含灵芝和银杏叶的中药组合物用于中风后促进康复的应用

摘要

本发明公开了一种含有灵芝和银杏叶的中药组合物在制备中风后促进康复的药物中的应用，其中，该组合物由以下组分制成：灵芝300-400重量份，银杏叶300-400重量份，淮牛膝200-290重量份，玄参200-290重量份，石菖蒲150-190重量份，天麻100-140重量份。本发明含灵芝和银杏叶的中药组合物治疗给药对大鼠大脑中动脉闭塞再灌注所致脑损伤具有显著的保护作用；对于治疗大鼠大脑中动脉闭塞所致永久性脑缺血具有显著的保护作用；对PAF、ADP诱导家兔血小板聚集有显著的抑制作用；对血栓形成具有显著的抑制作用；能显著延长小鼠出血时间和凝血时间，用于中风后促进康复具有显著效果。

说明书

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种含灵芝和银杏叶的中药组合物用于中风后促进康复的应用。

背景技术

中风，中医病名，有外风和内风之分，外风因感受外邪(风邪)所致，在《伤寒论》名曰中风(亦称桂枝汤证)；内风属内伤病证，又称类中风，脑卒中，卒中，风痱。现代一般称中风多指内伤病证的类中风，多因气血逆乱、脑脉痹阻或血溢于脑所致。以突然昏仆、半身不遂、肢体麻木、舌蹇不语，口舌歪斜，偏身麻木等为主要表现的脑神疾病，并具有起病急、变化快，如风邪善行数变的特点。

发明人经实验探索发现一种含灵芝和银杏叶的中药组合物用于制备中风后促进康复的药物的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种含灵芝和银杏叶的中药组合物在制备中风后促进康复的药物中的应用。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种含有灵芝和银杏叶的中药组合物在制备中风后促进康复的药物中的应用，其中，该组合物由以下重量份的组分制成：

灵芝300-400重量份银杏叶300-400重量份淮牛膝200-290重量份

玄参200-290重量份石菖蒲150-190重量份天麻100-140重量份

上述组合物优选由以下组分制成：

灵芝300-350重量份银杏叶300-350重量份淮牛膝250-290重量份

玄参250-290重量份石菖蒲150-180重量份天麻110-140重量份

上述组合物最优选由以下组分制成：

灵芝333重量份银杏叶333重量份淮牛膝278重量份

玄参278重量份石菖蒲167重量份天麻125重量份

上述中药组合物可与药学上允许的辅料制成药学规定的剂型，所述的剂型优选为胶囊剂。

该组合物的制备方法包括以下步骤：

a、将石菖蒲粉碎成颗粒；

b、将石菖蒲颗粒采用CO₂超临界萃取，萃取压力为22-30Mpa，萃取釜温度为45-60℃，萃取时间为0.5-1.5小时，得挥发油和石菖蒲萃余物；

c、取挥发油用等体积的乙醇溶解，得挥发油乙醇溶液；另取挥发油重量4-8倍量的β-环糊精，用β-环糊精3-5倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加上述挥发油乙醇溶液，碾磨包合20-40分钟，倾出，0-4℃冷藏静置24小时以上，滤过，于40-80℃真空干燥，即得挥发油包合物；

d、灵芝、银杏叶、淮牛膝、玄参和天麻、以及石菖蒲萃余物加入处方总药材6-10倍重量浓度为70-90％的乙醇，加热回流提取1-3次，每次1-2小时，提取液合并，静置，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃条件下相对密度为1.15～1.30的清膏；

e、将清膏在60-80℃减压干燥，得干膏；

f、将干膏和挥发油包合物混合均匀。

上述组合物的制备方法优选包括以下步骤：

a、将石菖蒲粉碎成颗粒；

b、将石菖蒲颗粒采用CO₂超临界萃取，萃取压力为22-30Mpa，萃取釜温度为45-60℃，萃取时间为0.5-1.5小时，得挥发油和石菖蒲萃余物；

c、取挥发油用等体积的乙醇溶解，得挥发油乙醇溶液；另取挥发油重量4-8倍量的β-环糊精，用β-环糊精3-5倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加上述挥发油乙醇溶液，碾磨包合20-40分钟，倾出，0-4℃冷藏静置24小时以上，滤过，于40-80℃真空干燥，即得挥发油包合物；

d、灵芝、银杏叶、淮牛膝、玄参和天麻、以及石菖蒲萃余物加入处方总药材6-10倍重量浓度为70-90％的乙醇，加热回流提取1-3次，每次1-2小时，提取液合并，静置，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃条件下相对密度为1.15～1.30的清膏；

e、将清膏与清膏重30-40％的微晶纤维素混合，置60℃-80℃条件下减压干燥，得干膏；

f、将干膏和挥发油包合物粉碎成细粉，与清膏重5-55％的微晶纤维素和干膏重0.5％硬脂酸镁混合均匀，得细粉。

所述的中风后遗症表现为半身不遂，肢体无力，口舌歪斜，言语謇涩，智能减退，口角流涎。

上述含有灵芝和银杏叶的中药组合物在制备益气养阴活血、化痰通络醒脑的药物中应用，其中，该组合物由以下重量份的组分制成：

灵芝300-400重量份银杏叶300-400重量份淮牛膝200-290重量份

玄参200-290重量份石菖蒲150-190重量份天麻100-140重量份。

上述组合物优选由以下组分制成：

灵芝300-350重量份银杏叶300-350重量份淮牛膝250-290重量份

玄参250-290重量份石菖蒲150-180重量份天麻110-140重量份。

上述组合物最优选由以下组分制成：

灵芝333重量份银杏叶333重量份淮牛膝278重量份

玄参278重量份石菖蒲167重量份天麻125重量份。

与现有技术比较本发明的有益效果：

本发明含灵芝和银杏叶的中药组合物治疗给药对大鼠大脑中动脉闭塞再灌注所致脑损伤具有显著的的保护作用；对于治疗大鼠大脑中动脉闭塞所致永久性脑缺血具有显著的保护作用；对PAF、ADP诱导家兔血小板聚集有显著的抑制作用；对血栓形成具有显著的抑制作用；能显著延长小鼠出血时间和凝血时间。

另外，本发明中药组合物能对连二亚硫酸钠(Na2S2O4)合并缺糖致体外皮层神经元细胞缺氧缺糖损伤模型起到很好的保护作用；能对血小板活化因子(PAF)致皮层神经元细胞氧化应激损伤模型的保护作用明显。本发明中药组合物含药血清治疗给药对体外培养皮层神经元具有显著的保护作用。

以下通过试验例对中风后促进康复进行具体说明。采用的试验样品简称复方银灵通胶囊，通过实施例1方法制备得到。

一、试验材料

1、药品与试剂

受试药名称：复方银灵通胶囊：性状：棕色粉末(按照实施例方法制备得到)，人用量：成人服用生药材量：18.168g，6.0g浸膏粉末/人.d^-1，每克浸膏粉末相当于生药3.028g。配制方法：将受试药用0.5％CMC-Na研磨配制成所需浓度的均匀混悬液。

银杏叶片：扬子江药业集团有限公司，规格：每片含总黄酮醇苷19.2mg，萜类内酯4.8mg，批号：12053121。药物配制：临用前用0.5％CMC-Na研磨配制成所需浓度的均匀混悬液。

阿司匹林肠溶片：拜耳医药保健有限公司，规格：100mg，临用前用0.5％CMC-Na研磨配制成所需浓度的均匀混悬液。

水合氯醛：国药集团化学试剂有限公司，临用前用0.9％氯化钠注射液配制成浓度为3％的溶液。

红四氮唑(TTC)，国药集团化学试剂公司产品，临用前称取TTC粉末，用磷酸盐缓冲液溶解配制成1％的TTC溶液。

甲醛溶液：A.R，西陇化工股份有限公司产品，规格：500ml/瓶，批号：1005152。

血小板活化因子(PAF)：SIGMA公司产品。

配制：①取PAF1mg，置于2.6ml氯化钠注射液中使溶解，分装于具塞密封管中0.1ml/支，-20℃保存，临用前以氯化钠注射液100倍稀释备用(浓度为7.072μmol/L)。②取PAF5mg,用DMSO溶解配制为母液，-20℃保存。临用前用灭菌PBS稀释至所需浓度(作用于神经元的终浓度为40μmol/L)。

5＇﹣腺苷二磷酸二钠盐(ADP)：SIGMA公司，批号：YY1124B056W。

配制：①取10mgADP，置6.64ml0.9％氯化钠注射液中，震荡至完全溶解，先配成3mmol/L的保存液，分装于具塞密封管，0.1ml/支，-20℃保存。临用前以0.9％氯化钠注射液稀释10倍即可(浓度为300μmol/L)。②取400mgADP，用生理盐水配成20mg/ml的溶液。

MEM培养基：美国GIBCO公司，批号：1133365。取MEM粉末溶于1000ml灭菌三蒸中，用NaHCO3调pH值至7.0，过滤除菌、分装，4℃冰箱保存。使用前加入10％胎牛血清。

