获得穗部感染小麦矮腥黑粉菌的小麦植株的方法

摘要

本发明提供了一种获得穗部感染小麦矮腥黑粉菌的小麦植株的方法，属于农业微生物领域。所述方法包括如下步骤：(1)制备萌发的冬孢子悬浮液：培养小麦矮腥黑粉菌的冬孢子至萌发，将萌发后的冬孢子用2ml/皿的无菌水冲洗，再加入0.02％的吐温，制得冬孢子悬浮液；(2)培养小麦植株：将小麦种子灭菌催芽后进行春化处理，将春化后的小麦种子栽种于灭菌土里至孕穗期；(3)接种：将所述冬孢子悬浮液注射进小麦穗子最上一个茎节上方2.5cm处的叶鞘内。采用本发明所述的方法可以高效地获得穗部感染小麦矮腥黑粉菌的小麦发病植株，并将这些小麦发病植株应用于小麦矮腥黑粉菌的研究。

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物领域，具体涉及获得穗部感染小麦矮腥黑粉菌的小麦植株的方法。

背景技术

小麦矮腥黑粉菌，即小麦矮腥黑穗病菌(TilletiacontroversaKühn,TCK)，属真菌界黑粉 菌科腥黑粉菌属，是引起的小麦矮腥黑穗病是一种重要的国际检疫性病害，对小麦生产造成 严重的危害，也是我国外来生物入侵研究的主要物种之一。

小麦矮腥黑粉菌的形态特征如下：冬孢子堆多生于子房内，形成黑粉状的孢子团，即黑 粉菌瘿，每个菌瘿视大小不同可含有冬孢子10万至100万个。冬孢球形或近球形，黄褐色至 暗棕褐色，其平均直径及标准差为20.90+/-0.72，大多为19-23um，但偶有17um或30um的 (包括胶鞘)。外孢壁的多角形网眼状饰纹，网眼通常直径3-5um，偶尔呈脑纹状或不规则形， 肉脊平均高度为1.425+/-0.144um，孢壁外围有透明胶质鞘包被，不育细胞球形或近球形，无 色透明或微绿色，有时有胶鞘，直径通常小于冬孢子9-16um，偶尔可达22um，表面光滑， 孢壁无饰纹。

小麦矮腥黑粉菌的生物学特性如下：小麦矮腥黑穗病菌冬孢子萌发，需持续低温，大体 上在3℃-8℃之间，而以4-6℃为最适温度，最低为0℃，最高为10℃。当温度为4-6℃时， 在光照条件下，冬孢子通常经3-5周后萌发，个别菌株在第16天开始萌发，少数菌株经7-10 周后才开始萌发。高于或低于适温范围，孢子萌发时期相应延长，在0℃左右，孢子经8周 后才开始萌发，并生成正常的先菌丝及孢子和次生小孢子。当10℃时，孢子在8周后开始萌 发，多生成细长、畸形的先菌丝，很少形成小孢子，并常有自溶现象。病原冬孢子有极强的 抗逆性，在室温条件下，其寿命至少为4年，有的长达7年，病瘿中的冬孢子，在土壤中的 寿命为3-7年，分散的冬孢子则至少一年以上，病菌随同饲料喂食家畜后，仍有相当的存活 力。病原冬孢子耐热力极强，在干热条件下，需经130℃半小时才能灭活，而湿热则需80℃、 20分钟可致死。

在对小麦光腥黑粉菌的侵染机制的研究中，通常需要通过人工方法将它接种至小麦植株 使后者感染得到染病小麦植株以进行观察和分析，现有技术中存在一些人工接种的方法，例 如，易建平等创建的胚芽鞘创伤单孢接种法，即用无菌手术小刀划伤萌发种子的胚芽鞘顶部, 切取约4～5mm²带有单个萌发TCK冬孢子的琼脂小块,反贴于胚芽鞘伤口处,每株麦苗接种 1个萌发孢子。接种麦苗置于5℃光照(12h/d)条件下培养。以及胚芽鞘单孢接种法，即用无菌 手术小刀切取约4～5mm²带有单个萌发TCK孢子的琼脂小块,反贴于胚芽鞘上,每株麦苗 接种1个萌发孢子。接种麦苗置于5℃光照(12h/d)条件下培养。经这两种人工接种方法获得 的小麦植株发病率分别为4.44％和0.44％。2014年姚卓等人分别用4种不同的人工接种方法 对小麦光腥黑粉菌对小麦种子进行系统侵染，只有第一种和第三种方法获得了3.33％和6.66％ 的发病病穗。

