抗污损涂料及用其防止海洋污损生物污损水下物体的方法

摘要

本发明提供了一种防止或减少海洋污损生物附着于和/或污损水下物体的表面的方法，包括以下步骤：1)获得包含一种或多种由式I表示的化合物的组合物，所述式I为：

说明书

技术领域

本发明涉及抗污损涂料及用其防止海洋污损生物污损水下物体的方法。

背景技术

海洋生物污损(Marinebifouling)是指海洋动物、植物和微生物附着积聚在被海水浸泡的基质表面，造成生物腐蚀，从而给人类生产活动及海洋生态环境产生不利影响的现象。海洋污损生物(例如藤壶，苔藓虫和贻贝等)附着和堆积在水下结构上已成为人们开发利用海洋资源所面临的全球性问题，对海事工业、海水养殖业和动力装置的冷却系统造成了巨大的技术和经济挑战(参见文献“CallowandCallow,2002”；“Qianetal.2007”；“Sieversetal.2013”)。例如,大量附着在船体上的污损生物会严重影响船舶机动性，降低航行速度,从而严重增大船舶燃料消耗量(Yebraetal.,2004)。据估计，每年因污损生物所造成的经济成本高达65亿美元(BhaduryandWright,2004)。附着在船舶上的污损生物在对海洋作业带来巨大物质和经济损失的同时，也造成了外来物种入侵等一系列海洋生态环境问题(Davidsonetal.2009)。

在过去，主要基于有毒的重金属抗微生物剂(如铜、铅、砷和镉等)的船用防污漆是人们广泛使用的抗生物污损方法。有机锡化合物，如三丁基锡(tributyitin,TBT)在过去的几十年一直被视为最有效的防污剂。不幸的是，该类有机锡防污剂对非靶向海洋生物危害极大，甚至在纳克级对非靶向海洋生物具有致畸致死毒性(Alzieu,2000)。国际海事组织(IMO)和海洋环境保护委员会(MEPC)于2008年9月17日起在全球范围内全面禁止对船舶使用含有机锡的涂料(lowCallowandCallow,2011；Lietal.,2013)。更为严重的是，目前市场上广泛使用的有机锡防污漆替代品，如Irgarol1051、敌草隆、吡啶硫铜锌、百菌清(chlorothalonil)和Sea-Nine211^TM均已被证实对海洋生态环境具有一定的危害(Bellas,2006；ThomasandBrooks,2010)。因此，我们亟需开发低毒、高效、环境友好的替代防污剂。

人们已经从海绵、珊瑚和海鞘等大型海洋固着生物中分离得到了许多抗污损活性化合物，多数化合物显现出有效、低毒的防污作用(见Faulkner(2000)和Fusetani(2004)的综述)。但是，这些活性化合物的产量供应低的问题成为其发展成为商品防污剂的绊脚石。为了克服这一问题，人们发现来自海洋无脊椎动物及植物的共附生微生物的次级代谢产物防污效果显著(见Fusetani(2011)和Qian等(2010,2015)的综述)，且种类繁多，可进行规模化发酵，无资源再生问题，是当前极被重视的研发防污剂的宝贵资源。因此，海洋微生物中的抗污损活性化合物具有开发成为新型低毒、高效、环境友好型防污剂的巨大潜力。

发明内容

本发明提供了一种使用分离自红海的海洋细菌反硝化假弧菌(Pseudovibriodenitrificans)UST4-50发酵生产活性化合物3,3'-二吲哚基甲烷(DIM)、以及通过筛选获得该化合物的活性结构类似物，从而将该类化合物作为抗生物污损物质及其实际应用的方法。本发明对3,3'-二吲哚基甲烷及其类似物进行了抗纹藤壶(Balanus(＝Amphibalanus)amphitrite)及总合草苔虫(Bugulaneritina)(一种苔藓虫)幼虫附着活性测试。同时，对这些次级代谢产物与4-羟苯基-3,3'-二吲哚基甲烷(DIM-Ph-4-OH)的乙酰化衍生物(4-(二(1H-吲哚-3-基)甲基)乙酸苯酯,DIM-Ph-4-OAc)进行了构效关系的初步探讨。此外，对化合物DIM和DIM-Ph-4-OH进行了靶向生物毒性测试，并在海洋环境中对含有DIM的涂料进行了抗污损活性测试。

在一个方面，本发明提供了一种防止或减少海洋污损生物附着于和/或污损水下物体的表面的方法，包括以下步骤：

1)获得包含一种或多种由式I表示的化合物的组合物，所述式I为：

其中R选自H、CH₃、CHOHCH₂OH、C₈H₇N、COC₈H₇N、C₉H₆N、Ph、Ph-4-OH和Ph-4-OAc；以及

2)将有效量的所述组合物施加至所述表面，由此防止或减少海洋污损生物附着于和/或污损所述表面。

在一些实施方案中，所述化合物包括一种或多种由式II-X表示的化合物，所述式II-X分别为：

在一些实施方案中，所述一种或多种分别由式II-X表示的化合物存在于反硝化假弧菌(Pseudovibriodenitrificans)UST4-50中。

在一些实施方案中，在步骤1)中，可以将所述一种或多种化合物作为抗污损成分与成膜成分混合，由此共同形成抗污损涂料，该抗污损涂料可以用于抑制海洋污损生物附着于和/或污损涂布有该抗污损涂料的水下物体的表面。所述成膜成分可以包括但不限于用于防止海洋生物污损的防污漆中的已知的成分。这些成膜成分可以包括本领域技术人员已知的成分，例如但不限于，可水解树脂、可溶性树脂和不溶性树脂中的一种或多种。例如，所述树脂可以为甘酞树脂、丙烯酸树脂、氯化橡胶树脂、环氧树脂、硅树脂、聚酯树脂、聚氨酯树脂、含氟聚合物树脂和本领域技术人员已知的其他树脂中的一种或多种。所述成膜成分可以为油漆(例如船用油漆)中的成分。