无糖EBSS(Earle’sbalancedsaltsolution)缓冲液：称取NaCl6.8g、NaHCO₃2.2g、KCl0.4g、CaCl₂·2H₂O0.265g、MgSO₄0.09767g、NaH₂PO₄0.122g，溶于1000ml三蒸水中，pH7.2-7.4，过滤除菌，4℃冰箱保存。

含糖EBSS缓冲液：称取NaCl6.8g、NaHCO₃2.2g、KCl0.4g、CaCl₂·2H₂O0.265g、MgSO₄0.09767g、NaH₂PO₄0.122g、葡萄糖1g，溶于1000ml三蒸水中，pH7.2-7.4，过滤除菌，4℃冰箱保存。

消化液：胰酶，BIOSHARP公司产品；胰酶用PBS配至0.25％，过滤除菌；EDTA用PBS配至0.02％，高压灭菌。胰酶、EDTA1：1混合，4℃冰箱保存。

β-actin，山羊抗兔(抗小鼠)IgG，：北京博奥森生物技术有限公司产品。

Syn抗体，NF-κBp65抗体，NF-κBpp65抗体：IκBα抗体，pIκBα抗体均为SantaCruzBiotechnology公司产品。

2、试验动物

雄性清洁级SD大鼠，体重250～300g，苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司提供，生产许可证号：SCXK(苏)2009-0001；白色家兔，体重1.8-2.0kg，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，动物生产许可证号：SCXK(苏)2012-0008。

二、实验方法与结果：

1、复方银灵通胶囊治疗给药对大鼠大脑中动脉闭塞再灌注所致脑损伤的保护作用(第一天给药3次，以后每天给药一次，连续给药14天)

1.1对死亡率、神经行为学评分、脑含水量、梗塞率的影响

清洁级雄性SD大鼠105只，体重250-300g，采用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型^[1]。伪手术组大鼠除不插入线栓外，其他操作同模型组。造模后将动物分为7组，每组15只，复方银灵通胶囊3个剂量组，分别为：1.2g/kg(0.24g/ml)，0.6g/kg(0.12g/ml)，0.3g/kg(0.06g/ml)。阳性对照药银杏叶提取物组4mg/kg(0.8mg/ml)。另设伪手术组及缺血模型对照组(均给以等容积的0.5％CMC-Na)。于复灌后3h开始灌胃给药，每天给药一次，总共给药15天，首次给药剂量为维持量的3倍。

实验过程中观察并记录动物的死亡情况(死亡前症状和死亡数)。即记录动物的存活率。

渔线的制备：将一长40mm，直径0.26mm的渔线的一端用记号笔标记，在距离此标记端18mm处用记号笔再做一标记，置于生理盐水中备用。

于第一次给药后0.5h始，隔天参照神经功能缺陷评分法(18分标准)对各组大鼠进行评分^[2]，标准如下：

大鼠神经行为学评分标准

上述指标测定后，将大鼠麻醉，测脑温，之后处死大鼠。取出大脑，迅速置于-20℃速冻10-15min，至鼠脑变硬时，从额极2mm开始，做冠状均切五刀，后方至大脑与后脑交界处，切成2mm厚的六片后迅速将脑片置于适量1％TTC的磷酸缓冲溶液中^[3]，避光温孵^[4]，每隔7～8分钟翻动一次，不时观察脑片颜色变化，待红色区鲜明显现时取出脑片(约30min)，用数码相机拍照后输入电脑，之后用Imageproplus计算梗塞区(白色)和两半脑体积，计算梗塞百分比如下：

脑梗死体积百分比＝{[总梗死体积-(右半脑体积-左半脑体积)]/左半脑体积}×100％。

将染色后的脑组织称得大脑湿重，然后置于110℃烘箱烘干，对照大脑湿重求出脑含水量如下^[5]：

脑组织含水量(％)＝(1-脑组织干重/脑组织湿重)×100％

结果见表1～表2。

表1对局灶性脑缺血再灌注大鼠死亡率的影响

各组死亡率如上表所示。随银灵通剂量升高，大鼠死亡率有逐渐降低的趋势。

表2对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经行为学评分的影响

^#p<0.05，^##p<0.01模型对照组vs.伪手术组；^*p<0.05，^**p<0.01vs.模型对照组；^ap<0.05，^aap<0.01银灵通组vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01银灵通组vs.阿司匹林组

由表2可见，伪手术组未见明显的神经行为学损伤。与伪手术组相比，模型组自缺血后第一天开始，神经行为学评分均极显著性降低(p<0.01)。与模型对照组相比，银灵通高剂量组能显著性升高缺血再灌注后第8d大鼠神经行为学评分(p<0.05)，能极显著性升高缺血再灌注后第10d、12d、14d大鼠神经行为学评分(p<0.01)；银灵通中剂量组能显著性升高缺血再灌注后12d大鼠神经行为学评分(p<0.05)，能极显著性升高缺血再灌注后第14d大鼠神经行为学评分(p<0.01)。银灵通各剂量组与银杏叶片组相比，银灵通低剂量组第14d神经行为学评分显著性降低(p<0.05)。

表3对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑温、梗塞百分比及脑组织含水量的影响

^#p<0.05，^##p<0.01模型对照组vs.伪手术组；^*p<0.05，^**p<0.01vs.模型对照组；^ap<0.05，^aap<0.01银灵通组vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01银灵通组vs.阿司匹林组

由表3可见，缺血再灌注后第14d，各造模组脑温和脑含水量与伪手术组相比均无显著性差异(p>0.05)；缺血再灌注后14d，伪手术组未见明显的梗死区，模型对照组脑梗塞百分比为41.4±9.8％，与模型对照组相比银灵通高剂量组脑梗塞百分比极显著性降低(p<0.01)，为19.5±6.7％；银灵通中剂量组脑梗塞百分比为29.9±5.5％，与模型对照组相比显著性降低(p<0.05)；银杏叶片组和阿司匹林组脑梗塞百分比也极显著性降低(p<0.05)，分别为16.6±4.1％和14.3±4.4％。

与银杏叶片组相比，银灵通中、低剂量组脑梗塞百分比极显著性升高(p<0.01)；与阿司匹林组相比，银灵通中、低剂量组脑梗塞百分比极显著性升高(p<0.01)。

1.2对学习记忆功能、局部脑血流量和脑组织病理学的影响

另取雄性SD大鼠105只，造模及给药方法同上。于第14次给药后0.5h(复灌后第13d，采用Y型迷宫测定大鼠学习和记忆功能^[6]：将受试大鼠放入迷宫内适应8min后，给予电刺激，随机改变电击区和安全区，电击时大鼠径直逃避至安全区为正确反应，否则为错误反应^[7]。学习成绩以在连续的10次电击中，正确反应达9次时的累计电击次数来表示；学习成绩测定后24h，对大鼠连续电击10次，其中正确反应次数即为该大鼠的记忆成绩。而后腹腔注射3％水合氯醛(300mg/kg)麻醉大鼠。用大鼠脑立体定位仪将大鼠头部固定，暴露颅骨，用齿科打磨器于前囟点右2mm/下2mm处钻一直径为2-3mm的骨窗(不能损伤硬脑膜)，将TSD144型激光多普勒探头置于骨窗中较粗血管的正上方，用脑立体定位仪固定探头，连接MP150型十六导生理记录仪进行脑血流监测，待曲线平稳约15min后，记录平稳区段的平均脑血流量^[2]。然后将大鼠处死，取出损伤侧脑于10％甲醛溶液中固定，由病理专业人员制片，HE染色，并于光镜下阅片，观察大脑皮质海马区细胞形态学改变^[8]。

表4对局灶性脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力的影响

^#p<0.05，^##p<0.01模型对照组vs.伪手术组；*p<0.05，**p<0.01vs.模型对照组；^ap<0.05，^aap<0.01银灵通组vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01银灵通组vs.阿司匹林组

缺血再灌注后第13d进行学习能力测定，由表4可见，与伪手术组相比，模型对照组大鼠学习次数极显著性增多，表明在缺血再灌注后第13d，大鼠的学习能力还是严重受损。与模型对照组相比，银灵通高剂量组、银灵通中剂量、银杏叶片组和阿司匹林组大鼠学习能力均极显著性提高(p<0.01)，银灵通低剂量组学习能力显著性提高(p<0.05)。学习能力测定结束后24h进行记忆能力测定，银灵通高剂量组和银杏叶片组及阿司匹林组均能极显著性提升缺血再灌注大鼠记忆能力(p<0.01)，银灵通中、低剂量组能显著性提升缺血再灌注大鼠记忆能力(p<0.05)。

表5对局灶性脑缺血再灌注大鼠局部脑血流量的影响

^#p<0.05，^##p<0.01vs.伪手术组；*p<0.05，**p<0.01vs.模型对照组；^ap<0.05，^aap<0.01银灵通组vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01银灵通组vs.阿司匹林组

