用于饲料中添加的粪肠球菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用

摘要

本发明公开了用于饲料中添加的粪肠球菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用，通过对已经报道的粪肠球菌基因组序列的比对分析，本发明提供了用于粪肠球菌定性定量检测的引物5’-？CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA？-3’、5’-？CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC？-3’，同时本发明提供了一种饲料样品的预处理方法，使得饲料中的益生菌可以充分释放，准确真实的反应出饲料中的益生菌数目。本发明可以在不进行益生菌纯培养的基础上，简便、快速、准确地定性、定量检测猪饲料中粪肠球菌，检测程序简单、检测效率高、准确性好，灵敏度高，重复性好。

说明书

技术领域

本发明属于畜牧兽医技术领域。更具体地，本发明涉及用于饲料中添加的粪肠球菌的快 速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用。

背景技术

随着我国动物饲料中抗生素的禁用，新型的绿色添加剂的开发成为热点。目前益生菌制 剂不断发展，但是在其定性、定量检测的方法还不够科学和快速，这在一定程度上限制了益 生菌制剂的发展。通常采用生理生化反应和选择性培养基纯培养分离计数的传统方法，极易 因为菌种差异导致的检测效率受限、检测结果不稳定，除此之外，传统方法也会耗费大量的 时间和资源。实时荧光定量PCR相对于PCR技术来说，是定性到定量的飞跃，因其特异性强、 重复性好、准确和高效的特点成为分子生物学和微生物学领域非常重要的定量检测方法。通 过种属特异性PCR和实时荧光定量PCR技术，建立猪饲料中粪肠球菌的快速定性、定量检测 方法，可以提高检测效率、简化检测程序，并促进饲料行业和养殖业的发展，为益生菌和饲 料产业的快速和长远发展提供技术保障。

本申请针对猪饲料中含有的粪肠球菌，通过对已经报道的粪肠球菌基因组序列的比对分 析，选取粪肠球菌的保守基因作为目的基因，自行设计粪肠球菌的基因序列的种属特异性引 物，利用该引物进行种属特异性PCR和实时荧光定量PCR，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析和 实时荧光定量PCR图谱分析，建立了猪饲料中粪肠球菌的快速定性和定量测定方法。

发明内容

用于饲料中添加的粪肠球菌的快速定性、定量检测试剂盒，包括引物：5’- CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA-3’、5’-CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC-3’。

本发明的另一个目的在于提供了用于饲料中添加的粪肠球菌的快速定性、定量检测试剂 盒的检测方法，方法简单，重复性高，结果准确。

本发明的另一个目的在于提供了一种用于饲料中添加的粪肠球菌的快速定性、定量检测 试剂盒的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

用于饲料中添加的粪肠球菌的快速定性、定量检测试剂盒，包括引物：5’- CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA-3’、5’-CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC-3’。

用于饲料中添加的粪肠球菌的快速定性、定量检测试剂盒的检测方法，包括饲料样品预 处理的方法，该方法包括：

经过充分粉碎混匀的饲料25g与225mL的灭菌生理盐水混合，在4℃以100转/分的速 度震荡1-2h，配成10％的均匀稀释液。对均匀稀释液进行10倍递增稀释，选择2个以上适 宜的稀释度，根据需要，提取细菌基因组DNA或RNA。

用于饲料中添加的粪肠球菌的快速定性、定量检测试剂盒的应用，其应用包括利用该试 剂盒制备成用于粪肠球菌的检测试剂，或利用该试剂盒进行粪肠球菌的定性检测，或利用该 试剂盒进行粪肠球菌的定量检测，或利用该试剂盒同时进行粪肠球菌的定性和定量的检测。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明所采用的饲料样本的处理方法使得在益生菌的提取过程中，益生菌的扩增有限， 同时饲料中的益生菌又可以充分释放，这样所测得值才能真实的反应出饲料中的益生菌数目， 为一种特异的适用于饲料中粪肠球菌提取方法，为本发明首创。

