阿奇霉素和泰利霉素在抗埃博拉病毒感染中的应用

摘要

本发明公开了阿奇霉素和泰利霉素的在抗埃博拉病毒感染方面的应用。本发明包含阿奇霉素或/和泰利霉素对埃博拉病毒感染的预防或治疗中的应用或与其他抗病毒药物的联合应用。

说明书

技术领域

本发明是关于阿奇霉素和泰利霉素的在抗埃博拉病毒感染方面的应用，属于医药技术领域。

背景技术

埃博拉出血热(Ebolahemorrhagicfever，EHF)由埃博拉病毒(Ebolavirus，EBV)引起，是严重危害公共安全和人类健康的重大烈性传染病，致死率高达50％-90％^[1]。埃博拉病毒可人传人，通过接触和空气飞沫等途径传播，被列为A类生化武器^[2]。

埃博拉病毒自1976年首次发现至今已造成11次具有规模的爆发流行，2014年4月在几内亚和利比里亚爆发新一轮埃博拉出血热疫情，截至2014年8月11日，已确认1975人感染，其中1069人死亡^[3]。埃博拉病毒的临床表现为急性起病，高热、头痛、肌痛、多器官出血衰竭，目前无疫苗、无有效治疗药物。

埃博拉病毒(EBV)属于丝状病毒科，是单链负链RNA病毒，有囊膜，表面有包膜糖蛋白GP，是唯一负责病毒进入宿主的病毒蛋白，中心为螺旋状核衣壳，包括基因组RNA及其他6种病毒蛋白^[4]。目前已确定5个亚型，分别为扎伊尔型(Zaire-EBV)、苏丹型(Sudan-EBV)、莱斯顿型(Reston-EBV)、科特迪瓦型(Coted'lvoire-EBV)和乌干达本迪布焦型(Bundibugyo-EBV)，其中扎伊尔型恶性程度最强，死亡率90％以上^[1]。

埃博拉出血热是人畜共患病，目前认为果蝠是病毒宿主，人类和灵长类动物普遍易感，主要爆发于非洲地区，美国、英国、瑞士和中东曾报道有输入病例。临床症状是突然高烧、头痛、肌痛、恶心呕吐、腹泻等，最终病人死于多器官出血衰竭、组织坏死^[5]。

目前尚无针对埃博拉病毒的有效疫苗和治疗药物，主要是通过防范措施控制病毒扩散，密切监控疫情，对有出血症状的可疑病人进行隔离观察。治疗方法主要是辅助性的，包括平衡电解质、修复血小板以防止出血，由于埃博拉康复者的血清在治疗疾病中无显著作用，常用的抗病毒方法，如干扰素、利巴韦林均无效^[6]，目前尚无特效治疗方法。在对EBV疫苗研发方面^[7,8]，DNA疫苗、腺病毒疫苗、水疱性口膜炎病毒重组疫苗由于其对保护非人灵长类感染EBV有效，目前进入临床研究阶段，但仍需更多研究证明其有效性。

在针对EBV药物研发方面^[6]：(1)常规抗病毒治疗方法，如利巴韦林和干扰素均无效；(2)血清疗法，应用恢复期病人的血清用于病人的被动免疫治疗，结果没有定论；(3)反义RNA或干扰RNA疗法，在鼠类和非人灵长类中显示有疗效。但RNA干扰疗法受限于明确EBV亚型序列的前提，无法应对疫情爆发早期的快速诊断；(4)针对EBV凝血异常的症状，有报道来源于线虫的抗凝蛋白rNAPc2在治疗非人灵长类感染中有33％的疗效。

现有数据表明病人的生存率与病毒量密切相关，当病毒量低于10^4.5pfu/ml血液的病人存活率大大提高^[9]。因此，尽量降低病毒的复制速度，让宿主的先天和后天免疫应答来克服感染是抗EBV药物研发的重要策略，阻断EBV进入的抑制剂研发有重大意义。

以宿主为靶点进行抗病毒药物筛选是当前病毒学研究领域的热点。病毒的进入需要宿主蛋白的参与。针对EBV进入宿主的过程，2005年和2011年分别发现细胞内含体/溶酶体中的组织蛋白酶B(CathepsinB)和NPC1蛋白(NiemannPickC1)是宿主应答EBV侵入的关键因子。另外，2014年最新报道发现细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸受体AXL也是重要的EBV进入相关的宿主因子^[10,11,12]。

阿奇霉素(结构式I)是15元环大环内酯类抗生素，该药物通过与细菌核糖核蛋白体的50s亚单位结合，妨碍肽链的延长，影响细菌蛋白合成而达到抑菌作用，对大多数革兰阳性菌、部分阴性菌及一些非典型致病菌均有效，是大环内酯类抗生素中对淋球菌和脑膜炎球菌等革兰阴性球菌抑菌活性最强的药物；对革兰阴性杆菌的作用比红霉素明显增强。阿奇霉素对流感嗜血杆菌的抑菌作用比红霉素强4-8倍；对肠杆菌科、霍乱弧菌具有良好的抑菌作用。泰利霉素(结构式II)作用机制与大环内酯类抗生素相似，主要通过直接与细菌核糖体的50S亚基结合，抑制蛋白质的合成，并阻抑其翻译和装配。泰利霉素与大环内酯类抗生素均可与23s核糖体RNA的Ⅱ和V结构区的核苷酸结合，但最大区别在于泰利霉素对野生型核糖体的结合力较红霉素和克拉霉素分别强约10倍和6倍。经检索，未见阿奇霉素和泰利霉素抗病毒活性报道，未见这两种药物抗埃博拉病毒作用报道。