由表5可见，与伪手术组相比，银杏叶片组局部脑血流量无显著性差异(p＞0.05)，银灵通高剂量组脑血流量显著性降低(p<0.05)，其他各组15d后局部脑血流量均极显著性降低(p<0.01)。与模型对照组相比，除复方低剂量组外其他各组15d后局部脑血流量均极显著性升高(p<0.01)。

与银杏叶片组相比，银灵通中剂量组脑血流量显著性降低(p<0.05)，银灵通低剂量组局部脑血流量极显著性降低(p<0.01)；与阿司匹林组相比，银灵通低剂量组脑血流量极显著性降低(p<0.01)，其他各组间比较无显著性差异(p＞0.05)。

病理组织检查标本分为7组，分别为伪手术组、模型组、复方银灵通胶囊高、中和低剂量组、阳性药1组和阳性药2组，每组8例。检测结果如下所述：

伪手术组：大脑皮质层和海马区结构清楚，完整，神经细胞排列整齐，细胞核膜清楚，核仁明显，染色质丰富。

模型对照组：右侧大脑皮质和海马区结构紊乱，见不同程度的梗死区，梗死区嗜伊红淡染，梗死区中心神经元、神经胶质细胞和神经纤维坏死，结构破坏，组织结构疏松呈筛网状，个别的梗死灶周边有炎性细胞浸润。

复方银灵通胶囊高、中和低剂量组：高、中和低剂量组部分例大脑与模型组大脑病理特点相似，右侧大脑皮质和/或海马区结构紊乱，见不同程度的梗死区，梗死区嗜伊红淡染，梗死区中心神经元、神经胶质细胞和神经纤维坏死，结构破坏，组织结构疏松呈筛网状，个别的梗死灶周边有炎性细胞浸润。低剂量组的梗死区范围与模型组接近，中剂量组的梗死区范围略小于模型组，高剂量的梗死区范围明显小于模型组。

阳性药1银杏叶提取物组和阳性药2阿司匹林组

阳性药1组和阳性药2组大脑与模型组大脑病理特点相似，只是程度较轻，均见右侧大脑皮质和/或海马区结构紊乱，见程度较轻的梗死区，梗死区嗜伊红淡染，梗死区中心神经元、神经胶质细胞和神经纤维坏死，结构破坏，组织结构疏松，个别的梗死灶周边有炎性细胞浸润。

1.3对脑组织及血清生化指标的影响

取雄性SD大鼠105只，造模及给药方法同上。末次给药后0.5h，眼眶静脉丛取血分离出血清，取血后立即处死大鼠，取出大脑，将损伤侧脑前部分离，用组织剪充分剪碎并混匀，称取0.5g加4.5ml冰冷的生理盐水中充分研磨使组织匀浆化，4℃1500转离心10分钟，取上清即为10％脑组织匀浆液，用于生化指标的测定。按试剂盒说明书测定大鼠血清中乳酸脱氢酶(LDH)活力^[9]，及脑组织中总抗氧化能力(T-AOC)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力^[10]、丙二醛(MDA)含量、Na⁺-K⁺ATP酶和Ca²⁺-Mg²⁺ATP酶、肌酸激酶(CK)活力、乳酸(LD)含量，组织蛋白测定用BCA蛋白测定法。结果见表6～表8。

表6对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织T-AOC、SOD、MDA的影响

^#p<0.05，^##p<0.01模型对照组vs.伪手术组；*p<0.05，**p<0.01vs.模型对照组；^ap<0.05，^aap<0.01银灵通组vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01银灵通组vs.阿司匹林组

由表6可见

模型对照组与伪手术组相比，总抗氧化能力(T-AOC)、SOD活力及MDA活力均极显著性降低(p<0.01)；

与模型对照组相比，银灵通高剂量组、阿司匹林组能极显著性升高脑组织T-AOC的活力(p<0.01)，银杏叶片、银灵通中剂量组能显著性提高脑组织T-AOC的活力(p<0.05)，银杏叶片、阿司匹林、银灵通高、中剂量组均能极显著性提高脑组织SOD活力(p<0.01)，银灵通低剂量组能显著性提高脑组织SOD活力(p<0.05)，银杏叶片、银灵通高剂量组能极显著性降低脑组织MDA活力(p<0.01)，阿司匹林、银灵通中剂量组能显著性降低脑组织中MDA的活力(p<0.05)。

与银杏叶片组相比，银灵通低剂量组MDA活力极显著性升高(p<0.01)；与阿司匹林组相比，银灵通中、低剂量组T-AOC显著性降低(p<0.05)，银灵通低剂量组MDA活力显著性升高(p<0.05)；银灵通其他各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异(p>0.05)。

表7对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织Na⁺-K⁺ATP酶/Ca²⁺-Mg²⁺ATP酶的影响

^#p<0.05，^##p<0.01模型对照组vs.伪手术组；*p<0.05，**p<0.01vs.模型对照组；^ap<0.05，^aap<0.01银灵通组vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01银灵通组vs.阿司匹林组

由表7可见，模型对照组与伪手术组相比，模型对照组Na⁺-K⁺ATP酶活力、Ca²⁺-Mg²⁺ATP酶活力极显著性降低(p<0.01)；

与模型对照组相比，银杏叶片、阿司匹林、银灵通高剂量组均能显著性升高脑组织Na⁺-K⁺ATP酶活力(p<0.05)，银杏叶片、阿司匹林、银灵通高剂量组能显著性升高脑组织中Ca²⁺-Mg²⁺ATP酶活力(p<0.05)，其他各组比较无显著性差异(p>0.05)；

与银杏叶片组相比，银灵通低剂量组Ca²⁺-Mg²⁺ATP酶活力显著性降低(p<0.05)；银灵通其他各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异(p>0.05)。

表8对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织CK、LD活力及血清LDH的影响

^#p<0.05，^##p<0.01模型对照组vs.伪手术组；*p<0.05，**p<0.01vs.模型对照组；^ap<0.05，^aap<0.01银灵通组vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01银灵通组vs.阿司匹林组

由表8可见，模型对照组与伪手术组相比，各组间CK活力均无显著性差异(p>0.05)，模型对照组脑组织LD含量及血清LDH活力均极显著性升高(p<0.01)；

与模型对照组相比，银灵通高、中剂量组、银杏叶片组、阿司匹林组脑组织LD活力显著性降低(p<0.05)，银灵通高、中剂量组、银杏叶片组、阿司匹林组血清LDH活力均极显著性降低(p<0.01)；

与银杏叶片组相比，银灵通低剂量组血清LDH活力显著性降低(p<0.05)；其他各组间比较均无显著性差异(p>0.05)。

2、复方银灵通胶囊治疗大鼠大脑中动脉闭塞所致永久性脑缺血的实验研究(第一天给药3次，以后每天给药一次，连续给药15天)

2.1对死亡率、神经行为学评分、脑含水量、梗塞率的影响

清洁级雄性SD大鼠105只，体重250-300g，参考Longa等人的方法，采用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型^[1]。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞MCA。造模后将动物分为7组，每组15只，复方银灵通胶囊3个剂量组，分别为：1.2g/kg(0.24g/ml)，0.6g/kg(0.12g/ml)，0.3g/kg(0.06g/ml)。阳性对照药1银杏叶片组4mg/kg(0.8mg/ml)。阳性对照药2阿司匹林组30mg/kg(6mg/ml)。另设假手术组及缺血模型对照组(均给以等容积的0.5％CMC-Na)。于缺血后3h开始给药，每天灌胃给药一次，连续给药15天，首次给药剂量为维持量的3倍，给药容积为0.5ml/100g体重。

实验过程中观察并记录动物的死亡情况(死亡前症状和死亡数)。

渔线的制备：将一长40mm，直径0.26mm的渔线的一端用记号笔标记，在距离此标记端18mm处用记号笔再做一标记，置于生理盐水中备用。

于末次给药后0.5h，参照神经功能缺陷评分法(18分标准^[2])对各组大鼠进行评分，标准如试验1.1。上述指标测定后，断头处死大鼠，取出全脑称重。迅速置于-20℃速冻10-15min，至鼠脑变硬时，从额极2mm开始，做冠状均切五刀，后方至大脑与后脑交界处，切成2mm厚的六片后迅速将脑片置5ml含有1％TTC的磷酸缓冲溶液中，避光温孵30分钟，在温孵过程中每隔7～8分钟翻动一次，温孵30分钟后取出脑片，用数码相机拍照输入电脑，之后用Imageproplus计算苍白区(梗塞区)和非苍白区(正常区)体积，计算梗塞百分比如下^[3]：