在另一个方面，本发明提供了一种用于减少海洋污损生物附着于和/或污损水下物体的表面的抗污损涂料，包含成膜成分和抗污损成分；其中所述成膜成分包含一种或多种树脂；并且其中所述抗污损成分包含一种或多种由式I表示的化合物，所述式I为：

其中R选自H、CH₃、CHOHCH₂OH、C₈H₇N、COC₈H₇N、C₉H₆N、Ph、Ph-4-OH和Ph-4-OAc。

在另一个方面，本发明提供了一种防止或减少海洋污损生物附着于和/或污损水下物体的表面的方法，包括用本发明所述的抗污损涂料涂布所述水下物体的表面。

本发明所述的防污损方法和抗污损化合物可有效防治的海洋污损生物包括但不限于一种或多种藤壶、管虫(tubeworm)和苔藓虫。

附图说明

图1示出本发明的9种双吲哚生物碱的化学结构。化合物1–8为红海海鞘共附生细菌反硝化假弧菌(Pseudovibriodenitrificans)UST4-50的次级代谢产物,化合物8a(4-[二(1H-吲哚-3-基)甲基]乙酸苯酯，DIM-Ph-4-OAc)为化合物8(4-(二(1H-吲哚-3-基)甲基)苯酚，DIM-Ph-4-OH)的乙酰化衍生物。

图2示出(A)化合物1(二(1H-吲哚-3-基)甲烷,DIM)和(B)化合物8(4-(二(1H-吲哚-3-基)甲基)苯酚,DIM-Ph-4-OH)的纹藤壶幼虫复苏实验结果。幼虫首先分别暴露于25.39μMDIM(1)和73.93μMDIM-Ph-4-OH(8)中(其使得藤壶幼虫附着率为0)。24小时后，将幼虫转移至新鲜海水中(FSW),黑暗室温条件下孵育48小时。在对照组中，幼虫在不含任何防污剂的新鲜海水中黑暗室温条件下孵育48小时。所显示的数值为平均数±SD(n＝3)。

图3示出具有油漆涂层的PVC板在香港西贡海区(22°38′N,114°27′E)野外水下挂板5个月后的表面污损情况：(A)板No.1,底漆；(B)板No.2,5％(w/w)DIM；(C)板No.3,5％Sea-Nine211^TM；(D)板No.4,10％DIM；(E)板No.5,10％Sea-Nine211^TM；(F)板No.6,15％DIM；(G)板No.7,15％Sea-Nine211^TM。

图4示出图3所示的具有防污漆涂层的PVC板经生物统计软件ImageJ处理后的污损面积的百分比。数据＝平均数±SD(n＝3)，棒状图上的“*”表示与阴性对照的显著性差异p<0.05(Tukey’s检验，单因素ANOVA)

具体实施方式

本发明阐述如下，参考实例仅用于说明本发明。应当理解的是，阐述中提出的具体细节、关系和方法是为了全面说明本发明。然而，本领域技术人员会容易地理解，即使未提供所述一个或多个具体细节，或者使用其他方法、步骤、试剂、细胞系和动物，本发明仍是可行的。由于一些操作步骤可以按照不同顺序发生和/或与其他操作步骤同时发生，因此本发明不受说明操作步骤的先后顺序所限。此外,不需要所有举例说明的操作步骤或事件均与本发明实施方法一致。对于本领域技术人员来说，本发明中描述或引用的技术、操作步骤均是可理解的，并且可利用常规方法实施。

除非特别定义，本文所用的所有技术术语、符号和其他科学术语或专有名词均旨在具有本领域技术人员通常所理解的含义。。某些情况下，为了明确和/或用于参考，本文中定义了具有通常理解的含义的术语,并且本文的定义不应被解释为与本领域通常的理解有显著的差异。需要进一步了解的是，(例如)常用词典中所定义的那些术语应当被解释为与它们在本领域中和/或本文中的含义是一致的。

在一个方面中，本发明提供了一种防止或减少海洋污损生物附着于和/或污损水下物体的表面的方法，包括以下步骤：

1)获得包含一种或多种由式I表示的化合物的组合物，所述式I为：

其中R选自H、CH₃、CHOHCH₂OH、C₈H₇N、COC₈H₇N、C₉H₆N、Ph、Ph-4-OH和Ph-4-OAc；以及

2)将有效量的所述组合物施加至所述表面，由此防止或减少海洋污损生物附着于和/或污损所述表面。

在优选的实施方案中，所述方法防止或减少海洋污损生物附着和/或污损，同时对周围的海洋环境无毒。

在一些实施方案中，所述化合物包括一种或多种由式II-X表示的化合物，所述式II-X分别为：

在一些实施方案中，由式II-X表示的化合物均可通过化学合成方法获得(参见文献“A.R.Mullaetal.,2012”；“KaishapandDohutia,2013”)。在另一些实施方案中，由式II-IX表示的化合物可以用生物发酵的方法产生。在一些实施方案中，由式II-IX表示的化合物来源于反硝化假弧菌(Pseudovibriosp)菌株UST4-50发酵液的粗浸膏。该粗浸膏通过溶剂洗脱而得到不同极性的组分。溶剂为本领域技术人员所熟知的溶剂，如70-95体积％乙醇/水溶液、70-90体积％甲醇/水溶液、或50-70体积％丙酮/水溶液。在一些实施方案中，本文所述的化合物为经过纯化的化合物。

