法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-03-29
授权
授权
2016-03-23
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20151120
实质审查的生效
2016-02-24
公开
公开
技术领域
本发明涉及动物分子生物学领域,具体涉及兔特异性引物、试剂盒及其在兔 源性成分鉴定中的应用。
背景技术
兔肉性凉味甘,在国际市场上享负盛名,被称之为“保健肉”、“荤中之素”、 “美容肉”、“百味肉”等等。兔肉质地细嫩,味道鲜美,营养丰富,与其它肉类相 比较,具有很高的消化率(可达85%),食后极易消化吸收。因此,兔肉极受消 费者的喜爱。
随着人民生活水平的提高,兔肉消费量的增加,市场上开始出现各种兔肉制 品掺假的现象,因此兔肉制品来源的安全性成为消费者关心的焦点,而对肉制品 的来源进行鉴定并建立便捷的检测方法是解决这一问题的关键。科学家针对进化 上较不保守的线粒体DNA,利用NCBI核酸序列数据库,通过比对各种动植物 的线粒体Cytb基因序列,设计不同物种的特异性引物来进行物种种源鉴定。 CristinaG.Santos采用这种方法设计了野兔的线粒体Cytb基因特异性引物并进 行了检测,但由于线粒体DNA的高度变异性,该特异性引物只能对少数野兔种 进行鉴别,是否可用于家兔的鉴定未见研究报道。因此,如何有效、准确地判别 肉制品是否含有兔源性成分,并建立一种简单易行的检测方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术不足,提供一种可用于兔源性制品特异性检 测的引物;
本发明的第二个目的在于提供用于兔源性制品检测的检测试剂盒;
本发明的目的还在于提供兔源性成分的鉴定方法。
为实现上述目的,本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方 面进行兔基因组特异DNA序列的筛选,经过普通牛、水牛、羊(绵羊、山羊)、 猪、马、驴、鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)、豚鼠、鸡、鸭、鹅、兔、狗、狐、水貂 和貉子的基因组DNA及不同的兔品种DNA中的检测,筛选在兔中特意的、在 其他物种中不存在或同源性低的DNA片段作为检测分子。经过大量分析和实验 工作,最终获得可供检测使用的特异DNA序列,其核苷酸序列如序列表SEQID No.1所示。
基于此,本发明首先提供一种兔特异性引物,其能特异性扩增SEQIDNo.1 所示的核苷酸序列或该序列的特异性片段。
优选地,引物长度为18~27bp。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩 增片段长度、反应温度等多方面。
优选地,该引物序列如下:
OCU-F:5′-TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3′
OCU-R:5′-GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3′;
或该引物向5′、3′端延伸或修饰得到的仍能特异性扩增SEQIDNo.1所示序 列的引物。
进一步本发明提供含有上述特异性引物的检测试剂盒。
优选地,所述试剂盒还包括下述试剂中的一种或多种:Taq酶、dNTPs、 MgCl2、PCR缓冲液、阳性对照DNA模板、双蒸水;或者还包括下述试剂中的 一种或多种:TaqDNAMasterMix、阳性对照DNA模板、双蒸水。
所述阳性对照DNA模板为兔科兔属的兔基因组DNA模板;
进一步,本发明提供上述的兔特异性引物或检测试剂盒在兔源性成分鉴定中 的应用。
本发明还提供兔特异性引物、试剂盒及其在兔源性成分鉴定中的PCR检测 方法,其步骤如下所述:
1)提取样品基因组DNA;
2)用上述的引物进行PCR扩增,并以兔DNA模板为阳性对照,以双蒸水 为空白对照;
3)对PCR扩增产物进行检测和结果判定。
优选地,其中步骤2)PCR扩增的反应体系如表1:
表1本发明PCR扩增的反应体系
PCR反应程序如下:
94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸12s,
30次循环;4℃降温2min。
结果判定方法是:当PCR反应产物与阳性对照扩增产物相符,且空白对照 无扩增产物时,判定样品中检测出兔源性成分;当PCR反应产物无扩增产物或 与阳性对照扩增产物不符,且空白对照无扩增产物时,判定样品中未检测出兔源 性成分;如果阳性样品未检测出预期片段,说明试剂失效或操作失误;若空白对 照与阳性样品均检出,说明试剂污染或操作失误。