脑梗死体积百分比＝{[总梗死体积-(右半脑体积-左半脑体积)]/左半脑体积}×100％。

将染色后的脑组织置于110℃烘箱烘干，对照大脑湿重求出脑含水量如下：

脑组织含水量(％)＝(1-脑组织干重/脑组织湿重)×100％

表9对永性脑缺血大鼠死亡率的影响

各组死亡率如上表所示。随银灵通剂量升高，大鼠死亡率呈逐渐降低趋势。

表10对永久性脑缺血大鼠神经行为、脑梗塞率和脑含水量的影响

^#p<0.05，^##p<0.01模型对照组vs.伪手术组；*p<0.05，**p<0.01vs.模型对照组；^ap<0.05，^aap<0.01vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01vs.阿司匹林组

由表10可见，与伪手术组比较，模型组脑组织含水量显著性性升高(p<0.05)，其他各组脑组织含水量与伪手术组相比均无显著性差异(p>0.05)；

与模型组相比，银杏叶片组、阿司匹林、复方银灵通高剂量组神经行为学评分极显著性升高(p<0.01)，复方银灵通中剂量组神经行为学评分显著性升高(p<0.05)，银杏叶片、阿司匹林、复方银灵通高、中剂量组均能极显著性降低脑梗塞百分比(p<0.01)，银杏叶片组、复方银灵通高剂量组能显著性降低脑组织含水量(p<0.05)，其他各组与模型组相比均无显著性差异(p>0.05)。

与银杏叶片组相比，阿司匹林组、银灵通高剂量组脑梗塞百分比极显著性降低(p<0.01)；与阿司匹林组相比，银灵通高、中、低剂量组脑梗塞百分比均极显著性升高(p<0.01)；银灵通其他各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异(p>0.05)。

2.2对死亡率、学习记忆功能、脑血流量和脑组织学的影响

另取雄性SD大鼠105只，造模及给药方法同上。实验过程中观察并记录动物的死亡情况(死亡前症状和死亡数)。采用Y型迷宫测定大鼠学习和记忆功能，具体方法同1.2，学习成绩以达到连续10次电击有9次正确所受的累计电击次数来表示(给药第14d)；24h后(末次给药后1h)，连续电击10次，以其中正确反应次数作为记忆成绩，接着用激光多谱勒探头测定局部脑血流量。

然后断头处死，取出损伤侧脑于10％甲醛溶液中固定，由病理专业人员制片，HE染色，并阅片，观察大脑皮质海马区细胞形态学改变，根据病变程度分别记为：“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”。

表11对永性脑缺血大鼠死亡率的影响

各组死亡率如上表所示。随银灵通剂量升高，大鼠死亡率呈逐渐降低趋势。

表12对永久性脑缺血大鼠学习记忆功能的影响

^#p<0.05，^##p<0.01模型对照组vs.伪手术组；*p<0.05，**p<0.01vs.模型对照组；^ap<0.05，^aap<0.01银vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01vs.阿司匹林组

由表12可见，与伪手术组相比，模型组累计电击次数和正确反应次数均极显著性增加(p<0.01)，银灵通低剂量组累计电击次数极显著性增加(p<0.01)；与模型组相比，阳性药1银杏叶片、阳性药2阿司匹林、银灵通高剂量和中剂量组累计电击次数均显著性减少(p<0.05)，银杏叶片组、阿司匹林、银灵通中剂量组能显著性增加正确反应次数(p<0.05)，银灵通高剂量组能极显著性增加正确反应次数(p<0.01)，其他各组比较无显著性差异(p>0.05)。银灵通各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异(p>0.05)。

表13对永性脑缺血大鼠局部脑血流量的影响

^#p<0.05，^##p<0.01模型对照组vs.伪手术组；*p<0.05，**p<0.01vs.模型对照组；^ap<0.05，^aap<0.01vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01vs.阿司匹林组

由表13可见，模型对照组与伪手术组相比，模型对照组局部脑血流量极显著性降低(p<0.01)。与模型对照组相比，阿司匹林、复方银灵通高剂量组15d后局部脑血流量均极显著性升高(p<0.01)；银杏叶片组和银灵通中剂量组局部脑血流量显著性升高(p<0.05)；其他各组与模型组相比没有明显差别(p＞0.05)。

与阿司匹林组相比，银灵通低剂量组局部脑血流量极显著性降低(p<0.01)；银灵通其他各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异(p>0.05)。

对脑组织病理学的影响

标本分为7组，分别为伪手术组、模型组、复方银灵通胶囊高、中和低剂量组、阳性药1组和阳性药2组，每组8例。检测结果如下所述：

伪手术组：大部分例大脑皮质层和海马区结构清楚，完整，神经细胞排列整齐，细胞核膜清楚，核仁明显，染色质丰富，7号和8号大脑皮质浅层见局灶性的轻微的梗死，梗死区嗜伊红淡染，细胞形态尚正常。

模型组：右侧大脑皮质结构紊乱，见不同程度的梗死区，梗死区嗜伊红淡染，部分梗死区中心神经元、神经胶质细胞和神经纤维坏死，结构破坏，组织结构疏松呈筛网状，部分梗死区细胞形态尚完好，组织结构疏松呈筛网状，个别的梗死灶周边有炎性细胞浸润。个别例动脉管壁坏死，管腔见血栓，管周见脑组织水肿，疏松，且有炎细胞浸润。

阳性药1银杏叶片组：与模型组大脑病理特点相似，大部分例右侧大脑皮质，1例右侧海马区脑组织结构紊乱，见不同程度的梗死区，梗死区嗜伊红淡染，部分梗死区中心神经元、神经胶质细胞和神经纤维坏死，结构破坏，组织结构疏松呈筛网状，部分梗死区细胞形态尚完好，组织结构疏松呈筛网状，个别的梗死灶周边有炎性细胞浸润。部分例动脉管壁出血、坏死且炎细胞浸润，管腔见大的血栓，管周见脑组织水肿，疏松，且有炎细胞浸润。

阳性药2阿司匹林组：阳性药2组大脑与模型组大脑病理特点相似，只是程度较轻，4例右侧大脑皮质和1例海马区见程度较轻的梗死区，梗死区嗜伊红淡染，组织结构疏松，个别的梗死灶周边有炎性细胞浸润。部分例动脉壁出血、坏死，管壁和管周炎细胞浸润，2例管腔见血栓。

复方银灵通胶囊高剂量组：高剂量组大脑与模型组大脑病理特点相似，6例右侧大脑皮质和2例海马区见程度较轻的梗死区，梗死区嗜伊红淡染，组织结构疏松，个别的梗死灶周边有炎性细胞浸润。部分例动脉管壁坏死，管周见脑组织水肿，疏松，且有炎细胞浸润。

复方银灵通胶囊中剂量组：低剂量组大脑与模型组大脑病理特点相似，大部分例右侧大脑皮质和海马区见程度较轻的梗死区，梗死区嗜伊红淡染，组织结构疏松，个别的梗死灶周边有炎性细胞浸润。部分例动脉壁出血、坏死，管壁和管周炎细胞浸润。

复方银灵通胶囊低剂量组：大部分例右侧大脑皮质结构紊乱，见不同程度的梗死区，梗死区嗜伊红淡染，部分梗死区中心神经元、神经胶质细胞和神经纤维坏死，结构破坏，组织结构疏松呈筛网状，部分梗死区细胞形态尚完好，组织结构疏松呈筛网状，个别的梗死灶周边有炎性细胞浸润。个别例动脉管壁及管周见出血，炎细胞浸润。

脑切片病理学染色结果显示，与伪手术组比较，模型组大脑见明显的梗死区。各组梗死病变均分由高到低如下：模型组>低剂量组>银杏叶片组>中剂量组>高剂量组>阿司匹林组>伪手术组。

3、复方银灵通胶囊对PAF、ADP诱导家兔血小板聚集功能的作用(体内实验)^[9]

3.1组别与剂量

取雄性新西兰家兔48只，体重2～2.5kg，按随机分为6组，每组8只。分别为复方银灵通胶囊3个剂量组，分别为：0.6g/kg(0.6g/ml)，0.3g/kg(0.3g/ml)，0.15g/kg(0.15g/ml)。阳性对照药1银杏叶片组2mg/kg(2mg/ml)，阳性对照药2阿司匹林组15mg/kg(15mg/ml)和阴性对照组给予等容积的0.5％CMC-Na，给药容积为1ml/kg。每天灌胃(ig)给药一次，连续给药7天，首次给药剂量为维持量的3倍，

3.2取血

末次给药后1h，将家兔仰卧位固定于家兔手术台上剪去颈部兔毛，皮下注射1％盐酸普鲁卡因注射液局部浸润麻醉。剪开颈部皮肤约3cm，用止血钳进行钝性分离，暴露支气管后分离出颈总动脉。细线结扎颈总动脉远心端，再用动脉夹夹闭近心端，进行血管插管后固定。然后打开动脉夹，将血液放入含有3.8％柠檬酸钠的试管中，使血液与3.8％柠檬酸钠容积之比为9:1。

3.3制备富血小板血浆(RPR)和贫血小板血浆(PPP)

将上述制备的抗凝血液混匀后，500rpm离心10min后吸取上层血浆即得PRP；将剩余血液3500rpm离心10min后吸取上层血浆即得PPP。

3.4测定血小板聚集率^[11]

