具有改善的血管生成特性的外周血干细胞及其用途

摘要

本申请公开了通过EPO或APS引发用于制备具有改善的血管新生特性的外周血干细胞的方法及其用途。根据本申请的方法制备的细胞诱导血管新生，并因此可有效地用于需要促进血管新生的各种疾病的再生或恢复，例如肌肉、脑、心脏、肾脏或大肠中发生的缺血性疾病，例如由于缺血引起的组织损伤、脑梗塞、中风、再灌注损伤、心肌梗塞、充血性心脏衰竭、外周血管梗阻、心肌肥大、低心脏收缩、低心脏扩张、适应不良性心脏肥大、收缩期心脏衰竭、舒张期心脏衰竭、高血压性心脏衰竭、动脉或二尖瓣疾病、心脏血管合并肺动脉瓣疾病或缺血性心脏血管。

说明书

技术领域

本申请涉及其能力可通过被用于需要血管形成的疾病的细胞因子 动员的外周血干细胞的体外引发过程增强的细胞以及使用相同细胞的细胞治 疗产品的领域。

背景技术

细胞治疗法主要使用都能组织再生的成体干细胞或祖细胞，并且 所述方法的示例包括试图通过使用骨髓源干细胞再生血管和肌肉。然而，未 充分了解适用于用作成体干细胞成分的细胞和组织的再生的干细胞的选择方 法，并且因此在这种方法的实际使用中出现了困难。

尽管对细胞治疗进行不断的研究，但是一直存在干细胞数目绝对 不足、干细胞存活率低等等问题。因此，需要不断的努力以使临床应用有效 并使细胞治疗效率最大化。

研究实际上是在使用用于干细胞的药物(它可以防止细胞死亡) 中的进展以尽可能减少干细胞丢失、诱导干细胞分化成更适合于组织再生的 其他类型的细胞等等。

缺血是指特定组织的血液供应不足的状态，导致氧气和营养物质 的供应和有害代谢物的去除不足，最终导致组织损伤。临床代表性的疾病的 示例包括缺血性心血管病。对于这样的心血管疾病的治疗的示例包括冠状动 脉血管成形术，然而，尽管支架技术不断发展，但是仍不足以恢复已经受损 的组织。

因此，引人注目的治疗是使用心脏肌肉再生干细胞。

韩国未审查专利申请公开No.2007-0054140涉及脐带血产生的多 能干细胞以及用于治疗缺血性坏死疾病的包含该干细胞的细胞治疗产品，并 且它提供了用于治疗由动脉粥样硬化动脉疾病引起的缺血性坏死病的细胞治 疗产品。

细胞治疗产品的不断发展是缺血性相关疾病的根治性治疗所必需 的。

发明内容

技术问题

本申请旨在提供用于需要血管形成的疾病的细胞治疗产品。

技术解决方案

在一个方面，本申请涉及制备具有改善的血管形成特性的经动员 的外周血干细胞(mobPBSC)的方法，其中所述方法包括提供利用细胞因子 处理的人外周血；从上述血中分离出成层的单核细胞；以及利用促红细胞生 成素(EPO)或活化的血小板上清液(APS)处理上述单核细胞。

本申请的外周血干细胞是自体的、同种异体的或异种的细胞，并 且其特别是自体细胞。

在另一个方面，本申请还提供了具有改善的血管形成特性并由本 申请的方法制备的mobPBSC。

在另一个方面，本申请还涉及具有改善的血管形成特性并由EPO 或APS活化的mobPBSC。

在本申请中，利用EPO处理的细胞与未经处理的细胞相比较而言 增加整合素β-1和β-2的以及CD14/CD16的双表达，并且增加通过EPO受体 迁移的IL8、IL10和FGF基因和蛋白质的表达。此外，利用APS处理的细胞 与未处理的细胞相比较而言增加IL9、IL17、PDGF和VEGF的基因表达，增 加EPO受体、CD34、CD31、Tie2、CXCR4、整合素α-5、整合素β-1和整合 素β-2的表达以及增加CD14/CD16的双重表达。

本申请还提供了用于治疗缺血性疾病并包含本申请的mobPBSC 的组合物。所述组合物可有效用于治疗缺血性心脏疾病。缺血性心脏疾病的 示例包括心肌梗塞、心绞痛、充血性心脏衰竭、外周血管阻塞、心脏肥大、 低心脏收缩、低心脏扩张、适应不良性心脏肥大、收缩期心脏衰竭、舒张期 心脏衰竭和高血压性心脏衰竭。

本申请的细胞具有改善的血管形成特性，并且它涉及旨在用于促 进血管形成并包含mobPBSC的组合物。

在另一个方面，本申请还涉及治疗缺血性疾病的方法，其包括向 需要缺血性疾病治疗的受试者施用根据本申请制备的细胞或包含所述细胞的 组合物。

可使用本申请的治疗的缺血性疾病如上文所述。

有益效果

本申请的APS-或EPO-引发的mobPBSC诱导血管生成；因此， 它们可用于需要促进血管形成的各种疾病(例如，发生在肌肉、脑、心脏、 肾脏或大肠的缺血性疾病)，其示例包括由缺血造成的组织损伤、脑梗塞、 中风、再灌注损伤、心肌梗死、充血性心脏衰竭、外周血管梗阻、心脏肥 大、低心脏收缩、低心脏扩张、适应不良性心脏肥大、收缩期心脏衰竭、舒 张期心脏衰竭、高血压性心脏衰竭、动脉和二尖瓣疾病、心脏血管合并肺动 脉瓣疾病或者缺血性心脏血管再生或恢复。

