能预示和鉴定绵羊羊毛油汗的分子标记方法及其引物对

摘要

一种能预示和鉴定绵羊羊毛油汗的分子标记方法及其引物对，所用引物对，上引物NFIBF：如序列表Seq？No.1所示；下引物NFIBR：如序列表Seq？No.2所示。具体方法如下：1设计引物对，并提取绵羊基因组DNA进行扩增，然后酶切，获得酶切产物；2酶切产物电泳分离，根据电泳分离结果进行基因型判定；3进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值，结果为3种基因型中具有CC基因型群体的羊毛油汗显著低于TT基因型群体；4将试验群体分为三种类型，即完成。本发明能预示和鉴定绵羊羊毛油汗，为绵羊羊毛的品质性状改良，标记辅助选择提供了更为有效的分子标记方法，可有效的应用于羊毛油汗适中的绵羊的分子辅助育种领域。

说明书

技术领域

本发明涉及动物分子遗传学领域，具体是涉及一种能预示和鉴定绵羊羊毛油汗的分子标记方法及其引物对。

背景技术

油汗性状是羊毛品质性状中的一个重要指标。油汗是皮肤内皮脂腺和汗腺的分泌产物。油汗对羊毛纤维的品质具有很好的保护作用，特别是绵羊的被毛常年要经受日晒、雨淋、风吹、雪刮、尿渍、粪污和大气的侵蚀，而油汗可保护羊毛使其化学成分、化学结构和各种物理机械性能免受或少受这些因素的损害。油汗不足的羊毛没有正常的光泽，手感发硬。羊毛油汗过多，不仅不需要，而且有害，羊毛不仅增加了不必要的重量，而且产生油汗消耗了过多的饲料。虽然羊毛在加工前要把油汗洗掉，但是不能就认为油汗是无用的杂质，反之，在绵羊育种过程中，必须是羊毛有足够数量的良好油汗，因为它是羊毛纤维必不可少的保护物质。

中国美利奴羊(新疆军垦型)的培育始于1972年，至今已培育出六个品系，分别为军垦A型品系、军垦B型品系、超细型品系、肉用多胎品系、毛用多胎品系和U品系。如何进一步改良羊毛油汗程度，培育羊毛油汗适中的种羊，以及快速扩大种群规模仍然是一个重要问题。

核因子I/B(NuclearFactorI/B，NFIB)是转录因子NFI家族中的一员，该家族由NFIA、NFIB、NFIC及NFIX共4个成员组成。NFIB基因在细胞增殖、凋亡以及组织发育中发挥着重要作用。目前，有关NFIB基因的研究主要集中在人和鼠上，NFIB基因在畜禽中的研究鲜有报道。

发明内容

本发明的目的通过如下方法实现：

1、一种能预示和鉴定绵羊羊毛油汗的分子标记方法所用引物对，上引物NFIBF：如序列表SeqNo.1所示；下引物NFIBR：如序列表SeqNo.2所示。

2、一种能预示和鉴定绵羊羊毛油汗的分子标记方法，包括如下步骤：

(1)根据绵羊NFIB基因第5内含子区C82197267T位点设计一对引物NFIBF和NFIBR，然后对绵羊基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，再用内切酶MaeII酶切PCR扩增产物，获得酶切产物；

(2)使用质量浓度为2％～3％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳分离，然后根据电泳分离结果进行基因型判定；

(3)根据中国美利奴羊试验群体的特点，构建基因型效应统计模型：Y＝μ+G+L+A+G×L+G×A+A×L+e，然后利用JMP7.0统计软件将基因型与连续性性状进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值；

(4)根据基因型将中国美利奴羊试验群体分为三种类型，从而实现预示和鉴定绵羊羊毛油汗的分子标记辅助育种，即完成预示和鉴定绵羊羊毛油汗的分子标记方法。

3、如2所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛油汗的分子标记方法，所述的步骤

(1)PCR扩增的反应体系如下所示：

PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53.8℃退火30s，72℃延伸30s，共36个循环；72℃终延伸10min，4℃终止反应。