在一些实施方案中，所述化合物II-X中的一种或多种可以作为抗污损成分与成膜成分混合，从而形成抗污损涂料，该抗污损涂料用于抑制海洋污损生物附着于和/或污损水下物体的表面。抗污损涂料可以包括(例如)水溶性散装涂料(bulkcoating)、自抛光共聚物抗污损涂料、非粘附性涂料、低表面能抗污损涂料、粘附性涂料、仿生抗污损涂料和/或天然抗污损涂料等。成膜成分可以包括，但并不仅仅局限于已知的用于防止海洋生物污损的抗污损涂料中的成膜成分。这些成膜成分可以包括本领域技术人员已知的成分，如可水解、可溶和不溶树脂中的一种或几种，但又不局限于这几种组分。例如，所述树脂可以为甘酞树脂、丙烯酸树脂、氯化橡胶树脂、环氧树脂、硅树脂、聚酯树脂、聚氨酯树脂、含氟聚合物树脂及其组合，以及其他本领域技术人员已知的树脂。成膜成分可以为油漆(如海洋油漆)中的成分。在优选的实施方案中，抗污损涂料与涂覆表面接触，防止或减少海洋污损生物附着和/或污损，同时对周围的海洋环境友好无毒。

本发明的抗污损涂料(如防污漆)中含有有效浓度(或有效量量)的抗污损成分。所谓“有效浓度”或“有效量”是指在一定条件下，抗污损成分可以发挥显著抗污损活性的含量。例如，依据成膜成分的总量，抗污损成分的质量浓度可达到约5％、约10％或约15％(w/w)。在工艺化生产中，有效浓度可被定义为能够有效抑制或减少污损生物的幼虫和/或成体附着的浓度，污损生物例如但并不局限于一种或多种藤壶，管虫和苔藓虫。

在另一个方面，本发明提供了一种用于减少海洋污损生物附着于和/或污损水下物体的表面的抗污损涂料，包含成膜成分和抗污损成分；其中所述成膜成分包含一种或多种树脂；并且其中所述抗污损成分包含一种或多种由式I表示的化合物，所述式I为：

其中R选自H、CH₃、CHOHCH₂OH、C₈H₇N、COC₈H₇N、C₉H₆N、Ph、Ph-4-OH和Ph-4-OAc。

在另一个方面，本发明还提供了一种防止或减少海洋污损生物附着于和/或污损水下物体的表面的方法，包括用本发明所述的抗污损涂料涂布所述水下物体的表面。本发明所述的抗污损涂料的涂布量可以为例如，每层抗污损涂料的涂布厚度为120μm，涂两层。例如，针对19cm×14cm的表面，可以涂覆总量为400-500mL的抗污损涂料。

本发明所述的防污损方法和抗污损化合物可有效防治的海洋污损生物包括但不限于一种或多种藤壶、管虫和苔藓虫。在一个实施方案中，本发明提供的活性化合物和抗污损涂料至少可以抑制一种或多种污损生物的附着。在另一个实施方案中，本发明提供的活性化合物和抗污损涂料至少可以抑制一种或多种污损生物的幼虫的附着。

可涂有本发明所述的化合物和涂料的水下物体包括任何具有可以浸入海洋(包括含盐的)水环境中一段时间的表面的物体。这些物体包括但并不局限于船体的一部分、排水管道、船舶螺旋桨、网箱、码头水下结构、海上石油平台水下结构、潜艇水雷、浮标、海底电缆和沿海电厂冷却管。

毋需详述，相信本领域技术人员会利用上述说明将本发明利用至最大限度。下面以说明的方式，而非限制的方式提供实例。虽然在本发明中提供了具体实例，但是所有描述均为说明性质而非限制性的。上述具体描述的任何一种或多种特征均能与本发明中的任何其他实施方案中的一种或多种特征以任意方式组合。此外，通过浏览说明书，本领域的技术人员会逐渐明了本发明的多种变化。

本申请中引用的所有出版物和专利文件的相关部分均以引用的方式并入本发明，如同分别引用了每个单独的出版物或专利文件。通过引用多篇参考文献，申请人不承认任何特定的参考文献为本发明的“现有技术”。

例子

在以下实例描述中，进一步以说明而非限定的方式阐述了本发明所述的方法、化合物和组成。应当理解的是，成分的比例变化和要素改变对于技术人员是显而易见的，均在本发明的范围之内。提供了理论说明，但应理解的是，申请人不旨在被所提供的理论束缚。除非特别说明，否则所有的份或量均以重量计算。

以下将详细阐述实验材料和方法：

菌株分离及鉴定–菌株UST4-50分离自一种红海海鞘。依据Hiraishi(1992)所提供的方法，扩增了其16SrDNA基因，并对16SPCR产物进行了纯化。利用BigDyeTerminator试剂盒(AppliedBiosystems公司,USA)，根据制造商的说明，对PCR产物进行了鉴定。系统发生分析结果显示，菌株UST-450的16SrDNA序列与反硝化假弧菌(P.denitrificans)菌株NBRC100825有99％的相似度，故将其鉴定为反硝化假弧菌(P.denitrificans)。同时，菌株T450的16srDNA序列已提交至GenBank(NCBI)，获得序列号为KM196102，正式命名为反硝化假弧菌(P.denitrificans)菌株UST4-50。实验中所用PCR引物由华大基因科技(深圳)有限公司合成；细菌DNA提取试剂盒、常规PCR操作所用试剂和酶以及DNAMarker均购自天根生化科技(北京)有限公司。

菌株发酵-对菌株UST4-50进行大规模发酵(50L)，发酵所用培养基为GTY液体培养基(将2g酵母膏、5g胰蛋白胨、10g葡萄糖(均购自Sigma公司)和40g红海海盐溶于1L蒸馏水中，pH7.6)，30℃下置于250rpm摇床培养3.5天。