附图说明

图1示出了分离mobPBSC的过程的模拟图–其基于密度差从人血 中通过细胞因子(G-CSF)动员，然后在EPO培养液中引发干细胞。

图2示出了通过FACS法利用EPO引发的细胞因子诱导的 mobPBSC的识别特征。

图3示出了在mobPBSC的细胞群体(由G-CSF动员并在EPO培 养液中引发)中鉴别血管新生相关基因和蛋白质的表达增加。还鉴别的是， 作为通过EPO受体迁移的结果，随下游JAK、AKT信号转导分子被活化而 发生这样的表达增加。

图4示出了当处理mobPBSC的细胞群的细胞培养物上清液(由 G-CSF动员并在EPO培养液中引发)时改善人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 的管形成和迁移能力，并且这样的改善通过EPO受体迁移而发生。

图5示出了mobPBSC的细胞群(由G-CSF动员并在EPO培养液 中引发)显示出与HUVEC和ECM(纤连蛋白)的粘附性更强并且这样的现 象归因于整合素增加。

图6示出了当制备免疫系统受抑制的无胸腺裸小鼠的后肢缺血模 型并且然后将mobPBSC(由细胞因子动员并由EPO引发)注入小鼠时观察 到优良的血管形成特性。还鉴别的是，当21天后使用CD34(分化簇34(绿 色)：对人类细胞具有特异性的抗体)进行后肢组织的免疫荧光染色时， CD34是血管内皮细胞引物，将由G-CSF动员并在EPO培养液中引发的 mobPBSC引入到血管生成物中。

图7示出了在诱导小鼠心脏缺血后，当将mobPBSC(由细胞因子 动员并由EPO引发的)注入免疫系统受抑制的无胸腺裸小鼠内时，促进心脏 恢复。

图8示出了利用APS引发mobPBSC的方法的示意图，相对于未 活化的血小板上清液(幼稚血小板上清液)和APS而言，分离出mobPBSC 之后Giemsa染色的结果和利用ELISA(酶联免疫吸附测定)对细胞因子进行 分析的结果。

图9是mobPBSC被刺激(利用Veh/APS)6小时后RT-PCR对 IL-8、IL-10、IL-13、IL-17、bFGF、TNF-、CXCR4和EPOR(促红细胞生成 素受体)的基因表达的分析结果。

图10示出了通过FACS法由Veh/APS引发的mobPBSC的识别特 征。

图11示出了Veh/APS引发的mobPBSC中纤连蛋白粘附素的观察 结果。

图12示出了识别趋化性和细胞迁移的实验过程的示意图，以及所 观察的Veh/APS引发的mobPBSC趋向SDF-1的趋化性结果。

图13示出了上清液中有关IL-8、IL-10、TNF-、IL-17、PDGF和 VEGF表达的ELISA的分析结果，其中培养Veh/APS引发的mobPBSC，以 及利用上述上清液处理的HUVEC的基质胶管道形成和迁移的分析结果。

图14示出了将Veh/APS引发的mobPBSC注入免疫系统受抑制的 无胸腺裸小鼠的缺血性后肢模型内之后灌注程度的组织学分析和测定结果， 以及被注入APS引发的mobPBSC的细胞的血管生成。

图15示出了其中将APS引发的mobPBSC注入免疫系统受抑制的 无胸腺裸鼠的缺血性后肢模型中的组比对照组更促进血管生成。

图16是将基质胶注入免疫系统受抑制的裸鼠内以比较周围血管形 成特性的结果，并且表明与对照组相比较而言，注入mobPBSC(由G-CSF 动员并由APS引发的)之后所观察的优良的血管形成特性。

图17示出了APS的安全稳定性。

在上述所有图中，*：P<0.05；**：P<0.01以及***：P<0.001。

具体实施方式

在一个方面，本申请涉及制备具有改善的血管形成特性的 mobPBSC的方法，其中所述方法包括提供利用细胞因子处理的人外周血；从 上述血液分离出成层的单核细胞；以及利用EPO或APS处理上述单核细 胞。

在本申请中，“血管形成”包括“血管生成”和“血管新生”两 者。血管生成的特征在于内皮祖细胞原位分化为成熟内皮细胞并且这些细胞 聚集形成新的血管，在早期胚胎中的主血管丛形成过程中发生。血管生成是 由预先存在的血管生长以及血管通过分支生长造成的。在另一个方面，它可 以衍生自预先存在的血管或由干细胞、成血管细胞或其他祖细胞生成。测量 血管形成的方法是本领域中众所周知的；例如，可以通过测量未分支的血管 段的数量(每单位面积段的段数)、功能性血管的密度(每单位面积的灌注 血管的总长度)、血管直径、或血管的总体密度(基于每单位面积的各段的 直径和长度来计算的血管的总体积)来测定。

在本申请中，细胞因子动员的PBSC(动员的外周血干细胞， mobPBSC)是指当利用造血剂处理之后抽外周血时血液中的骨髓源成体干细 胞。它们可以通过本申请的示例中所述的方法得到。例如，当将造血剂例如 G-CSF(粒细胞集落刺激因子)注入到人受试者内时，骨髓中的干细胞在血 液循环系统被动员，使得大量的骨髓源成体干细胞可在全身循环。在这种情 况下，当从机体的周围区域抽血时可得到相比于在通常情况下更富含骨髓源 成体干细胞的血液，并且这些细胞被命名为“细胞因子动员的PBSC”。