(2)本发明对目前已经报道的粪肠球菌及饲料中可能添加的如嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、 保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、屎肠球菌、双歧杆菌等其他益生菌所有的基因组序列进行了 比对分析，选择了保守的单拷贝基因作为目的基因，并以该基因的保守序列设计了特异性的 引物，以该引物对饲料中的粪肠球菌进行定性、定量检测，所得到数据才能真实的反应出饲 料中添加的粪肠球菌的数量。

(3)本发明可以在不进行益生菌纯培养的基础上，简便、快速、准确地定性、定量检测猪 饲料中粪肠球菌，整个过程对饲料中粪肠球菌的检测程序简单、检测效率高、准确性好，灵 敏度高，最低检测标准要比传统的方法低的多，而且重复性好。

附图说明

图1为粪肠球菌的定性检测示意图。

M：DL2000marker；1：干酪乳杆菌；2：嗜酸乳杆菌；3:保加利亚乳杆菌；4:阳性对照(含 有目的基因的质粒为模版)；5:粪肠球菌；6:添加有粪肠球菌的饲料；7:动物双歧杆菌；8: 大肠杆菌；9:屎肠球菌；10:植物乳杆菌；11:两歧双歧杆菌；12阴性对照

图2为Real-timePCR对粪肠球菌引物特异性的验证示意图。

其中A.嗜酸乳杆菌B.植物乳杆菌C.保加利亚乳杆菌D.干酪乳杆菌E.粪肠球菌F.屎肠球 菌G.双歧杆菌H.青春双歧杆菌

图3为不同浓度粪肠球菌标准菌种扩增曲线示意图。

其中A.10^-1稀释；B.10^-2稀释；C.10^-3稀释；D.10^-4稀释；E.10^-5稀释；F.10^-6稀释；G.10^-7稀释；H.10^-8稀释。

图4为粪肠球菌定量检测标准曲线示意图。

具体实施方式

本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。所用试剂或材料， 均已公开。

pMD18-T克隆载体核DH5α感受态细胞均购自Takara生物科技有限公司，Trizol试剂 是由Invitrogen公司专供提取的RNA的产品；DNaseI是TaKaRa公司产品；此过程中使用 的氯仿、异丙醇、无水乙醇等试剂是天津市化学试剂三厂生产的产品。粪肠球菌标准菌种购 自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

实施例1：

粪肠球菌目的检测基因的选取：

本发明对目前已经报道的粪肠球菌及饲料中可能添加的如嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、 植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、屎肠球菌、双歧杆菌等其他益生菌所有的基因 组序列进行了大量比对分析，选择定性、定量检测的目的基因，该目的基因在粪肠球菌菌基 因组中是保守的看家基因，而且是单拷贝基因，以该基因的保守序列设计了特异性的引物， 对饲料中的粪肠球菌进行定性、定量检测，所得到数据才能真实的反应出饲料中添加的粪肠 球菌的数量。针对该目的基因设计的引物为：5’-CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA-3’、5’- CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC-3’；该引物可用于粪肠球菌的定性及定量检测。

实施例2：

用于饲料中添加的粪肠球菌的快速定性、定量检测试剂盒，包括引物：5’- CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA-3’、5’-CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC-3’。

实施例:3：

用于饲料中添加的粪肠球菌的快速定性、定量检测试剂盒的检测方法，包括饲料样品预 处理的方法，该方法包括：

经过充分粉碎混匀的饲料25g与225mL的灭菌生理盐水混合，在4℃以100转/分的速 度震荡1-2h，配成10％的均匀稀释液。无菌操作对上一步制备的均匀稀释液进行10倍递增 稀释，选择2～3个以上适宜的稀释度，根据需要，提取细菌基因组DNA或RNA。