菌株UST4-50次级代谢产物的分离-3.5天后，室温条件下(～23℃)，将发酵液5000g离心30分钟以去除细胞，上清用等体积乙酸乙酯(EtOAc)萃取3次，合并乙酸乙酯层，真空旋转蒸干，最终共得到约5.5g棕褐色油状发酵液乙酸乙酯粗浸膏。

将该粗浸膏通过反相柱梯度洗脱共得到5个组分。将这5个组分进行抗纹藤壶和苔藓虫幼虫附着活性测试，选取活性较好的组分通过HPLC进一步分离纯化，最终得到8种化合物。具体而言，粗浸膏(5.5g)首先通过反相C18柱进行初步分离，以MeOH-H₂O混合液为洗脱相进行梯度洗脱，洗脱后得到5个组分(Fr.1至Fr.5)。对Fr.1-Fr.5进行抗污损活性筛选，发现Fr.1(MeOH–H₂O1:9洗脱获得)和Fr.5(MeOH–H₂O9:1洗脱获得)无活性，HPLC和UPLC-MS谱图显示这两个组分中的主要化合物为糖类，蛋白和脂肪酸等，属于GPY培养基成分；Fr.2–Fr.4在10μgmL-1时可以完全抑制纹藤壶(B.ampitrite)幼虫的附着，并表现出中等强度的抑制苔藓虫(B.neritina)幼虫附着的活性。同时，Fr.2–Fr.4中的化合物的紫外吸收和UPLC-MS数据分析结果与初筛时得到的该菌株的粗浸膏的相关数据基本吻合。Fr.2–Fr.5的具体分离过程如下：Fr.2(0.46g)进一步通过反相C18柱分离，以MeOH-H₂O(3:7-5:5)洗脱得到化合物6(1.5mg)；Fr.3(0.61g)依次经过SephadexLH-20柱，CHCl₃-MeOH1:1洗脱，得到组分Fr.3.1(0.11g)和Fr.3.2(0.05g),这两个组分分别进行半制备HPLC(LunaC18,5μm,10×250mm,2mL/分钟)(高效液相色谱仪购自美国Waters公司)，MeOH-H₂O4:6为流动相，得到化合物3(2.5mg)和5(1.9mg)；Fr.4(1.7g)通过PE-EA梯度洗脱(50％-90％)硅胶柱得到Fr.4.1–Fr.4.3，其中，Fr.4.1(1.0g)进行半制备HPLC(MeOH-H₂O67:33)得到化合物8(200mg)，Fr.4.2(0.5g)通过反相C18柱，以MeOH-H₂O(65:35-90:10)梯度洗脱得到化合物1(35mg)，2(2.7mg)和4(1.1mg)，Fr.4.3(0.26g)进一步进行半制备HPLC(MeOH-H₂O85:15)得到化合物7(2.4mg)。

菌株UST4-50次级代谢产物的结构鉴定–对上述化合物1-8进行¹H-NMR谱和UPLC-MS谱鉴定。¹H-NMR谱图在室温下通过JEOLDRX500HZNMR(瑞士Bruker公司)测定，所选溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆)(Duksan公司)，以TMS为内参。UPLC-MS谱图通过UPLC(WatersACQUITY公司,USA)-MicroTOF-MSsystem(BrukerDaltonicsGmbH，布莱梅，德国)测定。

双吲哚生物碱类化合物3,3'-二吲哚基甲烷(DIM)的抗污损活性测试-纹藤壶(B.amphitrite)成体采自香港西贡码头(22°38′N,114°27′E)的桥梁柱桩上，将新鲜取得的成体带回实验室后，放入盛有新鲜过滤(0.22μm)海水(FSW)的玻璃缸内，在黑暗环境中催出幼体，并利用幼虫趋光性进行幼体的搜集，得到无节幼虫。无节幼虫的培养方法如Harder等(2001)的描述，在28℃恒温箱(德国ThermoScientific公司)中，以纤细角毛藻(Chaetocerosgracilis)Schutt(一种硅藻)为饵料(1×10⁶cellsmL^-1)，使用加压泵向养殖容器中的海水中辅以适量的空气，每24小时换一次水，取样观察幼虫发育状态，大约3.5-3.8天后大部分幼虫进入金星幼虫状态。将金星幼虫搜集过滤并保存在盛有FSW的玻璃培养皿中，随后幼虫被放置在4℃冰箱中过夜待用。

苔藓虫(B.neritina)采自香港榕树澳(22°24′N,114°21′E)的渔排和浮筏上，将采到的苔藓虫成体放置在水槽中，确保水槽中的海水流动性并通入适量空气，一般成体可在室温(～23℃)流动的海水中成活七天左右，在此期间取苔藓虫成体释放幼虫进行活性测试。参照Maki等.(1989)中所述的方法，取适量苔藓虫成体放入盛有FSW的玻璃缸中，将其置于光照条件下催促其释放幼体，20-30分钟后开始有幼体释放，收集游动活跃的幼虫，将收集到的幼虫尽快用于活性测试。