在本申请中，EPO(促红细胞生成素)通过促进红血细胞形成而 提高血红蛋白水平并用作用于治疗贫血的药物，并且例如通过比如LG生命 科学有限公司商购获得。其用途的示例包括治疗患有慢性肾功能不全、症状 性贫血等的患者中所观察到的贫血。还已知对神经细胞和心肌细胞具有保护 作用。

在本申请中，APS(活化的血小板上清液)被用作本申请的引发 材料，并且可以例如通过本申请的示例中所述的方法从含有经活化的血小板 的血液(例如富血小板血浆)中获得。

在另一个方面，本申请还涉及具有改善的血管形成特性的 mobPBSC。

根据本申请制备的EPO-或APS-活化细胞具有如下特性并且可以 由本领域技术人员通过参考本申请的示例中的说明等容易地获得。具体而 言，利用EPO处理的细胞与未经处理的细胞相比较而言增加整合素β-1和-2 以及CD14/CD16的双重表达，并且增加通过EPO受体迁移的IL8、IL10和 FGF基因以及蛋白质的表达。利用APS处理的细胞与未经处理的细胞相比较 而言增加IL9、IL17、PDGF和VEGF的基因表达，增加EPO受体、CD34、 CD31、Tie2、CXCR4、整合素α-5、整合素β-1和整合素β-2的表达，并且 增加CD14/CD16的双重表达。

在另一个方面，本申请提供了血管形成促进剂，或用于治疗需要 血管形成特性的疾病的组合物，其包含了根据本申请的方法制备的细胞。

在本申请的一个实施方式中，缺血症状对应于需要血管形成特性 的疾病，并且“缺血症状”是指其中向组织供应血液的状态由于出血、栓 塞、梗塞等被中断而造成细胞损伤，并且它包括由于血液循环不足引起的氧 不足造成的各种症状。在本申请中，“缺血疾病”是指由于缺血造成的器官 或组织的损伤或者由这样的损伤造成的疾病，并且它可以发生在任何各种器 官，例如脑、心脏、肾脏和大肠以及肌肉组织。例如，脑缺血可能发展成疾 病，例如中风和再灌注损伤；在肠的情况下，当流到大肠的血液减少时可能 发生缺血性结肠炎；并且心脏缺血可能发展成心肌梗塞或充血性心脏衰竭。

在本申请的一个实施方式中，缺血性疾病是缺血性心脏疾病并且 包括由缺血造成的心血管组织损伤。缺血性心脏疾病是由于因冠状动脉的动 脉粥样硬化等造成的流动到心脏肌肉的血液减少造成的心脏疾病，并且在临 床意义上说，其可以例如但不限于肌梗塞、心绞痛、充血性心脏衰竭、外周 血管阻塞、心脏肥大、低心脏收缩、低心脏扩张、适应不良性心脏肥大、收 缩期心脏衰竭、舒张期心脏衰竭、高血压性心脏衰竭、动脉和二尖瓣疾病、 肺瓣膜疾病等等。包含APS引发的mobPBSC的本申请的组合物可用于促进 心脏组织的血管形成或改善心脏功能。

在本申请的另一个实施方式中，缺血性疾病是缺血性脑疾病并且 包括例如中风、再灌注损伤和肢体缺血等疾病，尽管它并不限于此。本申请 的包含APS引发的mobPBSC的组合物可以用于促进脑组织中的血管形成或 改善脑功能。

在本申请中，“细胞治疗产品”是指通过旨在恢复细胞和组织的 功能的一系列处理(例如体外增殖或选择活的自体、同种异体或异种的细 胞，或者在其他方法中改善生物学特性)用于治疗、诊断和预防目的药物。 美国(自1993年)和韩国(自2002年)已经营医学物质范畴内的细胞治疗 产品。这样的细胞治疗产品是用于组织再生或器官功能恢复的“干细胞治疗 产品”并且可被分类为“免疫细胞疗法产品”，用于控制免疫反应，换句话 说，用于抑制或刺激体内免疫反应。

在本申请中，“治疗(疗法)”是包括抑制、除去、减轻、缓 解、改善和/或预防疾病或症状或由疾病引起的病症的构思。

在本申请中，“治疗有效量”是指减轻或治疗患者的症状、病症 或疾病所需的量。包含在本申请的组合物中的APS引发的mobPBSC的有效 量可根据患者的施用途径或年龄、体重、潜在疾病、正常的健康状态等等而 变化，并且最终将由医师的判断来确定。

本申请的治疗组合物中所用的细胞是自体、同种异体或异种的细 胞，并且它们特别是自体细胞。

本申请的细胞治疗产品可以通过本申请的方法来制备。

本申请的EPO-或APS活化的mobPBSC可以通过流式细胞仪进行 分析。流式细胞仪可以识别本申请的细胞的特异性标志物。

任何常用的途径均可用作含有本申请的细胞治疗产品或细胞的药 物组合物的施用途径，只要药物可以到达目标组织即可。也可以使用肠胃外 施用，例如腹腔内施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用和皮内施用，但 其并不限于此。

