一种半枝莲药材及其配方颗粒中野黄芩苷和野黄芩素的含量测定方法

摘要

本发明涉及一种半枝莲药材及其配方颗粒中野黄芩苷和野黄芩素的含量测定方法。其特征：采用普通的等度洗脱，以体积比为12.5∶15-16.2∶71.3-72.5的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相，在波长340±2nm处，同时测定了半枝莲药材及其配方颗粒中的野黄芩苷和野黄芩素含量。方法简便、快捷，易于普及掌握；在三种不同的色谱柱上，各波峰分离良好。与药典一部半枝莲药材项下收载的方法比较，突出的进步是简化了样品处理程序，节约了时间、成本，由野黄芩苷的单成分测定，提升为2种成分同时测定，质量可控性提高，并克服了野黄芩苷包覆杂质峰，含量结果欠准确的弊端。

说明书

技术领域

一种半枝莲药材及其配方颗粒中野黄芩苷和野黄芩素的含量测定方法。

背景技术

半枝莲为唇形科植物ScutellariabarbataD.Don的干燥全草。是一种常用中药，具清热解毒，化瘀利尿的功效。用于疔疮肿毒，咽喉肿痛，跌扑伤痛，水肿，黄疸，蛇虫咬伤。主含黄酮类成分，如黄芩素、汉黄芩素、芹菜素、木犀草素、柚皮素、野黄芩苷、7-羟基-5，8二甲氧基黄酮、7-羟基-5，8二甲氧基黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、5、7、8、2-四羟基黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷等，还含有一些二萜和三萜内酯类等。其质量标准在中国药典2015年版一部半枝莲药材项下未收载薄层鉴别项目，收载了2项含量测定，一项是以野黄芩苷为指标，采用分光光度法，测定药材中的总黄酮含量；另一项是采用HPLC法，以甲醇-水-醋酸(35∶61∶4)为流动相测定野黄芩苷的含量。查阅文献得知，目前半枝莲药材及其制剂中都是以野黄芩苷为指标，采用药典的流动相，测定野黄芩苷含量的。也查阅到同时测定野黄芩素、木樨草素和芹菜素的报道，但采用的是梯度洗脱，其相对含量都比较低。目前还未查阅到采用等度洗脱，同时测定野黄芩苷与野黄芩素的报道。在上述背景情况下，为简便、快捷、多指标控制半枝莲药材及其配方颗粒的质量，发明了采用普通色谱仪、等度洗脱，同时测定半枝莲及其配方颗粒中的野黄芩苷和野黄芩素的含量。

半枝莲药材配方颗粒的制备方法取半枝莲饮片13000-14000g，分别加水8倍量，煎煮提取二次，每次1-2小时，滤过，滤液70℃减压浓缩，浓缩液喷雾干燥或70℃减压干燥，加糊精适量，混匀，制粒成1000g，分装，得半枝莲配方颗粒。

发明内容

采用普通的等度洗脱，以体积比为12.5∶15-16.2∶71.3-72.5的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；柱温：30℃；在340±2nm处；同时测定了半枝莲药材及其配方颗粒中野黄芩苷和野黄芩素的含量。方法简便、快捷，易于普及掌握；在三种不同的色谱柱上，各波峰分离良好，基线平稳，在44分钟内出峰完毕。

通过方法学考察，野黄芩苷的进样量在0.0744～0.744μg，与峰面积呈良好的线性关系(见表1、图1)，回归方程为：Y＝44.173X-0.9457，r＝0.9999；野黄芩素进样量在0.0516～0.3612μg，与峰面积呈良好的线性关系(见表2、图2)，回归方程为：Y＝51.554X-0.184，r＝0.9999。采用加样回收实验，结果表明：野黄芩苷的平均回收率为101.18％(n＝9)，RSD为2.67％(见表3)；野黄芩素的平均回收率为101.08％(n＝9)，RSD为1.94％(见表4)。精密度(见表5)、稳定性(见表6)、重复性(见表7)、专属性(见图3、4、5)与柱耐用性(见表8、图6、7、8)实验均符合方法学要求。适用于半枝莲药材及其配方颗粒中野黄芩苷和野黄芩素的定量测定。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：

(1)色谱条件与系统适用性试验以体积比为12.5∶15-16.2∶71.3-72.5的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；柱温：30℃；检测波长为340±2nm；理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备分别取野黄芩苷和野黄芩素对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含野黄芩苷40μg，野黄芩素为12μg的溶液，作为对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备取半枝莲药材细粉0.5g，精密称定；或半枝莲配方颗粒0.1g，精密称定；分别置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，药材细粉以功率250W，频率33kHz超声处理30分钟，配方颗粒以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定野黄芩苷和野黄芩素的含量。

以岛津WondasilC₁₈与迪马迪马DiamonsilC₁₈色谱柱，优选的半枝莲药材及其配方颗粒的测定技术方案为：

(1)色谱条件与系统适用性试验以体积比为12.5∶15∶72.5的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；柱温：30℃；检测波长为340±2nm；理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备分别取野黄芩苷和野黄芩素对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含野黄芩苷40μg，野黄芩素为12μg的溶液，作为对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备取半枝莲药材细粉0.5g，精密称定；或半枝莲配方颗粒0.1g，精密称定；分别置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，药材细粉以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟，配方颗粒以功率250W，频率33kHz超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定野黄芩苷和野黄芩素的含量。