评价本发明所述化合物对纹藤壶(B.amphitrite)和苔藓虫(B.neritina)的抑制效果的实验在24孔聚苯乙烯板中(Nunc,Naperville,IL公司,CA,USA)进行。待测乙酸乙酯粗浸膏溶于DMSO，涡旋振荡确保完全溶解，配制成50mgmL^-1的母液，将涡旋振荡后的母液简单离心，至EP管壁无液滴存在且没有不溶物沉淀为宜。依据活性菌株筛选实验需求，将母液逐倍稀释至不同浓度使用。具体而言：用FSW将母液稀释1000倍至50μgmL^-1，进一步系列稀释2倍，得到浓度为25至0.39μgmL^-1的7种浓度的待测溶液。在24孔板(Nunc，USA)的每个孔中放置1mL的待测溶液，然后向每个盛有待测液的孔中加入15-20只幼虫。每种待测溶液设三个重复。同时，用1mLDMSO–FSW(v/v1:1000)作为阴性对照组；用1mL含有1.90μgmL^-1(EC₅₀值用于纹藤壶(B.amphitrite))Sea-Nine211^TM的待测液和1mL含有2.50μgmL^-1(EC₅₀值用于苔藓虫(B.neritina))Sea-Nine211^TM的待测液作为阳性对照组(Li等.,2013)。将24孔板置于28℃生化恒温培养箱中于黑暗条件下培养。48小时后，取出24孔板，将其放置在体视显微镜(日本Olympus公司)下观察，并详细记录游动、附着和死亡幼虫的数目。每个检验设置三个重复，并且用三批不同的幼虫重复三次。

幼虫附着率(％)＝(附着幼虫个数/总幼虫个数)×100％

幼虫死亡率(％)＝(死亡幼体个数/总幼虫个数)×100％

EC₅₀和LC₅₀值的计算-在实验结果中，污损生物的幼虫附着率和死亡率依照上述公式计算，用百分比来表示。EC₅₀(半数抑制浓度)和LC₅₀(半数致死浓度)值通常用来评估防污剂的抗污损活性及其毒性，其中，EC₅₀值是指与阴性对照组相比，50％的幼虫被抑制附着的浓度；LC₅₀值则为与阴性对照组相比，50％幼虫死亡时的防污剂浓度值。对于已得实验数据，应用Probit软件进行处理并作图，得到浓度–附着率(或死亡率)曲线，根据该曲线计算出每种化合物的EC₅₀和LC₅₀值。采用单因素方差分析(ANOVA)对数据进行分析，确定显著性差异(p<0.05)。

化合物4-羟苯基-3,3'-二吲哚基甲烷(DIM-Ph-4-OH)的乙酰化-将DIM-Ph-4-OH(3mg)溶于1mL吡啶试剂，然后在N₂气氛下向该溶液中加入醋酸酐(0.5mL)，将混合液于室温(～23℃)条件下N₂保护震荡24小时。24小时后加入0.3mL双蒸水停止该反应，用二氯甲烷(DCM)萃取混合液得到DCM相。然后用饱和NaCl溶液清洗DCM相，随后用无水Na₂SO₄干燥，并真空离心蒸发浓缩器(SpeedVac)(美国ThermoFisher公司)真空蒸干浓缩得到红色反应产物。将红色反应产物经过半制备HPLC分离纯化(半制备柱PhenomenexC18column(250×10mm,7μm)购自Phenomenex公司)，最终得到目标产物8a(2.8mg，红色粉末，83％收率)。所有反应均在室温下进行(23℃)。

复苏实验-为了测试抗污损化合物对靶向生物的毒性，对DIM和DIM-Ph-4-OH进行了纹藤壶幼虫复苏效果测试。将DIM(25.39μM，抑制大约100％附着)和DIM-Ph-4-OH(73.93μM，抑制大约100％附着)的待测液加入盛有15–20只纹藤壶幼虫的24孔板中，把这些24孔板于室温(～23℃)避光条件下放置24小时。24小时后，取出各个浓度下的幼虫，并用FSW清洗幼虫三遍，然后将清洗后的幼虫重新置于盛有1mLFSW的24孔板中，将这些24孔板在室温(～23℃)黑暗条件下放置48小时。48小时后，使用显微镜(日本Olympus公司)观察幼虫活动状态，并记录游动、附着和死亡幼虫的数目。在本实验中，阴性对照组为FSW和含有0.1％DMSO的FSW，每个浓度设置3个实验重复。

海区野外挂板实验-对DIM进行了野外挂板抗污损活性测试，测试在3个质量浓度(w/w5％,10％和15％)条件下进行。防污漆的制作在文献“Skattebol等(2006)”和“Xu等(2010)”所报道的防污漆制备工艺的基础上稍微进行了改进，PVC板涂层的具体制备过程如下：

1)聚氯乙烯(PVC)板的准备：PVC板由香港科技大学实验工程部人员打磨切割成规格为19cm×14cm×3mm的长方形板，并在四角边缘处打孔(直径为1cm)便于悬挂。将切割好的PVC板用砂纸打磨其表面，使其表面粗糙，然后用清水冲洗干净，将其风干后，使用二甲苯试剂冲刷PVC板表面，放置于通风橱中至二甲苯挥干。

2)油漆的制备：防污漆(抗污损涂料)配方由基料(1.0g松香和2.5g丙烯酸树脂，均购自国药集团化学试剂有限公司)、颜料(1.5g二氧化钛，购自国药集团化学试剂有限公司)、助剂(2.0g膨润土，购自国药集团化学试剂有限公司)、防污剂(0.4/0.8/1.2gDIM或Sea-Nine211^TM)和溶剂(10mL二甲苯)五部分构成。将固体材料依次加入不锈钢圆柱形容器中，然后将向容器中加入溶剂二甲苯，调整落地式高速分散机(东莞市大岭山金亿成机械厂)主轴升降，使其搅拌轴叶轮置于溶剂水平面以下，开始搅拌分散(转速为1000r/分钟)，使固体材料分散溶于二甲苯中，分散1小时左右，得到颗粒较粗的初级防污漆。随后，将粗颗粒的防污漆倒入锥形磨(北京杰瑞恒达科技有限公司)凹磨内进行研磨，研磨后的防污漆被刮集到接漆板上并沿此板流出来，此时在盘上放一玻璃杯盛放流出来的防污漆，研磨过程中，凹磨与凸磨之间的间隙保持在0.05–0.07mm，转速设置为180r/分钟，将防污漆反复研磨五次可得到粒径小于25μm的防污漆材料。在实验过程中，设置以下3个组：(1)阴性对照组：为不添加任何防污剂的油漆，被称为底漆；(2)阳性对照组：含Sea-Nine211^TM(w/w5％、10％和15％)的防污漆；(3)实验组：含DIM(w/w5％、10％和15％)的防污漆。