先取300μlPPP加入测试杯中，然后放入测试孔，按“PPP”键进行定标。然后取270μlPRP加入测试杯中，在37℃预温槽中预热3min后放入测试孔，按“开始”键时立即加入诱导剂30μl(两种诱导剂的浓度分别为PAF7.072μmol/L、ADP300mmol/L)，以测定最大聚集率。每次测定4个通道，以求得平均最大聚集率。

按下列公式计算血小板聚集抑制率：

3.5结果

3.5.1复方银灵通胶囊对PAF诱导家兔体外血小板聚集率的影响

表14体内给复方银灵通胶囊对PAF诱导家兔体外血小板聚集率的影响

^*p<0.05，^**p<0.01vs.空白对照组；^ap<0.05，^aap<0.01vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01vs.阿司匹林组

由表14可见，与空白对照组相比，银杏叶片组能显著性抑制家兔体外血小板聚集(p<0.05)，银灵通高、中、低三个剂量组对PAF诱导的家兔血小板聚集有抑制作用，并随剂量升高，其聚集抑制率呈剂量依赖性升高，其中银灵通高剂量组最大血小板聚集率与空白对照组比较有显著性差异(p<0.05)，阿司匹林组与空白对照组比较无显著性差异(p>0.05)。

3.5.2复方银灵通胶囊对ADP诱导家兔体外血小板聚集率的影响

表15体内给复方银灵通胶囊对ADP诱导家兔体外血小板聚集率的影响

*p<0.05，**p<0.01vs.空白对照组；^ap<0.05，^aap<0.01vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01vs.阿司匹林组

由表15可见，与空白对照组相比，银杏叶片组和阿司匹林组均能显著性抑制ADP诱导的家兔体外血小板聚集(p<0.05)，银灵通高、中、低三个剂量组对ADP诱导的家兔血小板聚集有抑制作用，并随剂量升高，其聚集抑制率呈剂量依赖性升高，其中银灵通高剂量组最大血小板聚集率与空白对照组比较有极显著性差异(p<0.01)，银灵通中剂量组与空白对照组相比有显著性差异(p<0.05)。

与阿司匹林组相比，银灵通高剂量组能显著性抑制ADP诱导的家兔体外血小板聚集(p<0.05)；银灵通其他各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异(p>0.05)。

4、复方银灵通胶囊对血栓形成的抑制作用

4.1对大鼠颈动-静脉旁路丝线上血栓形成的影响

取雄性SD大鼠60只，体重250～280g，将动物随机分为6组，每组10只，复方银灵通胶囊3个剂量组，分别为：1.2g/kg(0.24g/ml)，0.6g/kg(0.12g/ml)，0.3g/kg(0.06g/ml)。阳性对照药银杏叶片组4mg/kg(0.8mg/ml)，阳性对照药2阿司匹林组30mg/kg(6mg/ml)。阴性对照组(给以等容积的0.5％CMC-Na)。各组大鼠每日灌胃给药1次，连续给药7日，给药容积为0.5ml/100g。

末次给药后1h，大鼠用3％水合氯醛溶液1ml/100gip麻醉，分离右颈总动脉及左颈外静脉。在三段聚乙烯管中放入一根长约6cm的4号手术丝线。将生理盐水充满聚乙烯管腔。先将管的一端插入左颈外静脉后，将管的另一端插入右颈总动脉。手术完成后开放血流，则血液从右颈总动脉流经聚乙烯管，返回颈外静脉。开放血流15min后中断血流。迅速取出带血块丝线称重得总重量，总重量减去丝线重即为血栓湿重。将丝线70℃烘干，取出称重，总重量减去丝线重即为血栓干重。按下列公式计算抑制率^[12,13]：

结果如下表所示。

表16银灵通胶囊对大鼠颈动－静脉旁路丝线上血栓形成的影响

*p<0.05**p<0.01与空白对照组比较；^ap<0.05，^aap<0.01vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01vs.阿司匹林组

由表16可见，与阴性对照组相比，银杏叶片、银灵通中、低剂量组能显著性降低血栓湿重(p<0.05)，阿司匹林组、银灵通高剂量组能极显著性降低血栓湿重(p<0.01)，银灵通高、中、低剂量对血栓湿重抑制率呈逐渐降低的趋势；银杏叶片、阿司匹林、银灵通高剂量组均能极显著性降低血栓干重(p<0.01)，银灵通中、低剂量能显著性降低血栓干重(p<0.05)，银灵通高、中、低剂量对血栓干重抑制率呈逐渐降低的趋势。

与阿司匹林组相比，银灵通中、低剂量组血栓干重均显著性增加(p<0.05)；银灵通其他各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异(p>0.05)。

4.2对ADP致小鼠肺血栓形成的影响^[14,15]

取健康ICR小鼠60只，雌雄各半，体重19～22g，随机均分为5组，每组10只：复方银灵通胶囊3个剂量组，分别为：2.4g/kg(0.12g/ml)，1.2g/kg(0.06g/ml)，0.6g/kg(0.03g/ml)。阳性对照药1银杏叶片组8mg/kg(0.4mg/ml)，阳性对照药2阿司匹林组60mg/kg(3mg/ml)。阴性对照组(给以等容积的0.5％CMC-Na)。各组每日灌胃给药1次，连续给药7日，给药容积为0.4ml/20g。末次给药后1h，按200mg/kg尾静脉注射ADP，形成急性肺血栓(小鼠呼吸喘促、不能自主活动)，记录注射ADP后至小鼠恢复自主活动的时间。

表17银灵通胶囊对ADP诱发小鼠急性肺血栓形成的影响

*p<0.05**p<0.01与空白对照组比较；^ap<0.05，^aap<0.01银灵通组vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01银灵通组vs.阿司匹林组

由表17可见，与阴性对照组相比，银杏叶片组能极显著性缩短ADP致小鼠肺栓塞恢复自主活动时间(p<0.01)，银灵通高、中、低剂量均能显著性缩短ADP致小鼠肺栓塞恢复自主活动时间(p<0.05)。

与银杏叶片组相比，银灵通高剂量组恢复自主活动时间显著性延长(p<0.05)，银灵通中、低剂量组恢复自主活动时间极显著性延长(p<0.01)；银灵通其他各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异(p>0.05)。

5、复方银灵通胶囊对小鼠出血时间和凝血时间的影响

5.1对小鼠出血时间的影响

取健康ICR小鼠60只，雌雄各半，体重19～22g，随机均分为6组，每组10只：复方银灵通胶囊3个剂量组，分别为：2.4g/kg(0.12g/ml)，1.2g/kg(0.06g/ml)，0.6g/kg(0.03g/ml)。阳性对照药1银杏叶片组8mg/kg(0.4mg/ml)，阳性对照药2阿司匹林组60mg/kg(3mg/ml)。阴性对照组(给以等容积的0.5％CMC-Na)。各组大鼠每日灌胃给药1次，连续给药7日，给药容积为0.4ml/20g。

末次给药1h后，将小鼠固定，以毫米尺测量鼠尾长度并标记，然后分别以利剪在小鼠尾尖3mm处横断，待血液自行溢出，开始计时，每隔30s用滤纸吸去血滴1次，直至血液自然停止(滤纸吸时无血)为止，即为出血时间^[16]。

表18复方银灵通胶囊对小鼠断尾后出血时间的影响

*p<0.05**p<0.01vs.空白对照组；^ap<0.05，^aap<0.01vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01vs.阿司匹林组

由表18可见，与阴性对照组相比，阿司匹林组小鼠断尾后出血时间极显著性延长(p<0.01)，银杏叶片、银灵通高剂量、中剂量组出血时间显著性延长(p<0.05)，其他组别与阴性对照组相比无显著性差异(p>0.05)。

与阿司匹林组相比，银灵通中、低剂量组出血时间显著性缩短(p<0.05)；银灵通其他各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异(p>0.05)。

5.2对小鼠凝血时间的影响

取健康ICR小鼠60只，雌雄各半，体重19～22g，随机均分为5组，每组10只：复方银灵通胶囊3个剂量组，分别为：2.4g/kg(0.12g/ml)，1.2g/kg(0.06g/ml)，0.6g/kg(0.03g/ml)。阳性对照药1银杏叶片片组8mg/kg(0.4mg/ml)，阳性对照药2阿司匹林组60mg/kg(3mg/ml)。阴性对照组(给以等容积的0.5％CMC-Na)。各组每日灌胃给药1次，连续给药7日，给药容积为0.4ml/20g。

末次给药1h后，用毛细玻管自眼内眦插入，即有血液流出，并滴于载玻片上。每隔15s用大头针自血液边缘向里轻轻拨动，观察有无血丝挑起。从采血开始到挑起血丝止，所用时间即凝血时间^[17,18]。