其余步骤利用实施例1中的引物对对提取的DNA或RNA进行定性和定量的鉴定。 用于饲料中添加的粪肠球菌的快速定性、定量检测试剂盒的检测方法，具体包括以下步骤：

A、模板DNA的制备

无菌操作将经过充分粉碎混匀的饲料25g放入含有225mL的灭菌生理盐水的灭菌广口 瓶内，在低温条件下(4℃)以100转/分的速度震荡1.5h，配成10％的均匀稀释液。无菌 操作对上一步制备的均匀稀释液进行10倍递增稀释，选择3个以上适宜的稀释度，采用液 氮冻融-CTAB法抽提样品DNA：

(1)取预处理后的饲料样品于2.0mL离心管中，加入500μLTE缓冲液混合均匀后，置 于液氮中冻结，冻结后取出放在65℃中水浴5min，反复冻融4次；

(2)冻融结束后，往其中加入60.0μL10％的SDS和10.0μL110mg/mL蛋白酶K，37℃摇 床以200r/min振荡4h；

(3)加入100.0μL5MNaCl和100.0μLCTAB/NaCl，65℃中水浴10min；

(4)然后，加入与步骤(3)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，它们的体积 比分别为25:24:1,混匀后以10000g/min离心10min,该溶液分成上层水相、中层固相和下层 有机相；

(5)吸取上层水相，加入与水相体积相等的苯酚、氯仿和异戊醇混合物抽提一次，分离 上清液；

(6)往上述上清液中加入1％体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的并异丙醇，混匀后室温 静置30min,10000g/min离心5min，弃掉上清；

(7)用70％乙醇洗涤沉淀两次，室温下自然干燥后获得模板DNA,加入50.0μL无菌超纯 水溶解DNA，-20℃保存备用。

作为下一步定性PCR检测的模板，于-20℃下保存备用。

B、PCR扩增

反应体系25.0μL：

2.5μL10×PCRBuffer(含Mg²⁺)、

2.0μL10mmol/LDNTPs(各2.5mmol)、

1.0μL10mmol/L上下游引物、

1.0μL50ng/LDNA模板、

0.5μL5U/LTaq酶、

用ddH₂O补足至25.0μL；

PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃预变性30s，64℃退火30s，72℃延伸45s，循 环40次；72℃延伸10min，得到PCR扩增产物，在4℃下保存；

取5.0μLPCR产物使用1.0％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。琼脂糖凝胶电泳图谱分析是 使用上海天能以商品名Tanon-4100凝胶电泳成像系统销售的仪器进行的；

所述的粪肠球菌上下游特异性引物分别是：

上游引物为：5’-CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA-3’

下游引物为：5’-CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC-3’

C、结果及判定

检测时设以含有目的的扩增片段的质粒DNA作为模板为阳性对照，以灭菌水作为模 板为阴性对照；同时以各标准菌株的非同种对照菌株作为参考进行扩增。如果标准菌株扩增 产物出现与预期大小相符的特异性条带，而阴性对照和非同种对照菌株没有出现该特异性条 带，则表明引物是特异的。根据在473bp处出现预期特征条带，表明该饲料中含有粪肠球菌， 相反则不含有粪肠球菌。

所述的含有目的基因的扩增片段的质粒DNA是通过将粪肠球菌的PCR产物与pMD18T 载体链接转化大肠杆菌DH5a获得的阳性克隆子。

所述的定性检测是在5V/cm的电压下进行的电泳，时间约为20-30min，再用Goldview 染色，然后进行紫外照相。

D、RNA的提取

(1)样品总RNA的制备

采用Trizol法提取饲料样品中的总RNA：无菌操作将经过充分粉碎混匀的饲料25g放入含 有225mL的灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内，在低温条件下(4℃)以100转/分的速度震荡1.5 个小时，配成10％的均匀稀释液。无菌操作对上一步制备的均匀稀释液进行10倍递增稀释， 选择3个以上适宜的稀释度稀释后的稀释液用于提取总RNA，在饲料稀释液中迅速加入 1mLTrizol试剂，按Trizol试剂盒(D9108A)说明书提取样品RNA，RNA提取的步骤如下：