3)刷漆涂板：在已准备好的PVC板上均匀涂刷底漆和防污漆(以下统称为“油漆”)。每层油漆涂完后，将PVC板涂层置于通风橱中使其完全风干，再涂刷另一层油漆。漆膜厚度分别为20μm(30-40mL)底漆，120μm×2(400-500mL)防污漆。将涂有油漆的PVC板置于室温下充分晾干，为进行野外挂板实验待用。

将涂有油漆的PVC板用腈纶绳子捆绑在香港西贡码头(22°38′N,114°27′E)桥墩上，使其浸泡在浅海中。定期观察挂板上海洋污损生物附着品种附着量及繁殖程度，拍照记录污损情况，同时注意比较实验组、阴性对照组和阳性对照组，根据观察的结果评定防污漆的防污性能。在本实验中，海区野外挂板始于海洋生物生长旺盛的4月份，持续5个月。涂布不同油漆的实验挂板各制备3块，同一测试系列的挂板固定在同一框架上同一浸海深度，每个浓度设置3个实验重复。

PVC板污损面积的计算-将拍摄的记录PVC板污损情况的照片(每周拍摄，持续5个月)使用生物统计软件ImageJ进行处理。ImageJ是由美国国立卫生院(NationalInstitutesofHealth,NIH)开发的，基于java的公共图像处理软件。由于附着在板上的污损生物具有不同的灰度，在计算污损面积时，首先按照文献“Zhu等(2010)”描述的方法，设定一个阈值将图片中符合阈值条件的图像(污损生物)标记为灰色，然后软件会计算出灰色部分面积，最终计算出该部分面积占PVC板总面积的百分比，也就是污损生物面积占PVC板总面积的百分比。

数据处理-数据釆用SPSS21.0统计软件进行分析。在抗污损活性测试和幼虫毒理学实验中，EC50和LC50用Probit软件计算，实验组和对照组之间的显著性差异(SignificanceDifference，SD)通过单因素ANOVA判定，并进行Tukey检验。p-value小于0.05代表实验数据间有显著差异，小于0.01则表明实验数据间有极显著差异。

例1—菌株反硝化假弧菌(P.denitrificans)UST4-50次级代谢产物的化学结构和抗污损活性

在本研究中，已得到的乙酸乙酯粗浸膏采用反相柱进行初步分离，得到中等极性组分。依据紫外吸收谱图及Ehrlich试剂显色反应，初步判断该段组分中的化合物为吲哚类(Velurietal.,2003)。采用抗污损活性追踪的方法对中等极性组分进行了进一步分离纯化，最终得到8个已知的双吲哚生物碱类化合物。将化合物1-8的NMR谱图与相关文献报道(Bellatal.1994；Velurietal.2003；Royetal.2014)的相关化合物(标准DIM)谱图对比，最终将化合物1–8分别确定为二(1H-吲哚-3-基)甲烷(DIM)(1)；vibrindoleA(2)；3,3'-二-1H-吲哚-3-基-1,2-丙二醇(3)；三(1H-吲哚-3-基)甲烷(4)；1,2,2-三(1H-吲哚-3-基)乙酮(5)；arsindolineA(6)；3,3'-(苯基亚甲基)双-1H-吲哚(7)；4-(二(1H-吲哚-3-基)甲基)苯酚(DIM-Ph-4-OH)(8)(图1)。

化合物1–8以二(1H-吲哚-3-基)甲烷为母核。通过文献调研发现，双吲哚生物碱类的代表化合物二(1H-吲哚-3-基)甲烷(DIM)是十字花科蔬菜中的二吲哚-3-甲醇(diindole-3-carbinol，I3C)的酸性缩合产物，该化合物及其同系物被Bell等(1994)首次从海洋生物硬鳞鱼粒突箱鲀(Ostracioncubicus)中分离出来。后来研究者又从海洋细菌副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)Bio249(Velurietal.,2003)和气单胞菌(Aeromonassp.)CB101(Caietal.,2010)的发酵液中分离得到了DIM的一系列同系物。本研究首次从假弧菌(Pseudovibrio)属细菌中分离得到双吲哚甲烷类化合物。

双吲哚生物碱类具有多种生物活性，抗肿瘤活性尤为突出，目前该类化合物作为一种高效的抗癌药物的作用机制被人们广泛研究(ClarkandLee，2014)。该类化合物可以介导肿瘤细胞周期中的Akt-NFkB信号传导、细胞凋亡蛋白酶(caspase)的激活、细胞周期蛋白依赖性激酶的激活、内质网应激，也可以通过调节雌激素代谢来发挥抗肿瘤活性(Banerjeeetal.2011；Wengetal.2008)。化合物DIM在乳腺癌的治疗中发挥着重要作用，主要通过激活芳基-烃受体(AhR)，从而抑制乳腺癌细胞的转移和促进乳腺癌细胞分化(Halletal.2010)。此外，双吲哚生物碱类化合物还表现出抗菌、抗炎、抗氧化和抗利什曼虫等活性(Kimetal.2014；Royetal.2014)。

