用离体扩增的脂肪组织源性干细胞进行脂肪植入来实现整容性乳房填充或面部填充和/或年轻化

摘要

本发明涉及一种组合物，其包含离体扩增的脂肪组织源性干细胞(ASC)或与收获的脂肪组织以每毫升脂肪5,0×10

说明书

发明领域

本发明涉及用离体扩增的脂肪组织源性干细胞或离体扩增的脂 肪组织源性干细胞富集型脂肪移植物进行软组织填充。这些可用于整 容性乳房填充/增大或面部填充和/或年轻化。

发明描述

整形外科的一个常见的挑战是校正体积缺陷和增大现有体积。在 校正体积缺陷时或在增大现有组织时，使用填充材料(所谓的填料或 插入物)往往是必需的。自体脂肪移植(脂肪植入)能够修复并且增大软 组织(例如整容性隆胸)并且越来越多地用于美容外科与重建外科中。 自体脂肪组织已被视为用于增大软组织的理想填料，因为它是生物相 容的、通用的、外观自然的、非免疫原性的、便宜的并且可轻易获得 的，而且供体部位罹病率低^1,2。然而，移植的脂肪移植物具有不可预 见的并且往往较低的存活率，这是研究者一直在寻找增加其活力的新 方式的原因。一项研究富集脂肪组织源性间质干细胞(ASC)的异种脂 肪移植的动物研究已表明所述技术是有效的并且可重现的，并且与非 富集型相比使移植物的剩余体积增加³。近来的一项人类研究已表明 并且证实了添加ASC至脂肪移植物中获得增加的剩余体积和更佳质 量的移植组织的优点和惊人的效果⁴。

在整容行业中，可用于整容性面部填充/年轻化的解决方案主要 是人造物(例如A型肉毒毒素、玻尿酸、胶原蛋白、羟磷灰石钙、聚 乳酸、聚甲基-甲基丙烯酸酯微球)。因此，结果往往以因低通用性和 生物相容性而看起来不自然而结束。人造填料随时间推移分解，并且 可能具有从各种疾病症状变化到美貌缺陷的有害物理副作用。如以上 所描述，自体脂肪组织被视为一种理想填料解决方案。然而，患者用 自体脂肪进行面部填充/年轻化(即在没有干细胞富集的情况下)处理 的结局可能因不可预见的移植物存活率而以结果不成比例而结束。

一些外科医师提出可通过添加所谓的基质血管成分(SVF)至移植 物中来实现更好并且更可预测的移植物吸收^5,6。SVF是当通过脂肪去 除收获脂肪组织并且使用胶原蛋白酶酶促消化脂肪细胞时所形成的 细胞沉淀。SVF已知含有少量脂肪组织源性干细胞(ASC)。

区别以下术语是重要的：

1)常规脂肪植入：仅脂肪

2)细胞辅助脂肪移植：脂肪+SVF

3)干细胞富集型脂肪植入：脂肪+离体扩增的ASC

4)干细胞填充：离体扩增的ASC

在本专利申请中，我们仅涉及以上术语3)和4。

对本专利申请中所涉及的干细胞的定义：

当接种和培养基质血管成分时粘附于培养物表面的细胞。

对于乳房与面部应用两者，可使用自体或异基因细胞。

本发明尤其适合用于整容性面部填充和年轻化以及整容性乳房 填充/增大。

发明详述

本发明涉及一种组合物，其包含离体扩增的脂肪组织源性干细胞 (ASC)或与收获脂的肪组织以每毫升脂肪5,0×10⁴-2,0×10⁸、例如 1,0×10⁵-2,0×10⁷个ASC的比率混合的离体扩增的脂肪组织源性干细 胞(ASC)；以及离体扩增的脂肪组织源性干细胞或离体扩增的脂肪组 织源性干细胞富集型脂肪移植物作为用于整容性乳房填充/增大或用 于面部填充/年轻化的药剂的用途。

用于收获ASC的手术程序

患者接受门诊患者微型脂肪去除。

脂肪抽出物将通过标准无菌脂肪去除技术来收获。通过切口将湿 润溶液渗透至皮下脂肪中。使用标准脂肪去除装置(例如) 获得脂肪抽出物并且封闭于无菌容器中。将脂肪抽出物运送至临床干 细胞实验室。