本发明是基于应用埃博拉病毒感染模型对800个现有上市药物普筛，用以发现可以阻断EBV感染宿主细胞的药物。本发明是关于已有药物新用途的应用专利。

发明内容

本发明提供了如结构式(I)所示的阿奇霉素在预防或治疗抗埃博拉病毒的药物中的应用

上述的应用中，所述的药物是以结构式(I)所示的阿奇霉素作为有效成分的药物组合物

上述的应用中，所述的药物组合物还含有其它的抗病毒药。

上述的应用中，所述的埃博拉病毒为扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、科特迪瓦型和乌干达本迪布焦型，优选为扎伊尔型。

本发明还提供了如结构式(II)所示的泰利霉素在预防或治疗抗埃博拉病毒的药物中的应用

上述的应用中，所述的药物是以结构式(II)所示的泰利霉素作为有效成分的药物组合物

上述的应用中，所述的药物组合物还含有其它的抗病毒药。

上述的应用中，所述的埃博拉病毒为扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、科特迪瓦型和乌干达本迪布焦型，优选为扎伊尔型。

本发明再一方面还涉及以本发明化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

本发明的发明人发现阿奇霉素和泰利霉素可特异性的阻断埃博拉病毒感染宿主细胞。

还可以和其他的抗病毒药物进行联合用药。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/kg体重，优选为0.1-100mg/kg体重，更优选为1-60mg/kg体重，最优选为2-30mg/kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

有益技术效果

阿奇霉素和泰利霉素作为抗菌药已在临床长期应用，其安全性、药物代谢特性、毒副作用已经明确。而此次发现这两个药物抗埃博拉病毒的新用途将可快速使其应用于高危病毒感染，缓解疫情。

附图说明

图1.阿奇霉素阻断埃博拉病毒感染活性

图2.泰利霉素阻断埃博拉病毒感染活性

具体实施方式

实施例1.筛选模型的原理

埃博拉病毒进入宿主细胞是病毒感染的第一步，抑制病毒的进入就可有效阻断病毒感染。EBV包膜表面的糖蛋白(Glycoprotein，GP)是EBV进入过程的关键蛋白。

我们合成了扎伊尔型埃博拉病毒的包膜GP基因(EBV-ZaireGP，GeneAccessionNo.L11365)。通过共转染EBV-GP质粒和pNL4-3-Luc-R^-E^-，可获得EBV-GP为外壳包裹HIV核心的EBV重组病毒EBV-GP/HIV^[16]。该病毒颗粒具有以下特点：1)病毒对宿主细胞的选择性取决于EBVGP的特性；2)由于HIV载体上env、nef和vpr基因缺失，因此该病毒只能一次性进入宿主细胞并且不能复制，所以该病毒是安全的；3)该HIV载体上带有一个荧光素酶报告基因，因此被感染的细胞会表达荧光素酶，通过检测荧光素酶活性就可标示细胞被病毒感染的程度。同时，我们还制备了以水疱性口膜炎病毒VSV的糖蛋白(VSV-G)为外膜蛋白的VSV-G/HIV重组病毒作为模型对照组。当化合物可抑制EBV-GP/HIV病毒的进入，而对VSV-G/HIV病毒的进入无显著抑制时，视为特异性EBV进入抑制剂。

实施例2.实验方法

在本发明中应用了EBV-Zaire(GeneAccessionNo.L11365)对阿奇霉素和泰利霉素抗埃博拉病毒感染进行药理活性评价：

重组病毒制备^[16]：共转染2μgpcDNA3.1/EBV-GP质粒和2μgpNL4-3-Luc-R-E-质粒至293T细胞，转染后48h收集上清，上清液经0.45μm滤膜过滤，该上清中含有EBV-GP/HIV病毒颗粒，该重组病毒可用于感染。按照同样方法制备VSV-G/HIV重组病毒。

感染^[16]：感染前一天，按每孔6×10⁴个细胞的密度将A549细胞接种到24孔板上。用DMSO溶解阳性对照化合物或待筛选化合物，感染前15分钟加入细胞培养液中，以DMSO溶剂作空白对照。加入适宜稀释度的病毒液(EBV-GP/HIV-1或VSV-G/HIV-1)感染细胞。感染48小时后，弃去上清，然后向被感染的细胞每孔加入50μl细胞裂解液(Promega)裂解细胞，将30μl荧光素酶底物(Promega)与20μl细胞裂解液混合后用FB15荧光检测器(Sirius)仪器测定细胞荧光素酶的相对活性，其活性的强弱反映了病毒的感染的水平。结果显示，阿奇霉素和泰利霉素可有效抑制埃博拉病毒对宿主细胞的感染，结果见图1、图2和表1。

表1阿奇霉素和泰利霉素对EBV-GP/HIV感染作用

实施例3.细胞毒性试验

应用MTS法测定了所有涉及的药物对A549和293ET细胞的细胞毒性，结果显示阿奇霉素和泰利霉素在10μM的终浓度下均无细胞毒性。

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