本发明中检测结果可用琼脂糖凝胶电泳呈现,也可用测序或其他有效方法检 测;提取样品DNA的方法可用苯酚-氯仿提取法,也可使用公认的、具有相同效 力的其他提取方法。
本发明提供了有效的、精准的、可靠的兔源性成分检测方法,所组装的试剂 盒能快速鉴定样品中是否含有兔源性成分。本发明的方法可以在肉品、饲料和毛 皮检测中作为标准检测方法使用。本发明试剂盒及检测方法具有简便、快速、全 面、特异性强的特点,且成本较低,适用性广。
附图说明
图1:是SEQIDNo.1所示的特异序列在兔中具有物种特异性的检测结果。 以兔科兔属的家兔、非兔科哺乳动物(普通牛、水牛、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、 仓鼠、豚鼠、猪、马、驴、狐、狗、水貂、貉子)以及非哺乳动物(鸡、鸭、鹅) 的基因组DNA为模板,扩增SEQIDNo.1所示的特异片段,所有测试样品中仅 在兔中得到扩增产物,非兔物种中均无扩增产物。结果表明所扩增片段在兔中具 有特异性。泳道中编号说明如下:M:为BM2000DNAMarker;1-3:空白对照; 4-6:兔;7-9:小鼠;10-12:大鼠;13-15:仓鼠;16-18:豚鼠;19-21:普通牛; 22-24:水牛;25-27:绵羊;28-30:山羊;31-33:猪;34-36:马;37-39:驴; 40-42:鸡;43-45:鸭;46-48:鹅;49-51:狐;52-54:狗;55-57:水貂;58-60: 貉子。
图2:是SEQIDNo.1所示的特异序列在兔不同DNA模板浓度中的灵敏度 检测结果。分别以0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL的兔DNA为模板, 扩增SEQIDNo.1所示的特异片段,1ng/μL的模板浓度即有扩增,表明特异性引 物所扩增片段具有较好的灵敏性。泳道中编号说明如下:M:为BM2000DNA Marker;1-4:空白对照;5-8:0.1ng/μL的模板浓度;9-12:1ng/μL的模板浓度; 13-16:10ng/μL的模板浓度;17-20:100ng/μL的模板浓度。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明,但不应理解为对本发明的限制,在不背 离本发明精神和实质的前提下,对本发明所做的修改或润色均属于本发明的范围。
实施例1样品中兔源性成分特异性检测
1.试样的制备与保存
1.1取样
采集兔肉制品试样1g,于-20℃下保存备用。
1.2DNA模板制备
DNA模板制备采用常用的苯酚-氯仿粗提法(萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼 尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁,黎孟枫.北京:科学出版 社,1999.465-467)或者公认的、具有相同效力的其他提取方法,这些方法都是报 道的常用方法。
2.引物设计
本实施例的引物序列如表2和序列表SEQIDNO:2和3所示。
表2本发明设计的PCR扩增引物
预期扩增片段大小为209bp,其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。
实验表明,该引物特异性强,在兔各品种中均能特异性扩增,而在其他非 兔物种中都无目的片段扩增;且引物的灵敏度较高,在模板DNA浓度为1ng/μL 时即可扩增。以上述引物分别向3′、5′延伸一个碱基和两个碱基或修饰形成的引 物对进行实验,实验表明仍能进行特异性扩增,从经济型和综合效果来看以表2 中的引物最佳。
3.PCR检测
3.1试样PCR反应
3.1.1PCR反应体系同表1。
3.1.2混匀,加25μL石蜡油(有热盖设备的PCR仪可不加),在离心机上500g~3 000g离心10s,然后取出PCR管,放入PCR仪中。
3.1.3进行PCR反应。程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火 30s,72℃延伸12s,共进行30次循环;4℃降温2min。
3.1.4反应结束后取出PCR管,对PCR反应产物进行电泳检测。
3.2对照PCR反应
3.2.1在试样PCR反应的同时,设置阴性对照、阳性对照和空白对照。各对照PCR 反应体系中,除模板外其余组分及PCR反应条件与3.1相同,且阴性、阳性对 照DNA模板浓度也应达到试样DNA模板浓度要求。