本申请的治疗产品或组合物可以配制成与常用的一种或更多种药 学上可接受的载体一起使用的合适形式。“药学上可接受的”组合物是指生 理学上可接受的并且当施用于人时通常不引起过敏反应例如胃肠道病症和头 晕或其他类似的反应的组合物。药学上可接受的载体的示例包括水、合适的 油、盐水和用于肠胃外施用的载体，例如葡萄糖和乙二醇的水溶液，并且该 载体可以另外包括稳定剂和防腐剂。合适的稳定剂的示例包括抗氧剂，例如 亚硫酸氢钠、亚硫酸钠和抗坏血酸。合适的防腐剂的示例包括苯扎氯铵、对 羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。此外，如果需要的话，根据 本发明的用于细胞疗法的组合物可合适地包含混悬剂、增溶剂、稳定剂、等 渗剂、防腐剂、防吸附剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节剂、安慰 剂、缓冲剂、抗氧剂等等，具体取决于施用方法或制剂。适用于本发明的药 学上可接受的载体和制剂，包括上述的那些，详细地描述在文献[Remington’s PharmaceuticalSciences，最新版]中。

根据可由本发明所属技术领域中普通技术人员容易实施的方法， 使用药学上可接受的载体和/或赋形剂可将根据本发明的用于细胞疗法的组合 物制备成单位剂量形式或配制在多剂量容器内。在这种情况下，制剂可以是 油、水性介质中的溶液、混悬液或乳液的形式，或者可以是粉末剂、颗粒 剂、片剂或胶囊剂的形式。

此外，上述组合物可以通过使细胞治疗产品可以移动到目标细胞 的任何装置来施用。根据本发明的用于细胞疗法的组合物可以包含用于疾病 治疗的治疗有效量的一种或更多种细胞治疗产品。术语“治疗有效量”是指 研究人员、兽医、医生或其他临床专业人员感兴趣的诱导组织系统、动物或 人的生物学或医学反应的活性成分或药物化合物的量，并且它包括诱导减轻 待治疗的疾病或病症的症状的量。对于本领域技术人员而言显而易见的是， 待包含在本发明的组合物中的细胞治疗产品可根据所期望的效果而变化。因 此，最佳的细胞治疗产品的内容物可以由本领域技术人员容易地确定并且根 据多种因素控制，多种因素包括疾病类型、疾病的严重程度、组合物中含有 的其他一种更多种组分的量、制剂类型；患者的年龄、体重、健康的正常状 态、性别和饮食；施用时间、施用途径、组合物的释放速率、治疗的持续时 间和同时施用的一种更多种药物。考虑到所有上述因素，使用可能达到最大 效果而没有副作用的最小量是重要的。例如，本发明的组合物的剂量基于引 发的mobPBSC可以为1.0×10⁷-1.0×10⁸个细胞/kg(体重)，优选1.0×10⁵- 1.0×10⁸个细胞/kg(体重)。然而，规定的剂量可根据例如配制方法、施用 方式、患者的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、施用时间、施用途径、 排泄速率和反应灵敏度等因素而变化；剂量可以由本领域技术人员考虑上述 因素来适当地控制。施用频率可以是在临床上可接受的副作用范围内的一次 或两次或更多次，并且施用部位可以是一个、两个或更多个位点。对于不是 人类的动物而言，可以施用与人的每kg所用剂量一样的剂量，或通过例如基 于目标动物和人的缺血器官(例如心脏)的体积比(例如平均值)的转换而 确定的剂量。作为根据本发明治疗的目标动物而言，感兴趣的人和哺乳动物 可例如：具体而言，其可以是人、猴、小鼠、大鼠、兔、羊、牛、狗、马、 猪等等。

此外，本申请的组合物可以单独使用或与使用用于治疗与缺血相 关的疾病的手术、激素治疗、药物治疗或生物反应调节剂的方法组合使用。

在另一个方面，本申请还涉及治疗缺血性疾病的方法，其中所述 方法包括向需要治疗缺血性疾病的受试者施用根据本申请制备的细胞和包含 所述细胞的组合物。可使用本申请的治疗方法的受试者包括需要治疗或预防 缺血性疾病的哺乳动物，尤其是人类，并且施用治疗有效量，其中所述剂 量、细胞治疗产品和组合物如上所述。

可使用本申请的治疗方法的缺血性疾病如上所述。

下文中，参照以下示例更详细地描述本发明，但是本发明的范围 并不限于此。

下文中，将参照以下示例将更详细地描述本发明。然而，提供以 下示例仅为了促进对本发明的理解，并且本发明并不限于以下示例。

示例1.利用EPO引发G-CSF动员的PBSC之后细胞特性的对比

图1示意性地示出了利用EPO引发由G-CSF动员的mobPBSC的 方法。由首尔大学校医院的医学研究伦理委员会批准后招募四名健康志愿者 并让他们签署同意书。按照赫尔辛基宣言接收所述同意书后已采集外周血。 具体地，将G-CSF(Dong-APharmaceutical，韩国)以10μg/kg注射给上述志 愿者，每日一次，共3天，并且然后用50ml注射器采集100ml外周血并用肝 素处理。将外周血分成10ml的等份试样，其中将每份放入每个50ml管中， 然后加入30ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)并小心地充分混合，然后加入10ml Ficoll，并且然后在2500rpm和25℃的条件下离心30分钟。在黄色血清层， 顶部的白色单核细胞层和透明的Ficoll层，底部的红血细胞和多形核白细胞 的红色层中，仅分离出白色单核细胞层并转移至新管中。将PBS加入到转移 的单核细胞层中，在1800rpm和4℃下进行离心10分钟，仅留下细胞沉淀， 并且然后进行清洗过程以获得一组高纯度的mobPBSC。将如此得到的 mobPBSC放入通过将5％FBS加入到内皮细胞基础培养基-2(EBM-2)中制 备的培养液中，并且将包含终浓度为10μM的EPO(LG生命科学公司，韩 国)的EBM-2培养基用作引发材料。以3×10⁷个细胞/ml的高密度或更高的 密度引发6小时，同时搅拌。在其中供给5％的CO₂的培养箱中保持37℃的 引发条件。