表19复方银灵通胶囊对小鼠凝血时间的影响

*p<0.05**p<0.01vs.空白对照组；^ap<0.05，^aap<0.01vs.银杏叶片组；^bp<0.05，^bbp<0.01vs.阿司匹林组

由表19可见，与阴性对照组相比，阿司匹林组能极显著性延长小鼠凝血时间(p<0.01)，银灵通高剂量组能显著性延长小鼠凝血时间(p<0.05)，其他各组与阴性对照组相比均无显著性差异(p>0.05)。

银灵通各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异(p>0.05)。

6、复方银灵通胶囊含药血清预防给药对体外培养皮层神经元的保护作用-机理研究

6.1大鼠含药血清制备^[19,20]

SD大鼠24只，250g-300g，按体重随机分为阳性药1银杏叶片组26.7mg/kg、阳性药2阿司匹林组200mg/kg、银灵通组4g/kg，空白对照组，每组6只，灌胃给药，给药体积为1ml/100g，空白对照组给予等体积的0.5％CMC-Na，每天给药两次，连续给药4天。最后一次给药后1h，无菌颈总动脉取血，取血后室温静置2h，3000rpm离心20min，取上清液，将同组血清混合，56℃灭活30min，超净台过滤除菌，分装保存于-80℃备用^[21]。

6.2皮层神经元细胞原代培养

根据ChoiDW的方法略加改进，进行大鼠原代皮层神经元培养。取怀孕15-18天的SD大鼠1只^[22]，水合氯醛麻醉。用75％乙醇对母鼠腹部消毒，剪开腹腔，将胎鼠取出先放入75％乙醇中短暂浸泡消毒，再放入预冷的PBS中。在超净台中剪下胎鼠的头颅(从耳后剪)，放入预冷的PBS中，将大脑全部取出放入预冷的PBS中。然后，将大脑皮层取下，去除脑膜，将皮层剪碎后转移至离心管中。加入胰酶于37℃消化10分钟，每5分钟进行吹打混匀。加入胎牛血清终止消化，然后继续吹打，再加入10％MEM培养基(每500mLMEM中含胎牛血清50mL)吹打重悬。然后用100目筛网过滤，再用400目筛网过滤，转移滤液到干净离心管中离心(1000rpm)5分钟。离心后弃去上清液，加入10％培养基吹打重悬。倒置显微镜下计数，按照细胞密度1×10⁶个/mL将细胞接种于预先用细胞粘附剂处理过夜的无菌培养板中，置于37℃，CO₂浓度为5％的无菌培养箱中孵育约4h，于显微镜下观察待细胞充分贴壁后，将10％MEM培养基换成神经元专用的维持培养基(NeurobasalMedia49mL+B27-Supplement1mL)^[23]。待细胞呈现神经元的形态即可用于实验^[24,25]。

6.3实验模型制备方法

6.3.1连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)合并缺糖致皮层神经元细胞缺氧缺糖损伤模型(预防给药)

参照文献，稍加改进^[26]，在无糖EBSS溶液中加入终浓度为10mM的连亚二硫酸钠(Na₂S₂O₄)干粉充分溶解，用NaHCO₃调pH为7.2，即为缺氧溶液。此溶液需现用现配，为了消除Na₂S₂O₄在水中分解产物的影响，除设空白对照组(对照组1)外，另设一非低氧溶液对照组(对照组2)，非低氧溶液的配制是预先配制100mM的缺氧Na₂S₂O₄储备液，用时将储备液(3天以上)稀释至10mM，即为10mMNa₂S₂O₄常氧溶液。

设空白对照组(加入占总体积15％的空白对照组血清)、非低氧溶液对照组(加入占总体积15％的空白对照组血清)、模型对照组(加入占总体积15％的空白对照组血清)、阳性对照1银杏叶片组(加入占总体积15％的银杏叶片组含药血清)、阳性对照2阿司匹林组(加入占总体积15％的阿司匹林组含药血清)和复方银灵通胶囊高(加入占总体积15％的银灵通含药血清)、中(加入占总体积10％的银灵通含药血清+5％空白对照组血清)、低(加入占总体积5％的银灵通含药血清+10％空白对照组血清)剂量组，每个剂量设3个复孔，实验重复3次(MTT设6个复孔，实验重复3次)。取培养于24孔板生长良好的皮层神经元细胞用于试验，加入各组血清，作用24h，弃去原液，用含糖的EBSS溶液轻轻荡洗两遍，换成含有终浓度为10mM的Na₂S₂O₄的无糖EBSS溶液培养1h(空白对照组加入含糖的EBSS)，同时用医用胶布将板四周封住，孵育1h后换去缺氧培养液，用含糖的EBSS溶液轻轻荡洗两次，换成正常含B-27supplement的Neurobasal培养液，置37℃、5％CO₂培养箱内继续培养24h，形成缺氧/复氧损伤模型。

6.3.2血小板活化因子(PAF)致皮层神经元细胞损伤模型(预防给药)^[27]

将皮层神经元细胞以1×10⁶个/mL密度接种于24孔，置37℃，5％CO₂培养箱中孵育。每孔设空白对照组(加入占总体积15％的空白对照组血清)、非低氧溶液对照组(加入占总体积15％的空白对照组血清)、模型对照组(加入占总体积15％的空白对照组血清)、阳性对照1银杏叶片组(加入占总体积15％的银杏叶片组含药血清)、阳性对照2阿司匹林组(加入占总体积15％的阿司匹林组含药血清)和复方银灵通胶囊高(加入占总体积15％的银灵通含药血清)、中(加入占总体积10％的银灵通含药血清+5％空白对照组血清)、低(加入占总体积5％的银灵通含药血清+10％空白对照组血清)剂量组，24孔板每个剂量设3个复孔，实验重复3次。取培养第三天的皮层神经元细胞用于试验，弃去原培养液，用PBS轻轻荡洗两次，加入各组血清培养24h后，弃去原培养液，用PBS轻轻荡洗两次，加入新鲜培养液及终浓度为4×10^-5M的PAF，置37℃、5％CO₂培养箱内继续培养48h。

6.4指标观察测定

细胞形态学观察，MTT法测定细胞活力，LDH释放测定，LD含量测定，SOD活力测定，MDA含量测定均按照常规方法。

6.5实验结果

6.5.1复方银灵通胶囊含药血清预防给药对连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)合并缺糖致皮层神

经元细胞缺氧缺糖损伤模型的影响

细胞形态学观察：皮层神经元细胞经Na₂S₂O₄处理约24h后,倒置显微镜下观察：正常对照组细胞形态细长、透明度高、光泽较好；模型组细胞损伤明显。损伤的皮层神经元细胞与正常细胞相比，细胞突起消失，肿胀，折光度减弱胞，胞质圆缩、脱落。加入银杏叶片、阿司匹林、复方银灵通含药血清进行预保护的细胞与损伤细胞相比则形态明显改善，较多细胞保留突起结构，肿胀细胞减少，而且细胞有光泽。

MTT法测定细胞活力

表20银灵通含药血清预防给药对Na₂S₂O₄造模后细胞存活率的影响

^cp<0.05^ccp<0.01非低氧对照组与空白对照组比较；^▲p<0.05^▲▲p<0.01模型对照组与非低氧对照组比较；^#p<0.05^##p<0.01模型对照组与空白对照组比较；*p<0.05**p<0.01与模型对照组比

较；^ap<0.05，^aap<0.01与银杏叶片组比较；^bp<0.05，^bbp<0.01与阿司匹林组比较。

由表20可见，与模型对照组相比，银杏叶片组、阿司匹林组、银灵通高、中剂量组含药血清均能极显著性提高细胞存活率(p<0.01)，银灵通含药血清对Na₂S₂O₄合并缺糖造成的皮层神经元细胞损伤模型OD_570nm的保护作用随含药血清浓度的增加而增强。

银灵通各剂量组与阳性药组比较均无显著性差异(p>0.05)。

LDH漏出率测定细胞损伤程度

表21银灵通含药血清预防给药对Na₂S₂O₄造模后细胞LDH漏出率的影响

^cp<0.05^ccp<0.01非低氧对照组与空白对照组比较；^▲p<0.05^▲▲p<0.01模型对照组与非低氧对照组比较；^#p<0.05^##p<0.01模型对照组与空白对照组比较；*p<0.05**p<0.01与模型对照组比

较；^ap<0.05，^aap<0.01与银杏叶片组比较；^bp<0.05，^bbp<0.01与阿司匹林组比较。

由表21可见，与模型对照组相比，银杏叶片组、银灵通高剂量组LDH漏出率均极显著性降低(p<0.01)，阿司匹林组、银灵通中剂量组LDH漏出率均显著性降低(p<0.05)；其他各组间比较无显著性差异(p>0.05)。

LD含量测定

表22银灵通含药血清预防给药对Na₂S₂O₄造模后细胞LD含量的影响

^cp<0.05^ccp<0.01非低氧对照组与空白对照组比较；^▲p<0.05^▲▲p<0.01模型对照组与非低氧对照组比较；^#p<0.05^##p<0.01模型对照组与空白对照组比较；*p<0.05**p<0.01与模型对照组比较；^ap<0.05，^aap<0.01与银杏叶片组比较；^bp<0.05，^bbp<0.01与阿司匹林组比较。