以安捷伦AgilentEclipsePlusC₁₈色谱柱，优选的半枝莲药材及其配方颗粒的测定技术方案为：

(1)色谱条件与系统适用性试验以体积比为12.5∶16.2∶71.3的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；柱温：30℃；检测波长为340±2nm；理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备分别取野黄芩苷和野黄芩素对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含野黄芩苷40μg，野黄芩素为12μg的溶液，作为对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备取半枝莲药材细粉0.5g，精密称定；或半枝莲配方颗粒0.1g，精密称定；分别置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，药材细粉以功率250W，频率33kHz超声处理30分钟，配方颗粒以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定野黄芩苷和野黄芩素的含量。

本发明的原理如下：

野黄芩苷及野黄芩素是苷与苷元的关系，都是黄酮类化合物，含多个多酚羟基，易溶于含水醇，二者光谱吸收图一致，都在288±2nm和340±2nm有最大吸收(见图9、10)，但340nm处灵敏度高，所以以340nm为检测波长，进行含量测定。直接以含水甲醇超声提取药材或配方颗粒中的野黄芩苷及野黄芩素，滤过后，进样即可。无萃取、无蒸干、简便、快捷、实用。通过调整乙腈、甲醇与0.1％磷酸的体积比，使2种成分在3种不同的色谱柱上，44分钟内出峰完毕。再依据该2种成分的进样量在一定范围内，与其峰面积呈现良好的线性关系，而用于定量测定。

本发明的创新点及有益效果如下：

(1)采用普通等度洗脱、反相色谱柱，以体积比为12-12.5∶15-16.2∶71.3-72.5的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；同时测定了半枝莲药材及其配方颗粒中的野黄芩苷及野黄芩素的含量。通过调整流动相的比例，使2种成分在三种不同的色谱柱上，44分钟出峰完毕，各波峰分离良好。野黄芩苷和野黄芩素的同时定量测定尚属首次报道。实现了简便、快捷、科学、规范、双指标控制药材与其配方颗粒质量的愿望。

(2)半枝莲药材因含多种性质近似的黄酮类，要得到分离度良好的多种黄酮成分的色谱峰，必须通过色谱柱的多因素耐用性试验研究。本发明获得在三种不同的色谱柱上，都分离良好的色谱条件(见图6、7、8)。克服了药典一部半枝莲药材项下收载的含量测定条件，无法将野黄芩苷及野黄芩素波峰有效分离(见图11)，而导致无法准确定量测定的弊端，确保了含量结果的准确性与重现性。

(3)本发明与中国药典2015年版一部半枝莲药材项下的样品前处理程序比较，药典方法较繁琐、费时，仅样品提取就需要6-7小时，花费石油醚与甲醇225ml；而本发明药材提取花费0.5小时，70％甲醇25ml；配方颗粒花费10分钟，70％甲醇25ml。以含水甲醇取代石油醚和甲醇，不但减少了脂溶性成分提出，而且利于测定结束后，色谱柱的冲洗保护。充分体现了本发明的进步与显著的实用效果。

(4)在野黄芩苷及野黄芩素的含量上，本方法只需一台普通的带紫外检测器的液相色谱仪，就能够简便、快捷、准确地进行定量测定。

附图说明

图1野黄芩苷的线性关系图

图2野黄芩素的线性关系图

图3为野黄芩苷和野黄芩素对照品HPLC色谱图

图4为半枝莲药材HPLC色谱图

图5为半枝莲配方颗粒HPLC色谱图

图6耐用性试验-岛津WondasilC₁₈(4.6×250mm)的样品HPLC色谱图

图7耐用性试验-迪马dimonsil柱(4.6×250mm)的样品HPLC色谱图

图8安捷伦AgilentEclipsePlusC₁₈柱(4.6×250mm)的样品HPLC色谱图

图9野黄芩苷的光谱扫描图

图10野黄芩素的光谱扫描图

图11药典收载流动相分离的配方颗粒HPLC色谱图

图1、图2纵坐标为峰面积；横坐标为进样量(μg)

图9、10纵坐标为吸收强度(mAU)；横坐标为吸收波长(nm)

图3、图4、图5、图6、图7、图8、图11中，1.野黄芩苷2.野黄芩素

本发明具体实施方式

实施例1：

(1)色谱条件与系统适用性试验以体积比为12.5∶15∶72.5的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；柱温：30℃；检测波长为340±2nm；理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备分别取野黄芩苷和野黄芩素对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含野黄芩苷40μg，野黄芩素为12μg的溶液，作为对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备取半枝莲药材细粉0.5g，精密称定；或半枝莲配方颗粒0.1g，精密称定；分别置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，药材细粉以功率250W，频率33kHz超声处理30分钟，配方颗粒以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定野黄芩苷和野黄芩素的含量。测定了3批市售半枝莲药材与三批配方颗粒含量，结果见表9。

实施例2：

(1)色谱条件与系统适用性试验以体积比为12.5∶16.2∶71.3的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；柱温：30℃；检测波长为340±2nm；理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备分别取野黄芩苷和野黄芩素对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含野黄芩苷40μg，野黄芩素为12μg的溶液，作为对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备取半枝莲药材细粉0.5g，精密称定；或半枝莲配方颗粒0.1g，精密称定；分别置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，药材细粉以功率250W，频率33kHz超声处理30分钟，配方颗粒以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定野黄芩苷和野黄芩素的含量。

表1野黄芩苷进样量与峰面积

表2野黄芩素进样量与峰面积

表3样品中野黄芩苷的回收率试验结果

表4样品中野黄芩素的回收率试验结果

表5精密度实验结果(峰面积)

表6稳定性实验结果(峰面积)

表7重复性试验结果(mg/g)

表8耐用性试验-不同色谱柱对同一样品的含量测定结果(mg/g)

注：上表中色谱柱规格都是4.6×250mm。

表9半枝莲药材和配方颗粒的含量测定结果(mg/g)