图2示出了通过FACS法利用EPO引发6小时的G-CSF动员的 PBSC的特性的对比结果。利用抗体例如CD14、CD16、CD66、整合素α- 4、整合素α-5、整合素β-1、整合素β-2、膜联蛋白V和PI在30分钟和4℃ 的条件下将对照组和EPO引发的、G-CSF动员的PBSC染色，并且然后使用 FACS装置(BDFACSCanto)观察表达。从结果确定，当利用EPO进行引 发时，CD14-和CD16-阳性的所述组中的细胞与对照组相比较而言增加了约 10％，并且也增加了整合素β-1的表达量。此外，确定的是，对膜联蛋白V 和PI是阳性的所述细胞群并且仅对膜联蛋白V是阳性的细胞群减少，表明细 胞坏死和细胞死亡分别减少。

示例2.血管新生相关基因和分泌蛋白表达的鉴别(体外试验)

图3A示出了在细胞因子动员的mobPBSC的EPO引发之后在分 离出蛋白质之后于0分钟、5分钟、15分钟、30分钟和60分钟通过Western 印迹识别AKT和JAK信号转导分子的磷酸化形式的结果。当利用EPO刺激 时，AKT和JAK在5分钟内活化，而当EPO受体被阻断时其被抑制。这表 明，利用EPO的血管新生反应是由于通过EPO受体迁移的AKT和JAT信号 转导分子的活化造成的。

在图3B的左侧平面曲线图中，在细胞因子动员的PBSC的EPO 引发(6小时，37℃，5％CO₂的条件下)之后分离出总RNA后进行逆转录 聚合酶链反应(RT-PCR)。这种情况下所用的每个引物如下面的表1，并且 PCR条件如下：95℃下15秒，95℃下15秒，60℃下1分钟。结果表明， EPO引发的mobPBSC的组与对照组相比较而言促进血管新生的IL-8、IL- 10、bFGF和MMP9、整合素α-V和整合素-8的基因表达更高。

[表1]

在图3B的右侧平面曲线图中，通过ELISA对比分析EPO引发的 mobPBSC中已知促进血管新生的细胞因子的表达。结果表明与对照组相比较 而言，利用EPO引发的mobPBSC的已知是与血管形成相关的因素的IL-8、 IL10、TNF-α的分泌量更高。此外，确定的是，当处理EPO阻断抗体、JAK 抑制剂和AKT抑制剂时EPO导致的反应降低。按照生产商说明使用Bio- PlexProt^TM阵列系统(Bio-Rad的试剂盒和设备，美国)进行ELISA。

示例3.血管新生效果的鉴别(体外试验)

图4示出了通过使用由示例1的EPO引发制剂引发的细胞因子诱 导的mobPBSC上清液鉴别基质胶中血管新生特性和HUVEC迁移的差异的结 果。还确定的是，这是由于通过EPO受体迁移的下游JAK和AKT信号转导 分子活化造成的。在图4A中，将35mm的共聚焦培养皿(ibidi，德国)的底 部置于冰上并涂有200μlGFRMatrigel(BDBiosciences)，并且然后在37℃ 孵育约30分钟。然后，通过将EPO引发的细胞因子诱导的mobPBSC的上清 液作为培养液，将HUVEC(2×10⁴)小心地置于35mm的共聚焦培养皿(预 先涂有基质胶)上。12小时后，在显微镜下评估HUVEC的管形成能力，并 且确定利用EPO-引发的HUVEC的管形成能力(支化点的数量和管长度)更 强。还确定的是当利用EPO受体阻断抗体、JAK抑制剂(AG490)和AKT 抑制剂(LY294002)中每一种处理时管形成能力的增强被削弱。

在图4B中，将HUVEC在培养皿上孵育一天，制作厚度均匀的 线形划痕，并且然后加入EPO引发的mobPBSC的培养液以评估HUVEC的 迁移能力。如图4B可见，当使用含有EPO-引发的mobPBSC的培养液时， 与对照组相比较而言HUVEC的迁移更大。此外，确定的是，当利用EPO受 体阻断抗体、JAK抑制剂(AG490)和AKT抑制剂(LY294002)中每一种 处理时管形成能力的增强被削弱。通过体外试验证实了利用EPO-引发改善了 细胞因子动员的mobPBSC的血管内皮细胞的血管新生特性。

在图5中，利用5-(和-6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯 (CFSE；Sigma-Aldrich，美国)在37℃下将对照组和EPO引发的细胞因子 动员的PBSC染色1小时，并且然后评估2×10⁵个细胞在HUVEC和ECM (纤连蛋白)中任一种上粘附1小时的能力。通过结果确定的是，EPO引发 的细胞因子动员的mobPBSC与对照组相比较而言对HUVEC和纤连蛋白中任 一种的粘附能力更强，并且当使用整合素阻断抗体时粘附能力的增强被削 弱。利用这些结果，确定的是，利用EPO引发增强了细胞因子动员的 mobPBSC对细胞外基质和血管内皮细胞的粘附能力。此外，通过这样的粘附 能力增强推断可增加细胞向实际的活性位点的植入。

示例4.血管新生作用的测定(体内试验)