3.2.2以非兔科哺乳动物(普通牛、水牛、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚 鼠、猪、马、驴、狐、狗、水貂、貉子)以及非哺乳动物(鸡、鸭、鹅)的基因 组DNA作为PCR反应体系的阴性对照模板。
3.2.3以兔科兔属的兔基因组DNA作为PCR反应体系的阳性对照模板。
3.2.4以双蒸水作为PCR反应体系的空白对照。
4.PCR扩增产物的检测及结果判定
按20g/L的质量浓度称量琼脂糖,加入1×TAE缓冲液中,加热溶解,配制 成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加入5μLEB溶液,混匀,稍适冷却后, 将其倒入电泳板上,插上梳板,室温下凝固成凝胶后,置于1×TAE缓冲液中, 垂直向上轻轻拔去梳板。取5μLPCR产物与1μL加样缓冲液(称取250.0mg 溴酚蓝,加入10mL水,在室温下溶解12h;称取250.0mg二甲苯腈蓝FF,加 10mL水溶解;称取50.0g蔗糖,加30mL水溶解。混合以上三种溶液,加水定 容至100mL,在4℃下保存)混合后加入凝胶点样孔,同时在其中一个点样孔 中加入DNA分子量标准,接通电源在2V/cm~5V/cm条件下电泳15~30min检 测。
电泳结束后,取出琼脂糖凝胶,置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根 据DNA分子量标准判断扩增条带的大小,将电泳结果形成电子文件存档或用照 相系统拍照。
5结果分析与表述
5.1对照检测结果分析
如图1所示,阳性对照的PCR反应中,兔SEQIDNo.1所示的特异性序列 得到扩增,且扩增片段大小与预期片段大小一致,而阴性对照及空白对照中除引 物二聚体外没有任何扩增片段,表明PCR反应体系工作正常。
5.2样品检测结果分析和表述
5.2.1若兔SEQIDNo.1所示的特异性序列得到扩增,且扩增片段大小与预期片 段大小一致,表明样品中检测出兔所述特异性序列,表述为“样品中检测出兔源 性成分”。
5.2.2若兔SEQIDNo.1所示的特异性序列未得到扩增,或扩增片段大小与预期 片段大小不一致,表明样品中未检测出兔所述的特异性序列,表述为“样品中未 检测出兔源性成分”。
实施例2灵敏度试验
分别以0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL的兔DNA为模板,按照实 施例1的条件,扩增SEQIDNO.1核苷酸特异片段。结果如图2所示,1ng/μL 的模板浓度即有扩增,表明特异性引物所扩增片段具有较好的灵敏性。
实施例3试剂盒的组装
该试剂盒的组成包括:
上游引物(SEQIDNo.2);
下游引物(SEQIDNo.3);
2×TaqDNAMasterMix;
阳性对照DNA模板(兔DNA模板);
双蒸水。
本试剂盒-20℃储存12个月不影响使用效果。
试剂盒的应用方法:
依据以下的PCR反应体系加样,于200μL的EP管:
1.
2×TaqDNAMasterMix(购自北京艾德莱生物科技有限公司)是将PCR反 应所需的Taq酶、dNTP混合物、MgCl2以及反应缓冲液预先配置成2倍浓度的 混合物。
2.依据实施例1的PCR扩增条件上样
3.反应结束后取5μLPCR扩增产物,2.0%的琼脂糖凝胶电泳(技术参数: 2V/cm~5V/cm,电泳15min~30min),用溴化乙锭染色,凝胶成像系统检测结果。
每个反应需设置空白对照和阳性对照,反应体系及扩增条件同受测样品。 序列表说明:
SEQIDNO.1是目标核苷酸片段的核苷酸序列,序列长度为209bp;
SEQIDNO.2是扩增上述核苷酸片段的正向引物序列;
SEQIDNO.3是扩增上述核苷酸片段的反向引物序列。
机译: 多功能特征性兔胚胎干(ES)细胞系统及其在嵌合兔中的应用
机译: 控制引物退火,以提高核酸扩增试剂盒中退火的特异性。扩增DNA或核酸混合物的核酸序列的方法以及选择性扩增靶DNA或核酸混合物的核酸序列的方法用于检测DNA与两个或多个核酸样品中差异表达的mRNA的互补性的方法,扩增cDNA和DNA片段的方法可快速靶向。全长与mRNA cDNA互补的双细丝cDNA的cDNA群体,以及与mRNA互补的5'增强双细丝的cDNA,同时扩增而不是核苷酸靶序列的方法,产生数字印刷gDNA DNA的方法mRNA样品中的RNA和RNA.mRNA样品的多基因家族中用于鉴定同源片段的方法是保守的,这是一种在靶标中诱变的方法
机译: 兔育种中活性煤牧草添加剂的应用方法