①向上述步骤的匀浆裂解液中加入氯仿(RNAisoPlus的1/5体积量，200L)，盖紧离心 管盖，用手剧烈振荡15秒(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待溶液 充分乳化(无分相现象)后，再室温静置5min。

②12,000g4℃离心15min。

③从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白 色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液(通常取450L)转移至另一新的1.5mL离心 管中(切忌吸出白色中间层)

④向上清中加入等体积的异丙醇(450L)，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃环 境中静置10min。

⑤12,000g4℃离心10min。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。

小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1mL(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠 倒洗涤离心管管壁，12,000g4℃离心5min后小心弃去乙醇(为了更好地控制RNA中的盐离 子含量，应尽量除净乙醇)。可再用75％的乙醇1mL清洗一遍。

室温干燥沉淀5～10min(不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解)，加入适量 的RNase-free水(肠道通常取50L，细胞、细菌取20L)溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹 打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后置于冰上。

(2)RNA的浓度检测、稀释

①背景的建立：取RNase-free水2L，在微量核酸蛋白检测仪NanoDrop2000上建立空白； 检测RNase-free水的RNA浓度，在±5ng/L为宜。

②检测样品浓度：组织样品浓度两次检测浓度相差以不超过50ng/L为宜，两次测量的 平均值即为样品RNA浓度。

③1.7<A260/A280<2.1；基因芯片附加条件：A260/A230>2.0

④RNA样品的稀释：

取X□L样品稀释，则无酶水添加量：无酶水体积Y＝(原液浓度/600–1)*X(□L)， 细胞、细菌样品一般不需要稀释。

⑤稀释后再次检查RNA浓度，以600±50ng/L为宜。

确保完全消除RNA中的DNA污染，得到纯化的RNA样品，使用微量紫外分光光度仪 测定浓度，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，然后将样品保存于-80℃下备用；

E、反转录扩增

反应体系10μL：2.0μL5×PrimeScriptBuffer2(forRealTime)、0.5μLPrimeScriptRT EnzymeMixI、0.5μLRTPrimerMix、0.5uLRandomPrimers(100uM)、TotalRNA(<500ng)， RNaseFreedH₂O补足至10.0μL。

反转录扩增反应条件：将混匀的反应液放置在PCR仪中37℃保温15min后，85℃加热 5s最后将反转录成的cDNA降温至4℃保藏。合成的cDNA保存在-80℃冰箱中。

F、实时荧光定量PCR

PCR反应体系25.0μL：12.5μL2×SYBR^R○PremixExTaq^TM，10μmol/L上、下游引物各0.5μL, cDNA模板2.0μL，dH₂O9.5μL。

荧光定量PCR反应参数：95℃预变性3min；95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延 伸45s，循环40次，每个样品重复3次，在4℃低温下保存。

所述的粪肠球菌上下游特异性引物分别是：

上游引物为：5’-CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA-3’

下游引物为：5’-CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC-3’

外标准品的制备和标准曲线的绘制

外标准品的制备：提取含有以粪肠球菌模式菌株的目的基因的扩增片段的质粒DNA，紫 外分光光度计测定A值后，计算出拷贝数，进行10倍系列稀释，梯度稀释至10⁹-10²拷贝数 /uL的浓度，以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应；

标准曲线的绘制：以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中达到阈 值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到粪肠球菌的标准曲线，作为待测样品定量测定的参照标 准。

G、结果及判断

以待测样品cDNA和标准品的DNA为模板，用粪肠球菌的种特异性引物，以相同的体系 同时进行粪肠球菌的目的基因片段的荧光定量PCR扩增，通过标准曲线和待测样品的Ct值 求出饲料样品中粪肠球菌的起始模板量。

实施例4：

试剂盒特异性检测：

1)粪肠球菌定性检测的特异性验证：

利用实施例3提供的引物及方法，对嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪 乳杆菌、屎肠球菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、大肠杆菌、阳性对照(含有目的基因的 质粒为模版)、粪肠球菌、添加有粪肠球菌的饲料；阴性对照(灭菌水)进行PCR扩增。