图6示出了与未引发的对照组相比较而言，利用EPO引发的细胞 因子动员的PBSC在临床前阶段的血管新生的增强更多。具体地，在每只免 疫系统受抑制的无胸腺裸小鼠(BAL/c-nu，6-8周龄，16-20g，东方生物 (OrientalBio)，韩国)的后肢中诱导缺血条件，并且注射PBS、未引发的 对照组(3×10⁵个细胞)和EPO引发的细胞因子动员的PBSC(3×10⁵个细 胞)。在缺血诱导后立即和缺血诱导后第3、7、14、21天通过LDPI(激光 多普勒灌注成像)测量灌注。结果表明，如图6A所示，与其中注射PBS (n＝7)或载体引发的mobPBSC(n＝7)的组相比较而言，EPO引发的 mobPBSC(n＝7)中的灌注更大。此外，对α-平滑肌肌动蛋白(SMA-α，红 色)染色以观察成熟血管的结果表明当注射EPO引发的mobPBSC时形成了 更多的血管，如图6B可见。量化后，由结果确定的是，与其中注射PBS或 载体引发的mobPBSC的组相比较而言，在注射EPO引发的mobPBSC之后 管的数量、管面积和管长度显著增加。

在图6C中，从作为血管内皮细胞标记物的CD34(分化簇34， 绿色)的免疫荧光染色的结果可见，其中SMA-α(红色)和抗体对人细胞具 有特异性，确定的是，其中注入EPO引发的mobPBSC的细胞实际上能进行 血管新生。

在图7中，在免疫系统受抑制的每只无胸腺裸小鼠(BAL/c-nu， 6-8周龄，16-20g，东方生物公司)的心脏中诱导缺血性病症，并且执行PBS (n＝6)、本发明的对照组(3×10³)(n＝6)和EPO引发的细胞因子动员的 mobPBSC(3×10³)(n＝6)中的至少一种的注射。14天后，取出心脏，进行 MT(Masson三色)染色和H&E(苏木精和曙红)，并且然后测量缺血的大 小、左心脏壁厚度和纤维化面积的比例。从结果确定的是，其中注射EPO引 发的细胞因子动员的mobPBSC的缺血心脏恢复最多。

示例5.mobPBSC和APS的制备以及APS分析

由首尔大学校医院的医学研究伦理委员会批准后招募四名健康志 愿者并让他们签署同意书。按照赫尔辛基宣言接收所述同意书后已采集外周 血。

如示例1所述获得mobPBSC。获得后立即将获得的细胞利用 APS引发6小时，如下所述，并且该过程示意性地示于图8A中。所有分离 过程均在无菌环境中进行，并且通过吉姆萨染色评估分离的mobPBSC的纯 度(参见图8B)。

为了获得APS，首先，在室温下将从每名志愿者获得的100ml外 周血在130×g离心(700rpm)进行离心20分钟以分离出PRP(富含血小板血 浆)。将PRP转移到新的试管中，加入含有肝素(400U/ml)的PBS，并在 室温下在900×g(2000rpm)进行离心7分钟。之后除去上清液，并且然后利 用含有400U/ml肝素的PBS重复上述过程两次以上。将0.5U/ml的凝血酶 (Sigma-Aldrich，美国)加入到10ml如上所述获得的血小板的最终量中，并 且将血小板在培养箱(37℃，5％CO₂)中活化2小时。完成活化之后，在室 温下在10000×g离心10分钟除去血小板，并且仅收集上清液并用于在培养箱 (37℃，5％CO₂)中引发6小时。图8A中示意性地示出实验过程。

图8C示出了用于分析用于分泌细胞因子的幼稚血小板上清液和 APS的ELISA结果。结果表明与对照组相比较而言IL-8、IL17、PDGF和 VEGF的表达更高。利用Bio-PlexProt^TM阵列系统(Bio-Rad的试剂盒和设 备，美国)进行ELISA。

示例6.血管新生相关基因和引物的表达和功能的研究(体外试验)

图9示出了利用APS孵育(37℃，5％CO₂培养箱)mobPBSC6 小时然后分离出RNA以进行RT-PCR的结果。使用TRIzol(Invitrogen，美 国)试剂通过生产商清楚描述的方法获得总RNA。使用Primescript1^st链 cDNA合成试剂盒(TAKARA，日本)根据生产商提供的方法合成cDNA。 使用Maxime^TMPCR(内含子，韩国)与反应混合物以及20μl的总量进行扩 增过程。所用的引物如表2所示，并且PCR条件如下：95℃下15秒，95℃ 下15秒，60℃下1分钟。结果表明与载体引发的mobPBSC相比较而言，在 APS引发的mobPBSC中促进血管形成的IL-8、IL-10、IL-13、IL-17、 bFGF、TNF-α、CXCR4和EPO受体(EPOR)基因的表达更高。

[表2]