由表22可见，与模型对照组相比，银杏叶片组及银灵通高剂量组LD含量极显著性降低(p<0.01)，阿司匹林组及银灵通中剂量组LD含量显著性降低(p<0.05)；与银杏叶片组相比，银灵通中、低剂量组LD含量极显著性升高(p<0.01)，阿司匹林组LD含量显著性升高(p<0.05)；与阿司匹林组相比，银灵通高剂量组LD含量极显著性降低(p<0.01)；其他各组间比较无显著性差异(p>0.05)。

SOD活力测定

表23银灵通含药血清预防给药对Na₂S₂O₄造模后细胞SOD活力的影响

^cp<0.05^ccp<0.01非低氧对照组与空白对照组比较；^▲p<0.05^▲▲p<0.01模型对照组与非低氧对照组比较；^#p<0.05^##p<0.01模型对照组与空白对照组比较；*p<0.05**p<0.01与模型对照组比较；^ap<0.05，^aap<0.01与银杏叶片组比较；^bp<0.05，^bbp<0.01与阿司匹林组比较。

由表23可见，与模型对照组相比，银杏叶片组、银灵通高剂量组SOD活力极显著性升高(p<0.01)，阿司匹林组、银灵通中剂量组SOD活力显著性升高(p<0.05)；与银杏叶片组相比，银灵通中、低剂量组SOD活力显著性降低(p<0.05)；其他各组间比较无显著性差异(p>0.05)。

MDA含量测定

表24银灵通含药血清预防给药对Na₂S₂O₄造模后细胞MDA含量的影响

^cp<0.05^ccp<0.01非低氧对照组与空白对照组比较；^▲p<0.05^▲▲p<0.01模型对照组与非低氧对照组比较；^#p<0.05^##p<0.01模型对照组与空白对照组比较；*p<0.05**p<0.01与模型对照组比较；^ap<0.05，^aap<0.01与银杏叶片组比较；^bp<0.05，^bbp<0.01与阿司匹林组比较。

由表24可知，与模型对照组相比，银杏叶片组、银灵通高剂量组MDA活力均极显著性降低(p<0.01)，阿司匹林组、银灵通中剂量组MDA活力均显著性降低(p<0.05)；与银杏叶片组相比，银灵通低剂量组MDA活力极显著性升高(p<0.01)；与阿司匹林组相比，银灵通低剂量组MDA活力显著性升高(p<0.05)；其他各组间比较无显著性差异(p>0.05)。

6.5.2复方银灵通胶囊含药血清预防给药对血小板活化因子(PAF)致皮层神经元细胞氧化应激损伤模型的影响

细胞形态学观察

皮层神经元经PAF处理约48h后,倒置显微镜(10×10倍)下观察：正常对照组细胞形态细长、透明度高、光泽较好；模型组细胞损伤明显。损伤的皮层神经元细胞与正常细胞相比，细胞突起消失，肿胀，折光度减弱胞，胞质圆缩、脱落。加入银杏叶片、阿司匹林、复方银灵通含药血清进行预保护的细胞与损伤细胞相比则形态明显改善，较多细胞保留突起结构，肿胀细胞减少，而且细胞有光泽。

MTT法测定细胞活力

表25银灵通含药血清预防给药对PAF造模后细胞存活率的影响

^#p<0.05^##p<0.01模型对照组与空白对照组比较；*p<0.05**p<0.01与模型对照组比较；^ap<0.05，^aap<0.01与银杏叶片组比较；^bp<0.05，^bbp<0.01与阿司匹林组比较。

由表25可见，与模型对照组相比，银杏叶片组、银灵通高、中剂量组细胞存活率均极显著性升高(p<0.01)，阿司匹林组细胞存活率显著性升高(p<0.05)；与银杏叶片组相比，银灵通低剂量组细胞存活率显著性降低(p<0.05)；其他各组间比较无显著性差异(p>0.05)。

LDH释放测定

表26银灵通含药血清预防给药对PAF造模后细胞LDH漏出率的影响

^#p<0.05^##p<0.01模型对照组与空白对照组比较；*p<0.05**p<0.01与模型对照组比较；^ap<0.05，^aap<0.01与银杏叶片组比较；^bp<0.05，^bbp<0.01与阿司匹林组比较。

由表26可见，与模型对照组相比，银灵通高剂量组LDH漏出率极显著性减少(p<0.01)，银杏叶片组、银灵通中剂量组LDH漏出率显著性减少(p<0.05)；其他各组间比较无显著性差异(p>0.05)。

LD含量测定

表27银灵通含药血清预防给药对PAF造模后细胞LD含量的影响

^#p<0.05^##p<0.01模型对照组与空白对照组比较；*p<0.05**p<0.01与模型对照组比较；^ap<0.05，^aap<0.01与银杏叶片组比较；^bp<0.05，^bbp<0.01与阿司匹林组比较。

由表27可见，与模型对照组相比，银杏叶片组、银灵通高剂量组细胞LD含量极显著性降低(p<0.01)，银灵通中剂量在细胞LD含量显著性降低(p<0.05)；其他各组间比较无显著性差异(p>0.05)。

SOD活力测定

表28银灵通含药血清预防给药对PAF造模后细胞SOD活力的影响

^#p<0.05^##p<0.01模型对照组与空白对照组比较；*p<0.05**p<0.01与模型对照组比较；^ap<0.05，^aap<0.01与银杏叶片组比较；^bp<0.05，^bbp<0.01与阿司匹林组比较。

由表28可见，与模型组相比，银杏叶片组、银灵通高剂量组SOD活力极显著性升高(p<0.01)，阿司匹林组、银灵通中剂量组SOD活力显著性升高(p<0.05)；与银杏叶片组相比，银灵通低剂量组SOD活力极显著性降低(p<0.01)；与阿司匹林组相比，银灵通低剂量组SOD活力显著性降低(p<0.05)；其他各组间比较无显著性差异(p>0.05)。

MDA含量测定

表29银灵通含药血清预防给药对PAF造模后细胞MDA含量的影响

^#p<0.05^##p<0.01模型对照组与空白对照组比较；*p<0.05**p<0.01与模型对照组比较；^ap<0.05，^aap<0.01与银杏叶片组比较；^bp<0.05，^bbp<0.01与阿司匹林组比较。

由表29可见，与模型对照组相比，银杏叶片组、银灵通高剂量组MDA活力显著性降低(p<0.05)；其他各组间比较无显著性差异(p>0.05)。

7、复方银灵通胶囊含药血清治疗给药对体外培养皮层神经元的保护作用-机理研究

7.1大鼠含药血清制备

同6.1。

7.2皮层神经元细胞原代培养

同6.2。

7.3实验模型制备方法

7.3.1连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)合并缺糖致皮层神经元细胞缺氧缺糖损伤模型(治疗给药)^[26]

参照文献，在无糖EBSS溶液中加入终浓度为10mM的连亚二硫酸钠(Na₂S₂O₄)干粉充分溶解，用NaHCO₃调pH为7.2，即为缺氧溶液。

取培养于24孔板生长良好的皮层神经元细胞用于试验，弃去原培养液，用含糖的EBSS溶液轻轻荡洗两遍，换成含有终浓度为10mM的Na₂S₂O₄的无糖EBSS溶液(空白对照组加入含糖的EBSS)，同时用医用胶布将板四周封住，孵育1h后换去缺氧培养液，用含糖的EBSS溶液轻轻荡洗两次，换成正常含B-27的Neurobasal培养液，同时加入各组血清，置37℃、5％CO₂培养箱内继续培养24h。空白对照组(Control)加入占总体积10％的空白对照组血清、模型对照组(Vehicle)加入占总体积15％的空白对照组血清、复方银灵通胶囊高剂量组(银灵通-H)加入占总体积15％的银灵通含药血清、中剂量组(银灵通-M)加入占总体积10％的银灵通含药血清+5％空白对照组血清、低剂量组(银灵通-L)加入占总体积5％的银灵通含药血清+10％空白对照组血清，阳性对照银杏叶片组(银杏叶片)加入占总体积15％的银杏叶片组含药血清，阿司匹林组(ASP)加入占总体积15％的阿司匹林含药血清，每个组别设3个复孔，实验重复3次。

观察指标测定：

MTT法测定细胞活力，LDH释放及SOD、MDA活力测定均按照常规方法。

7.3.2血小板活化因子(PAF)致皮层神经元细胞损伤模型^[27]