ASC的分离和培养

ASC分离和离体扩增将在经批准用于优良制造实践(GMP)和临 床干细胞扩增的实验室中在细胞治疗设备上根据经批准的方案进行。

将脂肪抽出物用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并且离心。为分离基 质血管成分(SVF)，孵育上清液并且用胶原蛋白酶(GMP级)进行酶促 消化。使用生长培养基来中和酶活性。使用60-100μm过滤器过滤悬 浮液并且离心。将细胞沉淀再悬浮于培养基中并且计算沉淀中含有 SVF的细胞的数目。分离SVF的替代方式是使用封闭系统，例如GID SVF-1^TM系统。将SVF接种于由杜尔贝科氏改良伊格尔培养基 (Dulbecco'smodifiedEagle'smedium，DMEM)和α最低必需培养基 (Alphaminimalessentialmedium，α-MEM)、1-5％青霉素-链霉素、1-5 IU/mL无防腐剂肝素以及2-20％汇集的人类血小板裂解物pHPL或任 何其他替代生长培养基(例如胎牛血清)组成的培养基中。孵育原代培 养物(P0)。弃去非粘附细胞，将细胞培养物烧瓶小心地用PBS冲洗， 并且更换培养基。每3-7天改变培养基。在培养期间和收获ASC的 当天，将检查每个培养烧瓶/堆叠的病原体污染情况。

pHPL制备

可如Schallmoser等人⁷所描述在进行微小修改的情况下制备 pHPL。简言之，在知情同意之后，从健康的供血者收集全血单位。 遵守现行法律，测试所有血液捐赠物的传染性疾病标记物。将血沉棕 黄层与红血细胞和血浆分离。将四个血沉棕黄层单位与1单位血浆一 起汇集至1单位富含血小板的血浆(PRP)中并且储存于-20℃至-80℃ 下。将最少十单位的PRP在水浴中解冻并且然后汇集至单一批次的 PRP中。将汇集后的PRP批料等分成更小部分并且冷冻于-20℃至 -80℃下。接着，将来自单一批次的汇集后PRP的所有等分袋在水浴 中解冻并且离心(例如在4000g下持续15min)以使血小板片段沉积。 最后，将含pHPL上清液转移至新的袋子中并且储存于-40℃至-80℃ 下以便随后在制备细胞培养基时使用。

ASC收获程序

ASC是在P0-P4中收获。将所有细胞培养物烧瓶/堆叠用PBS洗 涤并且使用化学(例如TrypleSelect)或物理加工将细胞从塑料表面分 离。将含有ASC的悬浮液离心(例如在300g下持续5min)，除出上 清液并且在重悬浮于PBS中之后收集细胞沉淀。将ASC细胞沉淀用 PBS洗涤，将ASC离心并且在各洗涤程序之后弃去上清液。将细胞 计数三次并且将计算平均计数。在释放ASC用于临床用途之前将小 心地控制ASC，包括1)不存在病原体污染，2)ASC的活力大于90％， 3)形态经评估为ASC的特性。ASC将在经批准的无菌容器中进行运 输。

脂肪去除、移植物制备以及脂肪植入程序

手术程序是在局部或全身麻醉下进行。通过标准无菌脂肪去除技 术收获脂肪抽出物。使用钝的渗透器通过切口将湿润溶液(例如克莱 因斯溶液(Kleinssolution))渗透至供体部位中。收获套管直径是2-5 mm，并且具有钝的尖端，其连接至收获装置(例如)。若需 要，则使用生理盐水洗涤脂肪抽出物。所收获的脂肪抽出物留待进行 沉积、旋转或离心(例如在100g下持续5min)。在分离程序之后，倾 析油层(上层)并且也将水性层(下层)从注射器中排尽。使用主要由脂 肪移植物组成的中间层来进行移植。

所发明的应用：

整容性乳房填充：将收获的脂肪组织与收获的离体扩增的ASC 以每毫升脂肪5,0×10⁴-2,0×10⁸个ASC的比率、优选以每毫升脂肪 1,0×10⁵-2,0×10⁷个ASC的比率混合，并且以等分试样形式注射至乳 房中来获得整容性增大。

注射技术的实例：

将富集型脂肪移植物使用长针水平地(平行于身体)注射至乳房 中以免损坏乳房组织外部的结构。针是从围绕乳晕边缘的若干个点和 在乳房下皱襞处的若干个点沿可变方向和平面插入，以实现移植物的 看起来均匀并且自然的分布。

对于面部填充和皱纹校正：将收获的脂肪组织与收获的离体扩增 的ASC以每毫升脂肪5,0×10⁴-2,0×10⁸个ASC的比率、优选以每毫 升脂肪1,0×10⁵-2,0×10⁷个ASC的比率混合。干细胞的量将根据所需 填充量的增加而增加，需要的填充越少，ASC的浓度越高。若所要 效果纯粹是组织质量改善的问题，则将单独使用ASC，其溶解于PBS 中以使细胞均匀分布。

注射技术的实例：

当用作填料时，用长针以等分试样形式水平地(平行于表面)注射 脂肪移植物以免损坏目标区域外部的结构。针是从若干个点并且沿可 变方向和平面插入，以实现移植物的看起来均匀并且自然的分布。