本领域上缺乏一种仅针对部分孕穗的部分籽粒进行侵染的人工接种方法。

发明内容

本发明针对上述领域存在的空白，提供了一种通过人工接种获得穗部感染小麦矮腥黑粉 菌的小麦植株方法。

本发明的技术方案如下：

一种获得穗部感染小麦矮腥黑粉菌的小麦植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备萌发的冬孢子悬浮液：培养小麦矮腥黑粉菌的冬孢子至萌发，将萌发后的冬孢 子用2ml/皿的无菌水冲洗，再加入0.02％的吐温，制得冬孢子悬浮液；

(2)培养小麦植株：将小麦种子灭菌催芽后进行春化处理，将春化后的小麦种子栽种于 灭菌土里至孕穗期；

(3)接种：将所述冬孢子悬浮液注射进小麦穗子最上一个茎节上方2.5cm处的叶鞘内。

步骤(1)中所述的培养指，用2％土壤浸提液培养基，在5℃人工气候生长培养箱培养 内全光照倒置培养小麦矮腥黑粉菌的冬孢子15天。

所述冬孢子悬浮液的浓度为100×10⁴～105×10⁴个/mL，每穗小麦的注射量为1ML。

所述小麦种子灭菌催芽，以30％NaClO溶液对小麦种子表面消毒5min，无菌水冲洗5 次后，将小麦种子浸种催芽，直至胚芽鞘长至1～3mm。

所述春化处理指，催芽后的小麦种子分散平铺在培养皿盖中的湿滤纸上，封口膜密封， 置于5℃的培养箱中，4周低温春化处理，直至苗长至3～5cm。

步骤(2)中所述培养的条件是，全天25℃，相对湿度50％，全光照处理，隔夜浇水一 次。

所述孕穗期指，在步骤(2)所述培养的条件下小麦植株生长30天至株高25～35cm，叶 片长至7叶。

任一所述的方法在小麦矮腥黑粉菌研究方面的应用。

本发明提供了一种人工接种获得穗部感染小麦矮腥黑粉菌的小麦植株的方法，包括如下 步骤：

(1)制备萌发的冬孢子悬浮液：培养小麦矮腥黑粉菌的冬孢子至萌发，将萌发后的冬孢 子用2ml/皿的无菌水冲洗，再加入0.02％的吐温，制得冬孢子悬浮液；这样制备的冬孢子悬 液具有符合接种条件的悬浮浓度，加入0.02％的吐温是为了对冬孢子起到保护作用。

(2)培养小麦植株：将小麦种子灭菌催芽后进行春化处理，将春化后的小麦种子栽种于 灭菌土里至孕穗期；对小麦种子灭菌以及采用灭菌土栽培的作用是防止其它病菌的干扰以保 证用于待侵染的小麦植株在接种前是无菌的；春化处理的作用是为了保证小麦植株后期能顺 利孕育结实。

(3)接种：将所述冬孢子悬浮液注射进小麦穗子最上一个茎节上方2.5cm处的叶鞘内。 采用这种方式接种可以达到仅使部分穗粒感染的目的。

步骤(1)中所述的培养指，用2％土壤浸提液培养基，在5℃人工气候生长培养箱培养 内全光照倒置培养小麦矮腥黑粉菌的冬孢子15天。这种培养条件和培养环境下获得的萌发的 冬孢子可产生有侵染能力的侵染丝有利于获得符合接种条件的冬孢子悬液。

所述冬孢子悬浮液的浓度为100×10⁴～105×10⁴个/mL。该浓度下的冬孢子悬液用于接种更 优。

所述小麦种子灭菌催芽指，以30％NaClO溶液对小麦种子表面消毒5min，无菌水冲洗 5次后，将小麦种子浸种催芽，直至胚芽鞘长至1～3mm。30％次氯酸钠溶液对小麦种子消毒 的目的在于杀灭小麦种子本身携带的各种病菌，以确保接种前的小麦种子是无菌的。胚芽鞘 长至1～3mm的种子更适于后期的栽种。

所述春化处理指，催芽后的小麦种子分散平铺在培养皿盖中的湿滤纸上，封口膜密封， 置于5℃的培养箱中，4周低温春化处理，直至苗长至3～5cm。经过此春化处理步骤的小麦 种苗能确保后期发育成有孕育活性的麦穗。

步骤(2)中所述培养的条件是，全天25℃，相对湿度50％，全光照处理，隔夜浇水一 次。这样的培养条件更适于小麦快速健康的生长，可短时间内获得孕穗期小麦株。

所述孕穗期指，在步骤(2)所述培养的条件下小麦植株生长30天至株高25～35cm，叶 片长至7叶。在小麦植株长至这个时期更有利于进行本发明的接种以获得部分病穗及部分病 粒。