取培养于24孔板生长良好的皮层神经元细胞用于试验，弃去原培养液，用PBS轻轻荡洗两次，加入新鲜培养液及终浓度为4×10^-5M的PAF，置37℃、5％CO2培养箱内继续培养。3h后加入各组含药血清。设空白对照组(加入占总体积15％的空白对照组血清)、模型对照组(加入占总体积15％的空白对照组血清)和复方银灵通胶囊高(加入占总体积15％的银灵通含药血清)、中(加入占总体积10％的银灵通含药血清+5％空白对照组血清)、低(加入占总体积5％的银灵通含药血清+10％空白对照组血清)剂量组，阳性对照银杏叶片组(加入占总体积15％的银杏叶片组含药血清)，置37℃、5％CO2培养箱内继续培养24h，每个剂量设3个复孔，实验重复3次。

指标观察测定：

MTT法测定细胞活力：LDH释放及SOD、MDA活力测定均按照常规方法。

对PAF诱导的体外神经元损伤NF-κB信号转导通路的研究：

采用6孔板进行神经元培养，PAF造模结束加入含药血清24h后，用PBS荡洗细胞培养板两次，加入适量0.125％胰酶边消化边用移液枪吹打至下层细胞漂浮，加入微量胎牛血清终止消化，同组合并转移至1.5ml离心管中，2000rpm离心10min，倒掉消化液保留下层细胞，加适量RIPA裂解液(含PMSF1mM)涡旋混匀，然后于冰浴中裂解30min，每隔5min涡旋混匀，4℃，12000rpm离心5min，分离出上清，BCA法进行蛋白定量，测定上清液体积，加入5×SDS上样缓冲液后沸水煮沸5min，分装后于-80℃保存。配制4％浓度聚丙烯酰胺浓缩胶和10％浓度聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)分离胶进行电泳，按20μg蛋白的溶液体积上样。待所需目的蛋白处MARK充分分离后停止电泳。参照MARK的分子量指示，切割出含目的蛋白的PAGE胶，与预先用甲醇活化的PVDF膜一起做成“三明治”形状，其排列依次为：海绵/滤纸/胶/膜/滤纸/海绵。湿法转膜，在100mA恒流下进行电转2小时。转膜结束后，取下PVDF膜，封闭液封闭1h以消除非特异背景。TBST洗掉封闭液，一抗4℃孵育过夜。用TBST室温下荡洗三次，每次10min。二抗室温下孵育2h后，TBST荡洗三次，每次10min。滴加适量Ecl显色液，用凝胶成像仪对膜进行曝光拍照，用Quantityone图像处理软件分析目标条带的净光密度值。实验重复三次。

7.4实验结果

7.4.1复方银灵通胶囊含药血清治疗给药对连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)合并缺糖致皮层神经元细胞缺氧缺糖损伤模型的影响

表30银灵通治疗给药对连二亚硫酸钠所致的神经元损伤中细胞存活率的影响(平均值±s.d.，n＝3)

#p<0.05，##p<0.01模型对照与空白对照组比较；*p<0.05,**p<0.01与模型对照组比较。

皮层神经元细胞经Na₂S₂O₄处理后加入含药血清约24h后,倒置显微镜下观察：正常对照组细胞形态细长、透明度高、光泽较好；模型组细胞损伤明显。损伤的皮层神经元细胞与正常细胞相比，细胞突起消失，肿胀，折光度减弱胞，胞质圆缩、脱落。加入复方银灵通含药血清的细胞与损伤细胞相比则形态明显改善，较多细胞保留突起结构，肿胀细胞减少，而且细胞有光泽。

由表30可见，与模型对照组相比，银灵通-H组和银杏叶片组都能对OGD造成的体外神经元损伤起到很好的保护作用(p<0.01)，银灵通-M也能显著性提高神经元在OGD后的存活率(p<0.05)。

表31银灵通治疗给药对连二亚硫酸钠所致神经元损伤中LDH漏出率、SOD及MDA活力的影响(平均值±s.d.，n＝3)

#p<0.05，##p<0.01模型对照与空白对照组比较；*p<0.05,**p<0.01与模型对照组比较。

由表31可见，与模型对照组相比，银灵通高剂量组能极显著性降低OGD造模后细胞上清液中LDH漏出率(p<0.01)，银灵通中剂量组能显著性降低LDH漏出率(p<0.05)。表明银灵通能很好地减轻OGD导致的细胞损伤。银灵通高剂量组能极显著性降低OGD导致的体外神经元MDA活力的增高，降低脂质过氧化损伤。

OGD造模后，SOD活力极显著性降低(p<0.01)，表明神经元的抗氧化系统遭到严重破坏，而银灵通高剂量组能显著性地升高神经元OGD损伤后SOD活力(p<0.05)，起到良好的抗氧化损伤作用。

表32银灵通治疗给药对PAF所诱导的体外神经元损伤中细胞存活率的影响(平均值±s.d.，n＝3)

#p<0.05，##p<0.01模型对照与空白对照组比较；*p<0.05,**p<0.01与模型对照组比较。

PAF造模后加入含药血清处理约24h后,倒置显微镜(10×10倍)下观察，正常对照组细胞形态细长、透明度高、光泽较好；模型组细胞损伤明显。损伤的皮层神经元细胞与正常细胞相比，细胞突起消失，肿胀，折光度减弱胞，胞质圆缩、脱落。加入复方银灵通含药血清进保护的细胞与损伤细胞相比则形态明显改善，较多细胞保留突起结构，肿胀细胞减少，而且细胞有光泽。由MTT结果可见，银灵通高剂量组细胞存活率极显著性升高(p<0.01)，银灵通中剂量组细胞存活率显著性升高(p<0.05)。

表33银灵通治疗给药对PAF所诱导的体外神经元损伤中LDH漏出率、SOD及MDA活力的影响(平均值±s.d.，n＝3)

#p<0.05，##p<0.01模型对照与空白对照组比较；*p<0.05,**p<0.01与模型对照组比较。

由表33可见，与模型对照组相比，银灵通高剂量组细胞上清中LDH漏出率显著性下降(p<0.05)，银灵通中剂量组LDH漏出率也显著性下降(p<0.05)。

由表33可见，与模型对照组相比，银灵通高剂量组、中剂量组、银杏叶片组MDA活力显著性降低(p<0.05)，银灵通高剂量组SOD活力极显著性升高(p<0.01)，银灵通中剂量组神经元SOD活力显著性升高(p<0.05)。

表34银灵通对PAF诱导的体外神经元损伤中NF-κB信号转导通路的影响(平均值±s.d.，n＝3)

#p<0.05，##p<0.01模型对照与空白对照组比较；*p<0.05,**p<0.01与模型对照组比较。

如表34可见，银灵通高剂量组能极显著性地抑制PAF诱导的p65和pp65表达的升高(p<0.01)，银灵通中剂量组也能起到显著的作用(p<0.05)。此外，银灵通还能抑制IκBα磷酸化蛋白的表达。由此可见，银灵通可通过阻止p65和IκBα的磷酸化来抑制PAF诱导的NF-κB信号通路的激活。

由表34可见，经PAF损伤后，体外神经元细胞Syn的表达量极显著性降低(p<0.01)，表明该条件下，神经元细胞遭受了非常严重的损伤。而银灵通对体外神经元Syn表达量的影响与体内结果一致，与模型对照组相比，银灵通高剂量组能极显著性增加Syn的表达量(p<0.01)，银灵通中剂量组也能极显著性地增加Syn的表达量(p<0.01)，对PAF诱导的体外神经元损伤起到很好的保护作用。

具体实施方式

实施例1

1、配方：

灵芝333g银杏叶333g淮牛膝278g

玄参278g石菖蒲167g天麻125g

2、制备方法：

(一)粉碎：将石菖蒲粉碎成颗粒，备用。

(二)CO₂超临界萃取：取石菖蒲颗粒于萃取釜中，CO₂超临界萃取，其中压力为30Mpa，萃取釜温度为60℃，萃取时间为1.5小时，得挥发油和石菖蒲萃余物，备用。

(三)挥发油包合：取挥发油用等体积的乙醇溶解，得挥发油乙醇溶液，备用；另取挥发油重量4倍量的β-环糊精，用β-环糊精4倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加上述挥发油乙醇溶液，碾磨包合20分钟，倾出，0-4℃冷藏静置24小时以上，滤过，于40℃真空干燥，即得挥发油包合物，备用；

(四)醇提：灵芝、银杏叶、淮牛膝、玄参和天麻、以及石菖蒲萃余物加入处方总药材8倍重量浓度为90％的乙醇，加热回流提取两次，每次1.5小时，提取液合并，静置，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至60℃条件下相对密度为1.15～1.30的清膏，测定干膏率，备用。

(五)混合干燥：将清膏与清膏重30-40％的微晶纤维素混合，置真空干燥箱60℃条件下减压干燥，得干膏备用。

(六)粉碎、混合、胶囊填充：将干膏、环糊精包合物置万能粉碎机中粉碎成细粉，与剩余微晶纤维素和干膏重0.5％的硬脂酸镁混合均匀，得细粉。其中，步骤五和步骤六共用微晶纤维素总量与清膏的重量比例为237.5：260。

(七)胶囊填充：取0号硬胶囊填充，装量：0.5g。

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