图10是利用使用荧光的FACS(荧光激活细胞分析)分析APS 引发的mobPBSC和对照组的细胞表面上各抗体的结果。与BDFACS一起使 用FACS、FITC标记的抗EPO受体(R&D，美国)、膜联蛋白V(Becton Dickinson)、整合素α-5(eBioscience，美国)和整合素β-2(Becton Dickinson)抗体；APC标记的抗CD16(eBioscience)、CD31(Becton Dickinson)、CD34(BectonDickinson)和CXCR4(eBioscience)抗体； PEcy7标记的抗CD14(eBioscience)抗体；PE缀合的抗Tie2(R&D)、PI (BectonDickinson，美国)、整合素α-4(R&D)和整合素β-1(Becton Dickinson)抗体，并且IgG用作对照组。与载体引发的mobPBSC相比较而 言，APS引发的mobPBSC表现出促进血管生成的EPOR阳性细胞的增加更 多。此外，CD34阳性细胞(其为造血干细胞的标记物)和CD31-、Tie2-和 CXCR4-阳性细胞(所有这些都是血管形成的标记物)也增多。此外，作为血 管形成的单核细胞的CD14(++)/CD16(+)细胞增多。与此相反，作为细胞凋亡 的标志物的膜联蛋白(+)/PI(+)细胞减少。确定的是，与在载体引发的 mobPBSC中相比较而言，在APS引发的mobPBSC中表达作为血管新生中重 要的整合素的整合素α5、β1和β2的细胞的数量的增加更明显。

示例7.血管新生作用的鉴别(体外试验)

在图11中，在检查引发的mobPBSC在HUVEC和ECM(细胞外 基质)中任一种上的粘附能力之前一天将HUVEC以单层接种在纤连蛋白包 被的24孔板中。在培养箱(37℃，5％CO₂)中使用CFSE(5-(和-6)-羧基二 乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯，Sigma-Aldrich，美国)对mobPBSC染色1小时。 将使用CFSE染色的mobPBSC(2×10⁵)放入所制备的24孔中的每一个中， 并且然后放在培养箱(37℃，5％CO₂)中来观察。这些结果通过以下方式获 得：使用PBS清洗漂浮的mobPBSC，然后在10个不同点在40×倍的显微镜 下仅对mobPBSC(其仍然粘附)中的荧光拍照，并量化朝SDF-1a迁移的引 发的mobPBSC。根据该结果，与在载体引发的mobPBSC中相比较而言，在 APS引发的mobPBSC中，对HUVEC和纤连蛋白的粘附的增加更明显。

图12A示意性地示出了趋化性和细胞迁移观察的测试过程。具体 地，通过使用一个或更多个24孔板和一个或更多个transwell过滤器(5μm孔 径，Corning，USA)进行趋化性分析。Transwell过滤器被涂有50μg的 100μg/ml的纤连蛋白。如在趋化性分析中一样，使用CFSE对mobPBSC染 色。对于测试，将含有100ng/ml的重组人SDF-1α(Prospec，以色列)的 EBM2培养基放在板的下孔中，并将transwell过滤器放置在其上。接着，将 使用CFSE染色的mobPBSC(3×10⁵)放在Transwell过滤器顶部上来观察培 养箱(37℃，5％CO₂)中引发的mobPBSC朝向SDF-1a的趋化性。这些结果 通过在10个不同点在40×倍的显微镜下通过对Transwell过滤器下的荧光拍 照，并量化朝SDF-1a迁移的引发的mobPBSC获得。根据该结果，与载体引 发的mobPBSC相比较而言，在APS引发的mobPBSC中，趋化性的增加更 明显(图12B)。

在图13中，将引发的mobPBSC孵育在含有5％FBS(GIBCO) 的EBM2(Lonza，瑞士)培养基中，并且然后将其中孵育载体/APS引发的 mobPBSC的上清液储存在-20℃，直到在下一个试验中使用。通过使用Bio- PlexProt^TM阵列系统试剂盒和设备(Bio-Rad，美国)进行ELISA(酶联免疫 吸附试验)以分析趋化因子和细胞因子，例如由引发的mobPBSC分泌的 TNF-α、IL6、IL8、IL10、IL17、IFNg、PDGF-BBVEGF和碱性FGF。根据 该结果，与在载体引发的mobPBSC中相比较而言，在APS引发的mobPBSC 中，IL-8、IL-10、TNF-α、IL-17、PDGF和VEGF的分泌的增加更明显，并 且观察到IFN-γ、碱性FGF无显著变化[图13A]。迁移和HUVEC的基质胶管 形成的分析是通过使用载体引发的mobPBSC和APS引发的mobPBSC的上 清液进行的。根据该结果，与利用载体引发的mobPBSC相比较而言，在利 用APS-引发的mobPBSC的上清液处理的HUVEC中，迁移[图13B]和管形成 [图13C]的增加更明显。

示例8.血管新生作用的鉴别(体内试验)

在本示例中，证明了APS引发的mobPBSC与上述载体引发的 mobPBSC相比较而言更有效地促进临床前状态中的血管新生。

具体地，为了检查利用APS引发的mobPBSC的体内效果，利用 免疫系统受抑制的无胸腺裸小鼠(BAL/c-nu，6-8周龄，16-20g，东方生 物，韩国)的后肢制备缺血后肢模型，并进行基质胶塞实验。实验组和对照 组中，(1)注射了PBS的对照组、(2)注射了载体引发的mobPBSC的实 验组和(3)注射了APS引发的mobPBSC的实验组，其中每组包含7只小 鼠。对于缺血后肢模型而言，通过腹膜内注射50μl以1:4的比例混合的氯胺 酮和赛拉嗪麻醉小鼠。随后，将股动脉系上以制备模型，并且之后立即将 PBS和细胞(3×10⁵/50μl)注入收肌(2个位点)内。在试验日期0、3、7、 14和21天进行LDPI(MoorInstruments)，并在第21天将小鼠安乐死，并 且然后分离出后肢以比较组织恢复的程度。根据该结果，如图14可见，利用 APS引发的mobPBSC(n＝7)与其中注射PBS(n＝7)或载体引发的 mobPBSC(n＝7)的组相比较而言灌注改善更多[图14A]。此外，利用H&E 对每个实验组染色用于缺血组织的组织学研究[图14B]。另外，为了观察新形 成的和成熟的血管，利用抗α-平滑肌肌动蛋白(SMA-α，Sigma-Aldrich，美 国)对肌肉组织染色。接着，通过抗人CD34(LeicaBiosystems，德国)和 DAPI的免疫荧光染色检查小鼠组织用于人源细胞。通过共聚焦或荧光显微镜 分析结果。作为通过使用用于作为血管内皮细胞引物的CD34(分化簇34， 绿色)和SMA-α(红色)的对人细胞具有特异性的抗体进行免疫荧光染色的 结果，确定的是，其中注射APS引发的mobPBSC的细胞实际上表现出血管 新生(图14C)。