本发明还请求保护所述方法在小麦矮腥黑粉菌研究方面的应用。

经验证统计，采用本发明所述的方法人工接种小麦矮腥黑粉菌侵染小麦孕穗期植株，可 以获得具有部分感病麦粒或部分感病麦穗的小麦植株，发病率高达92％。

附图说明

图1表示小麦播种后生长至三叶期，长势基本一致；

图2中A表示小麦生长30天后至孕穗期时注射接菌；B表示同时期株高33cm，7叶的 整株小麦；C表示由B分离出的小穗部；

图3中A表示白色箭头示注射接菌25天后病穗上的单个病粒；B表示白色箭头示注射 接菌35天后病穗上的单个病粒。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细说明本发明所述的制品，但并不以此限制本发明的范围。 如无特殊说明，下述所采用的试剂与材料均可商购获得，所采用的方法均为常规操作。

生物材料

小麦品种：冬选3号，为已知品种，可商购获得。

小麦矮腥黑粉菌(TilletiacontroversaKühn)菌株：本发明所有的TCK菌株为现有文献 L.GAOetal.DevelopmentofaSCARMakerbyinter-simplesequencerepeatfordignoisisof DwarfBuntofWheatandDetectionofTilletiacontroversaKühn.FoliaMicrobiol.55(3),258–264 (2010)所记载，参见其中材料与方法部分记载的在美国由B.Goates教授分离到的分离株。另 外也记载在L.GAOetal.AnISSR-basedApproachfortheMolecularDetectionandDiagnosisof DwarfBuntofWheat,CausedbyTilletiacontroversaKu¨hn.JPhytopathol159:155–158(2011)， 为其中材料与方法部分记载的DrBlairGoates所提供的TCK菌株。本实验室亦有保存，可自 申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

试剂与耗材

琼脂、蒸馏水、NaClO、吐温均商购获得。

2％土壤浸提液培养基，制备方法如下：称取土壤75g，500ml沸水，用8层纱布过滤， 过滤后加入琼脂粉20g，加水定容至1L，121℃，20min，湿热灭菌。

实施例1、本发明所述方法人工接种小麦矮腥黑粉菌及侵染结果观察统计

本实施例提供了一种经人工接种以获得穗部感染小麦矮腥黑粉菌的小麦植株的方法，具 体操作如下：

小麦种子的灭菌及催芽：以30％的NaClO溶液表面消毒5min，无菌水冲洗5次，去 除小麦种子表面可能携带的小麦矮腥黑粉菌。将小麦种子浸种催芽，直至胚芽鞘长至1～3 mm。

土壤灭菌：将营养土放入高压灭菌锅，60～100℃加热，持续30～60min，杀灭土壤内 大部分的细菌、真菌、线虫和昆虫。

春化处理：催芽后的种子分散平铺在培养皿盖中的湿滤纸上，封口膜密封，置于5℃的 培养箱中，4周低温春化处理，直至苗长至3～5cm。

小麦培养条件：4周后将种子种植在灭菌土里，定期观察小麦生长状况，直至成熟。温 室温度设置全天25℃，相对湿度50％，全光照处理，隔夜浇水一次。

小麦播种后生长至三叶期，长势基本一致，如图1所示。植株正常生长30天后，小麦株 高25～35cm，叶片长至7叶，无分蘖现象(图2B)，剥离整株发现有小穗出现(图2C)，此 时为孕穗期，开始注射接种。

萌发的冬孢子悬浮液制备：采用2％土壤浸提液培养基培养该病菌的萌发冬孢子，其悬浮 液浓度为100×104～105×104个/mL,置于5℃人工气候生长培养箱(LT-36VLC8,PERCIVAL, USA)全光照倒置培养，15天后在全自动倒置研究级显微镜(IX83,OLYMPUS,Japan)下观 察冬孢子的萌发情况。将萌发中的冬孢子用2ml/皿的无菌水冲洗，再加入0.02％的吐温。

注射方法：用一皮下注射器把接种物注射到孕穗里，每穗小麦的注射量为1ML。将悬浮 液注射进穗子正在发育的最上一个茎节上方2.5cm处的叶鞘，此时约为旗叶刚刚生出的阶段 (图2A)，在温室中种植植株至成熟。这种方法在3周后产生具部分病粒的部分病穗(图3)。

经统计，采用本实施例所述方法获得的人工接种小麦植株发病率高达92％。由此可见， 本实施例所提供的方法可以高效地获得穗部感染小麦矮腥黑粉菌的小麦发病植株，并将这些 小麦发病植株应用于小麦矮腥黑粉菌的研究。