4、如2所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛油汗的分子标记方法，所述的步骤(1)获得的PCR扩增产物，序列如SeqNo.3所示。

5、如2所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛油汗程度的分子标记方法，所述的步骤(1)酶切体系如下所示：

10×RBuffer1μL

内切酶MaeII1μL

PCR产物10μL

酶切条件为：65℃酶切4h。

6、如2所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛油汗的分子标记方法，所述的步骤(2)基因型的判定的标准如下所示：

(1)电泳呈现两条带，大小为251bp和59bp，则绵羊NFIB基因第5内含子区C82197267T位点未突变时，PCR扩增产物可以被MaeII酶完全切开，将其命名为CC基因型；

(2)电泳呈现一条带，大小为310bp，则绵羊NFIB基因第5内含子区C82197267T位点突变时，PCR扩增产物不能被MaeII酶切，将其命名为TT基因型；

(3)电泳呈现三条带，大小为310bp、251bp和59bp，则绵羊NFIB基因第5内含子区C82197267T位点处于杂合状态，PCR扩增产物不能被MaeII酶完全切开，将其命名为CT基因型。

7、如2所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛油汗的分子标记方法，所述的步骤(3)构建基因型效应统计模型，其中，Y为性状的观测值，μ为群体均值，G为基因型效应，L为品系效应，A为年龄效应，G×L为基因型和品系的互作效应，G×A为基因型和年龄的互作效应，A×L为品系和年龄的互作效应，e为剩余值效应。

8、如2所述的一种能预示和鉴定绵羊羊毛油汗的分子标记方法，所述的步骤(3)中中国美利奴羊均为1～12岁的新疆军垦型母羊。

本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。使用本发明的标记基因型对绵羊羊毛油汗进行选择时，将使绵羊羊毛的油汗取得很大的遗传进展。羊毛油汗是羊毛重要的品质性状和经济性状，羊毛油汗不足或者油汗过多，均对羊毛的品质有重要影响，羊毛油汗适中，能对羊毛产生良好的保护，在生产过程中也不会产生过多的羊毛清洗费用，因此，羊毛油汗适中，对羊毛价格有重要的影响。利用本发明可以对羊毛油汗进行选择，不仅为绵羊羊毛的品质性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段，也为绵羊育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法。本发明可以有效的应用于羊毛油汗适中的绵羊的分子辅助育种领域，实现种羊的早期选种，出生后即可进行选留，加速绵羊的育种进程。

附图说明

图1为酶切产物的电泳分离图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

实施例1

中国美利奴羊基因组DNA的获得

采集绵羊耳组织，-20℃保存备用。采用常规的苯酚/氯仿法提取绵羊基因组DNA。具体方法如下：

(1)取中国美利奴羊(新疆军垦型)耳组织5g，剔除结缔组织，将组织块用70％酒精清洗、消毒，置于Eppendorf管内，用剪刀剪碎，或研磨碎；

(2)待Eppendorf管内的酒精完全挥发之后，加入分离缓冲液700μL，悬浮剪碎的组织后，加入蛋白酶K(20mg/mL)5.0μL，55℃作用8-12h，直到无组织块为止；

(3)将消化好的组织液取出，加入等量组织液的饱和酚，混匀10min，4℃，12000r/m，离心10min；

(4)取上清液，加等量的苯酚/氯仿，轻轻混匀10min，4℃，12000r/m，离心10min；

(5)取上清液，加等量的氯仿，混匀10min，4℃，12000r/m，离心10min；

(6)取上清液，加2倍量的无水乙醇沉淀，颠倒混匀后，室温下静置10-20min，DNA沉淀形成白色絮状物；

(7)弃去上清，再加70％的乙醇清洗，弃去上清，在吸水纸上吸取多余液体，自然风干后，加适量的TE溶解，-20℃保存；

(8)若DNA溶液中有不溶解颗粒，可在5000r/m短暂离心，取上清；如要去除其中的RNA，可加入5μLRNaseA(10μg/μL)，37℃保温30min，用酚抽提后，按步骤4-7重新沉淀DNA。