此外，作为利用SMA-α(红色)进行染色以观察血管的结果，确 定的是，当注射APS引发的mobPBSC时形成更多的血管，如图15可见。量 化后，从结果确定的是，当注射APS引发的mobPBSC时，与注射PBS或载 体引发的mobPBSC的组相比较而言，血管的数量、血管面积和血管长度显 著增加。

图16涉及基质胶塞实验，其中加入了VEGF-A(1μg/ml)、b- FGF(1μg/ml)和载体/APS引发的mobPBSC(5×10⁵个细胞)的350μl冷基 质胶(BDbioscience)皮下注射给小鼠。将不含细胞的基质胶注射给对照 组。从试验日期的第21天将小鼠安乐死，并且然后分离出基质胶。为了比较 血管形成，进行H&E和免疫荧光染色。观察到圆形形状的血管新生，圆形 形状包含直链结构和红血细胞。经首尔大学校临床医学中心的机构动物管理 和使用委员会批准并在实验动物管理和使用的国际研究员的指导下进行所有 的动物试验。根据该结果，与注射了PBS或载体引发的mobPBSC的组相比 较而言，当注射APS引发的mobPBSC时肉眼观察到具有更多的血管(图 16A)。此外，根据H&E染色和SMA-α(红色)染色的结果，当注射APS 引发的mobPBSC时实际上观察到更多的血管；量化后，从结果确定的是， 与注射了PBS或载体引发的mobPBSC的组相比较而言，当注射APS引发的 mobPBSC时，血管的数量、面积和长度显著增加(图16B)。

附图中的照片是通过奥林巴斯IX2(OlympusIX2)倒置荧光显微镜 (奥林巴斯)、奥林巴斯DP50CFCCD照相机和分析5.0软件获得的，并且 共聚焦照相结果是通过ZeissLSM-710META共聚焦显微镜(奥林巴斯)和 ZEN2009分析软件获得的。

示例9.APS的稳定性试验(血栓形成试验)

在本示例中，通过血栓形成试验评估APS稳定性。血小板对受损 组织的恢复具有显著的影响，而且促进血栓形成。组织损伤之前增加的血液 凝块的风险是使用APS用于例如缺血性心血管疾病之类的疾病的原因，其发 病机制是“血栓形成”。

图17A和B示出了APS引发的mobPBSC的血栓形成试验以确定 APS的稳定性的结果。在本试验过程中，将mobPBSC加入到血液中，并且 然后测量血小板的活化程度。图17A示意性地示出了通过作为存在于血小板 膜中的两种糖蛋白的CD41(整合素α-IIb链)和CD61(整合素β-3链)两者 识别血小板的活化过程。

为了应用将APS引发的mobPBSC注射到患者的冠状动脉内的临 床病症，将载体/APS引发的mobPBSC以1×10⁷个细胞/ml的浓度与血液混 合，并且然后在单个柠檬酸钠试管(BD-Plymouth，UK)中制备对照组(不 含阿司匹林)和一个或更多个实验组(含20μg/ml阿司匹林)。通过充分混 合30分钟使血小板活化后，在130×g离心20分钟以分离出PRP。使用FITC 荧光标记的CD41和CD61抗体对如此得到的PRP进行染色，并且使用FITC 荧光标记的lgG抗体设定为对照组。它被保护免受强烈的撞击，以防止血小 板在分离和染色过程中自我调节活化。

图17B示出了FACS分析的结果。CD61和CD41a两者表现出当 血小板活化时导致FACS增加。结果，其中混合APS-和载体引发的 mobPBSC的全血中的所有血小板表现出活性增强。然而，通过用在心血管患 者中的抗血小板制剂阿司匹林观察到血小板反应降低。

从这些结果发现全血的血小板活性由于APS引发而部分增强，其 由于同时使用抗血小板制剂而又降低。换句话说，该图表明使用抗血小板制 剂可降低在APS引发中血液凝固的风险，从而解决了稳定性问题。

所有的统计分析是通过Prism5.0程序(GraphPadSoftware，美 国)和SPSS版本18(SPSSInc.，美国)进行的。结果表示为平均值±标准偏 差的平均值。通过进行事后比较例如邦费罗尼分析和非配对t检验并分析间 隙使实验组相互对比。<0.05的p值被理解为显示出统计学意义。

本发明的上述描述是为了说明的目的，并且本发明所属技术领域 普通技术人员应理解的是，可在不改变本发明的技术精神或必要特征的情形 下进行其他特定形式的改变。因此，应当理解的是，上面描述的示例旨在是 说明性的并且在所有方面中均为非限制性的。