本发明中首次报道了双吲哚生物碱类化合物1–8的抗污损活性(表1)。对化合物1-8进行了抗纹藤壶(B.amphitrite)幼虫附着活性测试发现，除了碳链含有两个醇羟基的化合物3外，所有化合物均表现出低毒、高效的抗污损活性(表1)。高的LC₅₀/EC₅₀比表明这些化合物表现出好的抗纹藤壶幼虫附着活性，同时无致死效果。因此，认为DIM及其类似物为无毒的抗污剂。其中，化合物1(EC₅₀＝3.27μM,LC₅₀/EC₅₀>53)和7(EC₅₀＝3.57μM,LC₅₀/EC₅₀>42)的抗纹藤壶幼虫附着活性与商品防污剂Sea-Nine211^TM(EC₅₀＝3.35μM,LC₅₀/EC₅₀＝15.86)相当，但是其毒性远远低于阳性对照试剂Sea-Nine211^TM；化合物8(EC₅₀＝1.86μM,LC₅₀/EC₅₀>70)的抗污损活性是Sea-Nine211^TM活性的两倍，同时无毒。除抗纹藤壶幼虫附着活性测试外，我们还对化合物1和8进行了抗苔藓虫幼虫附着活性筛选，结果如表2所示，这两个化合物显示出了较强的抑制苔藓虫幼虫附着的作用，EC₅₀值分别为2.54和1.25μM，LC₅₀/EC₅₀均大于50，其活性是阳性对照药物Sea-Nine211^TM(EC₅₀＝8.51μM,LC₅₀/EC₅₀＝8.33)的4-7倍，毒性却远远低于Sea-Nine211^TM。

高效、低毒的防污剂绝不是在抗污损过程中通过其强烈的致死毒性来发挥防污活性，而是在移除防污剂后，原来暴露在防污剂下的幼虫可以重新复苏并仍然能够正常生长发育至附着变态。为了进一步研究本发明的双吲哚生物碱类物质的抗污损作用，对DIM和DIM-Ph-4-OH进行了纹藤壶幼虫复苏效果测试，以检测暴露在DIM及其类似物之后的游动幼虫是否能够在新鲜海水中正常附着和变态。如图2所示，经过DIM(25.39μM)(50μgmL^-1)和DIM-Ph-4-OH(73.93μM)(100μgmL^-1)处理24小时的藤壶幼虫，将其转移至FSW中，48小时后，分别有93％和95％的幼虫可以复苏，并且能够正常生长发育至附着变态，其幼虫附着率和阴性对照组相当，这一实验结果充分说明了双吲哚生物碱化合物并不是通过简单的对幼虫致死毒性发挥其防污作用，该类化合物具有独特的低毒、可逆的抗污损作用机制，在完全抑制幼虫附着的浓度下对靶向生物无毒。

表1.化合物1-8a和吲哚的抗纹藤壶(Balanusamphitrite)幼虫附着活性

数据＝平均值±SD(n＝3),*p<0.05；**p<0.01(单因素ANOVA)

例2—构效关系讨论

本研究中菌株UST4-50来源的所有双吲哚生物碱类次级代谢产物均显现出低毒、高效的抗纹藤壶幼虫附着活性。因此，我们推测双吲哚亚甲基(二(1H-吲哚-3-基)亚甲基)可能是维持该类化合物低毒高效抗污损作用的基本结构。根据吲哚生物碱类防污化合物的报道(Kawamataetal,2006)，芦竹碱类抗污损化合物最明显的分子结构特征为均具有单吲哚环。因此，在本研究中对吲哚的抗纹藤壶幼虫附着的活性进行了测试，结果发现吲哚的抗纹藤壶和苔藓虫幼虫附着的EC₅₀值分别为17.50μM和127.6μM，其抗污损活性远远低于吲哚二聚物DIM(EC₅₀值分别为3.27和2.54μM)。同时，吲哚的毒性却是该化合物的10倍左右(参见表1和表2)。更为重要的是，吲哚三聚物三(1H-吲哚-3-基)甲烷(4)的抗纹藤壶幼虫附着活性(EC₅₀＝5.81μM)并没有随着吲哚环的低聚而增强，化合物4的抗污损活性仍低于吲哚二聚物，这种低聚物的抗污损活性并没有随着单体聚合的增多而增强的现象在Faimali等(2003)的相关防污剂研究中也曾报道。综上所述，通过对吲哚、吲哚二聚物和三聚物的抗污损活性比较发现，吲哚二聚物DIM的抗污损作用最为突出。这进一步证实了双吲哚亚甲基对于维持双吲哚生物碱类化合物的低毒、高效抗污损活性的重要贡献，同时也说明了双吲哚生物碱抗污损作用机制可能与吲哚不同。

比较化合物1-8的抗污损活性发现，DIM-Ph-4-OH具有最强的抗纹藤壶幼虫附着活性(EC₅₀＝1.86μM)，同时也表现出了优秀的抗苔藓虫幼虫附着活性(EC₅₀＝1.25μM)。与其他化合物相比较，化合物8最明显的结构特征为具有Ph-C1″′酚羟基，那么苯环对位酚羟基是否能够大幅度增强双吲哚生物碱类化合物的抗污损活性呢？为了解答这个问题，我们对化合物8的酚羟基进行了乙酰化修饰，得到化合物8a(4-[二(1H-吲哚-3-基)甲基-乙酸苯酯，DIM-Ph-4-OAc)，并对其进行了抗污损活性测试。结果显示该化合物8a的抗纹藤壶和苔藓虫幼虫附着的EC₅₀值分别为4.34和4.50μM，其活性远远低于化合物8。同时，DIM-C1仅连有苯环结构的化合物7的抗纹藤壶幼虫附着活性(EC₅₀＝3.57μM)也低于DIM-Ph-4-OH。因此我们可以推测，酚羟基是增强该类化合物抗污损活性的重要官能团。