当纯粹用于组织质量改善时，所溶解的ASC是用尖锐的细针注 射于真皮中和皮肤下并且均匀分布于目标区域中。将切割和注射部位 缝合并且向供体部位并且在一些情况下也向受体部位施加术后紧身 服。

本发明的临床益处和新颖性

在US61/839,578专利提交之前，ASC(离体扩增)富集型脂肪移 植物或单独的ASC从未在临床上用于注射于乳房或面部，并且从未 在文献中有描述，也没有发明人与其他人分享关于这些临床应用的想 法。使脂肪移植物富含离体扩增的ASC以提高脂肪移植物的存活率 和质量的想法已在鼠模型³和在人类中进行的新近概念验证研究⁴中 得到证实，不过如上文所提到，本发明的临床应用从未被证实(即整 容性乳房填充和面部填充)。应强调的是，本发明(即离体扩增的ASC 用于面部填充/年轻化和整容性乳房填充/增大的目的的应用)显著不 同于使用新近分离的SVF(包括一小部分未扩增的ASC)来进行常规 的所谓“细胞辅助脂肪填充”。此方法已描述于文献中并且应用于人 类，并且具有不可预见的临床结局，这不显著优于常规脂肪植入⁸。 使用离体扩增的ASC进行面部填充的基本原理由上文所提到的研究 支持，其中与脂肪细胞相反在注射之后干细胞存活得到证实。另外， ASC对缺氧和物理暴露极具抵抗力^9-11。通过使用单独的干细胞作为 填充材料，可实现可靠的剩余体积/增大。

存在许多由制备生物相容性可持续乳房和面部填料产生的临床 益处，包括外观自然、非免疫原性、避免人造材料的副作用并且程序 可以是自体性的。大多数患者在腹部、大腿、手臂以及臀部具有可使 用的天然脂肪储库。以此方式，患者得到定制的和所需的身体重塑。 自体脂肪组织可通过简单脂肪去除和后续注射而容易地移植，患者的 不适感非常少并且副作用风险非常小。

实施例

研究结果-概念验证研究(类似于例如KolleSF,Fischer-NielsenA, MathiasenAB等人,Enrichmentofautologousfatgraftswithex-vivo expandedadiposetissue-derivedstemcellsforgraftsurvival:a randomisedplacebo-controlledtrial.Lancet2013；382:1113-20中所描 述的研究设计)：

研究目的：

将富含高剂量自体离体扩增的脂肪组织源性干细胞(ASC)的脂肪 移植物与非富集型脂肪移植物(常规脂肪移植)相比较。

研究设计∶

针对各参与者制备纯化的脂肪移植物，一种存在ASC富集，而 另一种不存在ASC富集(对照)。皮下注射脂肪移植物。

选择每毫升富集型脂肪移植物20x10⁶个ASC的浓度(约2,000倍 于生理水平)。

在注射之后立即以及在121天之后通过磁共振成像(MRI)测量所 注射的脂肪移植物的体积，并且与基线MRI相比较。

结果∶

与对照移植物相比，ASC富集型脂肪移植物具有显著更高的剩 余体积。尚未观测到严重有害事件。

方面：

根据上文，可通过以下方面进一步描述本发明，其中除非指定为 相反的，否则提到干细胞应理解为提到自体与异基因细胞。

1.离体扩增的脂肪组织源性干细胞富集型脂肪移植物，其用于 乳房填充方法中。

2.离体扩增的脂肪组织源性干细胞富集型脂肪移植物或离体扩 增的脂肪组织源性干细胞，其用于面部填充方法中。

3.一种组合物，其包含与收获的脂肪组织以每毫升脂肪5,0×10⁴- 2,0×10⁸个ASC的比率混合的离体扩增的脂肪组织源性干细胞(ASC) 富集型脂肪移植物或离体扩增脂肪组织源性干细胞(ASC)。

