色晕圈 大小和菌落直径，结果见图5及下表2。

表2菌株DSer1305在铁载体检测培养基上产生铁载体能力分析

由图5和表2可知，菌株DSer1305具有较强的产生铁载体的能力。

3、粘质沙雷氏菌DSer1305产生果胶酶特性

1)果胶酶活性菌株初筛

在牛肉膏蛋白胨培养基中按照质量体积百分含量添加0.5％果胶，点接粘质沙雷氏菌 DSer1305，一个培养皿中接种5点，在30℃下恒温培养5天，培养基表面用质量浓度为 2％的十六烷基三甲基溴化铵溶液浸润30min，倒去十六烷基三甲基溴化铵溶液，用1MNaCl 溶液清洗培养基表面，观察菌落周围区域。菌落周围有透明圈产生者为阳性；没有透明圈 产生者为阴性，透明圈越大说明产生果胶酶的活力越强。

2)果胶酶活性菌株复筛

点接初筛中果胶酶活性菌株，一个培养皿中一株菌均匀点接三个位置，接菌量为3μL (1～5μL均可)，在30℃下培养4d(2～4d均可)，培养基表面用质量浓度为2％的十六烷基 三甲基溴化铵溶液浸润30min，倒去十六烷基三甲基溴化铵溶液，用1MNaCl溶液清洗培 养基表面，观察并测量透明圈直径和菌落直径，结果见图6及下表3。

表3菌株DSer1305在平板上产生果胶酶能力分析

由图6和表3可知，粘质沙雷氏菌DSer1305具有产生果胶酶的特性。

4、粘质沙雷氏菌DSer1305对小麦发芽和幼苗生长的影响试验

1)菌悬液的制备

将保存在试管中的粘质沙雷氏菌DSer1305接种在YM液体培养基内，28℃(25～30℃ 均可)培养4d(3～4d均可)，10000rpm(8000～12000rpm均可)离心9min(8～10min均可)， 收集菌体，使用0.9％(m/v)生理盐水调整菌悬液OD≈1(约10^9～10cfu/mL)，取制备好的 菌悬液与无菌水按比例1:2、1:1、2:1(V/V)混合，备用；

2)种子挑选

挑选饱满、无霉变、大小均一、无破损的小麦种子，品种为周麦18，国家审定小麦品 种，先用无菌水冲洗7次(5～8次均可)，以冲去表面灰尘；

3)种子吸胀和接种菌悬液

先用无菌水浸泡冲洗过的小麦种子，置于30℃恒温培养箱、遮光16h使其充分吸水(即 吸胀)，过滤除去多余水分；再将菌悬液与无菌水的混合液分别置入烧杯中浸泡吸胀的小 麦种子3.5h(3～4h均可)，无菌水作为对照(CK)，使种子与菌悬液充分接触，后置于28℃ (25～30℃均可)恒温培养箱中，直到种子露白(即接菌)；

4)促进种子发芽及幼苗生长试验

把露白种子点播在直径为12cm、高3cm盛有无菌滤纸的玻璃平皿中，每皿播种40粒 种子，而后每皿喷洒5mL无菌水，置于14h光周期23℃、10h暗周期30℃，相对湿度为 65％～70％，光强为1Lux的温室环境下培养5d，观察、记录出芽情况；每隔一天接种菌悬 液30mL，每2d浇1次无菌水，以保持皿内的相对湿度，只接等量无菌水的作为对照(CK)， 每个处理3个重复，每个重复3组平行；3天后测定皿内小麦种子的出芽率、成活率，培 养1周后测定幼苗的苗高、根长、根数、鲜量等指标，用SPSS11.0软件统计分析，评价 接种菌株DSer1305对小麦种子发芽和幼苗生长的影响，结果见图7及下表4～6。图7中A、 B、C依次代表对照组与比例1:2处理组、1:1处理组及2:1处理组的对比结果。

表4接种菌株DSer1305对小麦发芽率的影响

表5接种菌株DSer1305对小麦成活率的影响

由表4、表5可知，比例1:1处理组的发芽率和成活率为99.44％，均低于对照组 (99.72％)；比例2:1处理组的发芽率及成活率稍高于对照组。

由表6可知，比例1:2处理组的苗高、根长、根数和鲜重均高出对照组(CK)和其他 处理组，而对照组的各项指标均低于处理组。并且，处理组中菌悬液:无菌水＝1:2为最佳配 比。

表6接种菌株DSer1305对小麦幼苗生长的影响

注：同栏每列数据后不同小写字母表示p<0.05水平的差异性显著。

实施例2

粘质沙雷氏菌DSer1305(CCTCCNO:M2013624)在制备抑制小麦赤霉病菌的生防菌 剂中的应用(或是在防治小麦赤霉病害中的应用)，具体为：取菌株DSer1305扩大培养， 收集菌体，无菌水稀释后得到液态生防菌剂，直接浸泡小麦种子或喷施麦苗即可。菌种扩 大培养及菌体收集方法均为现有技术，此处不再赘述。

实施例3

粘质沙雷氏菌DSer1305(CCTCCNO:M2013624)在制备促进小麦发芽和幼苗生长的 生物促生菌剂中的应用(或是在促进小麦发芽和幼苗生长中的应用)，具体为：取菌株 DSer1305扩大培养，收集菌体后真空干燥，得到固态生物促生菌剂。在施用前与水混合， 浸泡小麦种子或喷施麦苗即可。

实施例4

用于防治小麦赤霉病害的生防菌剂，制备方法同实施例3。

用于促进小麦发芽和幼苗生长的生物促生菌剂，制备方法同实施例2。