实施例2

绵羊NFIB基因酶切产物的获得

根据绵羊基因组中的NFIB基因C82197267T位点设计一对引物NFIBF和NFIBR，然后对绵羊基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，再用内切酶MaeII酶切PCR扩增产物，获得酶切产物。

引物序列如下所示：

NFIBF：5'-ACAAACAGTTCAAGATTTTTTGC-3’

NFIBR：5’-TTTTCACTTCATTATCCCCAG-3’

PCR扩增体系如下：

PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53.8℃退火30s，72℃延伸30s，共36个循环72℃终延伸10min，4℃终止反应。

酶切反应体系如下：

10×RBuffer1μL

内切酶MaeII1μL

PCR产物10μL

酶切条件为：65℃酶切4h。

实施例3

绵羊NFIB基因型的判定

使用浓度为2％～3％的琼脂糖凝胶对实施例1中的酶切产物进行电泳分离，根据电泳分离结果进行基因型判定，判定的标准：(1)电泳呈现两条带，大小为251bp和59bp，则绵羊NFIB基因第5内含子区C82197267T位点未突变时，PCR扩增产物可以被MaeII酶完全切开，将其命名为CC基因型；(2)电泳呈现一条带，大小为310bp，则绵羊NFIB基因第5内含子区C82197267T位点突变时，PCR扩增产物不能被MaeII酶切，将其命名为TT基因型；(3)电泳呈现三条带，大小为310bp、251bp和59bp，则绵羊NFIB基因第5内含子区C82197267T位点处于杂合状态，PCR扩增产物不能被MaeII酶完全切开，将其命名为CT基因型。

本发明中的693只中国美利奴羊均为新疆军垦型1～12岁的母羊，共检测到3种基因型，对3种不同基因型在6个绵羊群体中的分布进行分析，CC型个体最多，结果如表1所示，频率为0.5483。

表1NFIB基因不同基因型在绵羊群体中的分布

实施例4

基因型效应统计模型的构建

根据中国美利奴羊试验群体的特点，构建基因型效应统计模型：Y＝μ+G+L+A+G×L+G×A+A×L+e，其中，Y为性状的观测值，μ为群体均值，G为基因型效应，L为品系效应，A为年龄效应，G×L为基因型和品系的互作效应，G×A为基因型和年龄的互作效应，A×L为品系和年龄的互作效应，e为剩余值效应。

本发明羊毛性状测定根据国家纤维检验标准和国际毛纺织组织(IWTO)纤维检测标准，并参考刘守仁院士编写的《羊毛与羊毛品质》一书，油汗程度可根据羊毛中有无脂肪物质的小块和颗粒加以辨识，对绵羊体侧部位毛样进行油汗的测定。羊毛油汗程度评定分为三个等级：油汗不足为1，油汗适中为2，油汗过多为3。

本发明对NFIB基因第5内含子区C82197267T位点C/T单碱基突变的3种基因型与中国美利奴羊(新疆军垦型)试验群体693个个体的羊毛细度、细度标准差、卷曲度和油汗性状等进行最小二乘分析，结果表明绵羊NFIB基因第5内含子区C82197267T位点不同基因型多态性与中国美利奴羊(新疆军垦型)试验群体的羊毛油汗程度显著相关，P值为0.029；再对3种基因型间的最小二乘均值进行多重比较，结果表明具有CC基因型群体的羊毛油汗显著低于CT基因型群体(P＜0.05)，结果如表2所示。

表2NFIB基因第5内含子区不同基因型对羊毛油汗程度的影响

均值比较时同一行无相同字母者差异显著(^a-bP＜0.05)

以上结果表明，NFIB基因可作为绵羊羊毛油汗的主要候选基因之一，CC型可以作为分子遗传标记用于预测绵羊羊毛油汗性状。可以组建CC型个体为主的羊毛油汗性状育种群体，有效培育出油汗程度适中的绵羊品系。

实施例5

绵羊羊毛油汗的分子标记方法的确立

根据基因型将中国美利奴羊试验群体分为三种类型，从而实现预示和鉴定绵羊羊毛油汗的分子标记辅助育种，即完成预示和鉴定绵羊羊毛油汗的分子标记方法。