4.离体扩增的脂肪组织源性干细胞富集型脂肪移植物用于乳房 填充的用途。

5.离体扩增的脂肪组织源性干细胞富集型脂肪移植物或离体扩 增的脂肪组织源性干细胞用于面部填充的用途。

6.离体扩增的脂肪组织源性干细胞富集型脂肪移植物作为乳房 填充剂的用途。

7.离体扩增的脂肪组织源性干细胞富集型脂肪移植物或离体扩 增的脂肪组织源性干细胞作为面部填充剂的用途。

8.离体扩增的脂肪组织源性干细胞富集型脂肪移植物或离体扩 增的脂肪组织源性干细胞用于整容性乳房填充的用途。

9.离体扩增的脂肪组织源性干细胞富集型脂肪移植物或离体扩 增的脂肪组织源性干细胞用于整容性面部填充的用途。

10.离体扩增的脂肪组织源性干细胞富集型脂肪移植物或离体 扩增的脂肪组织源性干细胞在用于治疗老化迹象的药剂的制备中的 用途。

11.乳房填充的方法，其中脂肪组织源性干细胞(ASC)富集型脂 肪移植物与收获的脂肪组织以每毫升脂肪5,0×10⁴-2,0×10⁸个ASC的 比率混合，并且其中脂肪是用长针以等分试样或以线状物形式水平地 (平行于身体)注射，注射方式是将针从围绕乳晕边缘的若干个点和在 乳房下皱襞处的若干个点沿可变方向和平面插入，以实现移植物的看 起来均匀并且自然的分布。

12.面部填充的方法，其中扩增的脂肪组织源性干细胞(ASC)富 集型脂肪移植物或离体扩增的脂肪组织源性干细胞(ASC)与收获的脂 肪组织以每毫升脂肪5,0×10⁴-2,0×10⁸个ASC的比率混合或溶解于 PBS中，以使细胞均匀分布，并且其中脂肪移植物是用长针以等分试 样或以线状物形式水平地(平行于表面)注射，以免损坏目标区域外部 的结构，并且针是从若干个点并且沿可变方向和平面插入以实现移植 物的看起来均匀并且自然的分布。

13.面部填充的方法，其中扩增的脂肪组织源性干细胞(ASC)富 集型脂肪移植物或离体扩增的脂肪组织源性干细胞(ASC)与收获的脂 肪组织以每毫升脂肪5,0×10⁴-2,0×10⁸个ASC的比率混合或溶解于 PBS中，以使细胞均匀分布，并且其中所溶解的ASC是用尖锐的细 针注射于真皮中并且均匀分布于目标区域中，并且将切割和注射部位 缝合并且向供体部位并且在一些情况下也向受体部位施加术后紧身 服。

14.乳房填充整的容方法，其中脂肪组织源性干细胞(ASC)富集 型脂肪移植物与收获的脂肪组织以每毫升脂肪5,0×10⁴-2,0×10⁸个 ASC的比率混合，并且其中脂肪是用长针以等分试样或以线状物形 式水平地(平行于身体)注射，注射方式是将针从围绕乳晕边缘的若干 个点和在乳房下皱襞处的若干个点沿可变方向和平面插入，以实现移 植物的看起来均匀并且自然的分布。

15.面部填充的整容方法，其中扩增的脂肪组织源性干细胞(ASC) 富集型脂肪移植物或离体扩增的脂肪组织源性干细胞(ASC)与收获的 脂肪组织以每毫升脂肪5,0×10⁴-2,0×10⁸个ASC的比率混合或溶解于 PBS中，以使细胞均匀分布，并且其中脂肪移植物是用长针以等分试 样或以线状物形式水平地(平行于表面)注射，以免损坏目标区域外部 的结构，并且针是从若干个点并且沿可变方向和平面插入，以实现移 植物的看起来均匀并且自然的分布。

16.面部填充的整容方法，其中扩增的脂肪组织源性干细胞(ASC) 富集型脂肪移植物或离体扩增的脂肪组织源性干细胞(ASC)与收获的 脂肪组织以每毫升脂肪5,0×10⁴-2,0×10⁸个ASC的比率混合或溶解于 PBS中，以使细胞均匀分布，并且其中所溶解的ASC是用尖锐的细 针注射于真皮中并且均匀分布于目标区域中，并且将切割和注射部位 缝合并且向供体部位并且在一些情况下也向受体部位施加术后紧身 服。

17.将药剂引入皮肤的整容方法，其中所述药剂包含离体扩增的 脂肪组织源性干细胞富集型脂肪移植物或离体扩增的脂肪组织源性 干细胞。

18.将药剂引入皮肤的整容方法，其中所述药剂包含与收获的脂 肪组织以每毫升脂肪5,0×10⁴-2,0×10⁸个ASC的比率混合的离体扩增 的脂肪组织源性干细胞(ASC)富集的脂肪移植物或离体扩增的脂肪组 织源性干细胞(ASC)。

19.一种对皮肤进行脂肪植入的方法，其使用离体扩增的脂肪组 织源性干细胞富集型脂肪移植物或离体扩增的脂肪组织源性干细胞。

20.一种对皮肤进行脂肪植入的方法，其使用组合物，所述组合 物包含与收获的脂肪组织以每毫升脂肪5,0×10⁴-2,0×10⁸个ASC的比 率混合的离体扩增的脂肪组织源性干细胞(ASC)富集型脂肪移植物或 离体扩增的脂肪组织源性干细胞(ASC)。

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