由表1可知，化合物3(3,3'-二-1H-吲哚-3-基-1,2-丙二醇)的抗纹藤壶污损活性(EC₅₀＝18.57μM)最低。该化合物的分子结构与其他已分离得到的生物碱类化合物相比，最明显的差别在于，与DIM-C1相连的烷烃链的C2和C3分别连有醇羟基，这两个醇羟基使化合物3亲脂性降低，极性变大。通常来说，亲脂性较高的化合物可以通过被动扩散通过有类脂层屏障的生物膜到达细胞内而发挥作用。与其他7种双吲哚生物碱化合物相比，化合物3的低亲脂性使其不易通过被动扩散进入细胞内部而发挥污损作用，从而导致在低浓度条件下，其抗污损作用远远低于其他7种化合物。Xu等(2010)报道，对于呋喃酮类化合物而言，其抗污损作用会随着与其α位相连碳链上的羟基数目的增多而降低，并由此合成出了亲脂性极高的高效低毒抗污损活性化合物丁烯羟酸内酯(butenolide)。本文所提出的低亲脂性导致化合物3的抗污损作用降低与Xu等(2010)报道的低亲脂性降低呋喃酮类化合物的抗污损活性的现象一致。

通过上述构效关系初步分析可以推断，双吲哚亚甲基可能为该类化合物发挥低毒、高效抗污损活性的基本结构单位，亲水性基团的增加可能会降低双吲哚生物碱的抗污损活性，酚羟基作为活性增强基团有效地改善了该类化合物的防污效果。同时，DIM-Ph-4-OH不仅是双吲哚生物碱化合物中抗纹藤壶幼虫附着作用最强的化合物，而且毒性极低，较高的LC₅₀/EC₅₀值、幼虫复苏率、以及小鼠大脑皮层神经元细胞的存活率充分证明了该化合物对靶向生物幼虫附着的抑制作用并非通过化合物本身对幼体的剧烈毒性而实现，而是通过一种特殊的作用机制实现。因此，与其他双吲哚生物碱类似物相比，化合物8在实际应用中对生态环境造成的伤害相对较小，甚至无害。但是，在充分考虑到目前化合物8的合成成本的情况下，进一步的海区挂板实验选择了可以低价购买到大量纯品、并且抗污损活性较好且毒性较低的DIM，以进行双吲哚生物碱化合物实际应用前景的评估。在后续研究中，如果解决了DIM-Ph-4-OH的样品供应问题，我们也期待进行该化合物的海区抗污损效应实验。在构效关系的探讨中，由于从菌株UST4-50的发酵液EA粗浸膏中分离得到的化合物量和数目均有限，只能对双吲哚生物碱化合物的抗污损活性构效关系进行初步探讨，对于得到的一些猜测性的结果还需要在以后的研究中进一步证实。

表2.化合物1，8，8a和吲哚(indole)的抗苔藓虫Bugulaneritina幼虫附着的活性。

数据＝平均数±SD(n＝3),*p<0.05；**p<0.01(单因素ANOVA)

例3—广谱高效的海区抗污损效应

海区野外挂板抗污损测试是抗污损化合物由实验室迈向实际应用领域的关键一步。在本申请中，图3直观地展示了涂有油漆的PVC板浸入海水5个月后的污损情况，将这些照片使用生物统计软件ImageJ进行处理后，得到生物污损面积占整个涂漆面积的百分比(图4)。由图4可知，5个月后，阴性对照组(即仅涂有底漆的PVC板)的表面污损生物覆盖率可达100％；比较阳性对照组(Sea-Nine211^TM)和实验组(DIM)生物污损面积发现，DIM在野外挂板实验中的抗污损活性可以与商业防污杀虫剂Sea-Nine211^TM相当。DIM在浓度为5％(w/w)时，生物污损面积占总面积的50％左右，而在浓度为10％(w/w)和15％(w/w)时，仅有少数污损生物附着，污损面积仅有5％-18％。这充分显示了DIM在野外挂板实验中具有良好的抗污损活性。此外，依据PVC板目前的污损情况分析，在未来几个月中，化合物DIM在10％(w/w)和15％(w/w)浓度条件下可能仍会持续发挥其抗污损作用，该化合物在上述两个浓度条件下的野外抗污损活性的保持时间应远远长于5个月。DIM优秀的海区抗污损效应充分说明了该化合物可有效地用于在天然环境中防止多种海洋生物的附着，并且是能够被掺入涂料中的防污剂的优异候选物。Burgess等(2003)和Cahill等(2013)报道，防污剂的渗出速率和保留量直接决定了防污漆的抗污损效果，而渗出速率是由防污漆配方中高分子共聚物的含量决定的，这也就意味着在今后的双吲哚类生物碱化合物的防污漆实际应用中，可以通过控制树脂等基料的含量来调节渗出速率，由此提高DIM的抗污损性能，从而在保证防污漆防污效果良好的前提下延长防污漆的使用寿命。

讨论

本发明提供了一系列以3,3'-二吲哚亚甲基为基本骨架，并且具有强抗污损活性的双吲哚生物碱类化合物。此外，化合物DIM和DIM-Ph-4-OH在完全抑制纹藤壶幼虫附着的浓度下对小鼠大脑皮层神经元细胞无毒，从而说明这些化合物通过低毒甚至无毒的抗污损作用机制发挥其抗污损活性，而不是通过其强烈的细胞毒活性抑制幼虫附着。海区野外挂板实验显示，该类化合物具有广谱的抗生物污损作用，在一定质量浓度下(5％,10％,15％(w/w))，其有机涂料的防污寿命可达3个月甚至更长。总而言之，本发明所述的DIM等双吲哚生物碱类化合物具有相对简单的化学结构、良好的抗污损作用、以及对目标污损生物的低毒性等优点，这使其成为被混入到抗污损涂料中的理想的高效环保型防污剂。

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