结果显示：仅泳道4(含有目的基因的质粒为模版)，5(粪肠球菌)，6(添加有粪肠球 菌的饲料)产生了特异性的473bp的扩增条带，而其他菌株均没有，表明本发明提供的引物 仅可特异性的检测粪肠球菌。同时有泳道6的扩增结果可知，本发明的提供的样品预处理方 法可很好的对粪肠球菌进行分离提取(图1)。

2)粪肠球菌定量检测特异性验证

利用实施例3提供的方法，以非同种菌做为参照菌株，对粪肠球菌定量检测进行特异性 验证。

所用的参照菌株有：嗜酸乳杆菌；植物乳杆菌；保加利亚乳杆菌；干酪乳杆菌；屎肠球 菌；双歧杆菌；青春双歧杆菌。

结果判断：①循环阈值(Ct值)≤35，表明PCR过程中有目标DNA的扩增，可直接判定 为阳性；②待检样基因检测Ct值在32～40之间，应重做实时荧光PCR扩增；再次扩增后的 外源基因Ct值仍小于40，且曲线有明显得对数增长期，并且阴性对照、阳性对照和空白对 照结果正常，则可判定为阳性；再次扩增后外源基因Ct值大于40，且阴性对照、阳性对照 和空白对照结果正常，可判定为阴性。

结果表明：在模板为不同菌株DNA，引物为粪肠球菌特异性引物的条件下，仅在模板 为粪肠球菌DNA条件下，才能得到具有明显对数增长期的扩增曲线，即粪肠球菌定量检测 具有特异性(图2)

实施例5：

试剂盒灵敏性检测：

将粪肠球菌在培养基中培养一定时间，测其A值，估计其菌数，然后按10^-1，10^-2，10^-3， 10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8的倍数稀释，取最后几个梯度的菌液涂平板计数，重复3次，取 其平均值确定其真实的菌密度。同时每个梯度菌液各取3管提取RNA反转为cDNA后，以 待测样品cDNA为模板，用实施例3所述的粪肠球菌的种特异性引物及方法进行粪肠球菌 的目的基因片段的荧光定量PCR扩增(图3)，并以平板计数总菌数的对数值为横坐标，荧 光定量PCR反应的Ct值为纵坐标，得到菌数与Ct值的标准曲线(图4)。

结果表明：Ct值为32时对应的总菌数即为粪肠球菌的检测下限，即为3.5×10⁵cfu，亦 即本发明提供的引物的荧光PCR检测的最低检测标准。

实施例6：

试剂盒准确性检测：

在不含粪肠球菌的饲料中，添加终浓度为5.67±0.21×10⁸cfu/g饲料的粪肠球菌(平板 计数菌数为5.6×10⁸cfu/g饲料、5.9×10⁸cfu/g饲料、5.5×10⁸cfu/g饲料)，利用本发明的 方法进行检测，得到的实时定量PCR检测Ct值为18.49±0.07(Ct值分别为18.41、18.50、 18.55)，利用粪肠球菌标准品建立的标准曲线y＝-3.4961x+49.118(R²＝0.9965)，得到饲料 中是粪肠球菌的浓度为5.78±0.27×10⁸cfu/g饲料(理论菌数分别为6.1×10⁸cfu/g饲料、5.7 ×10⁸cfu/g饲料、5.5×10⁸cfu/g饲料)，经SPSS17.0统计分析，平板计数与本发明的方法 得到两组数据差异不显著(P＝0.305)，即本发明的样品预处理方法结合所选取目的基因，其 检测结果具有准确性。

SEQUENCELISTING

<110>武汉轻工大学

<120>用于饲料中添加的粪肠球菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用

<130>用于饲料中添加的粪肠球菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用

<160>2

<170>PatentInversion3.1

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cgtccaagttatttccccttca22

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ccagcacctaatacttcaatccaac25