一株短稳杆菌及其在制备手性醇中的应用

摘要

本发明提供了一株新的菌种——短稳杆菌ZJUY-1401？(Empedobacter？brevis？ZJUY-1401)，及利用该微生物不对称还原潜手性酮制备光学纯手性醇的方法。所述菌株不对称还原制备手性醇具有显著优点，能够合成高光学纯度手性醇(ee

说明书

技术领域

本发明涉及一株新的菌种——短稳杆菌ZJUY-1401(EmpedobacterbrevisZJUY-1401)，及利用该微生物不对称还原潜手性酮制备光学纯手性醇的方法。

背景技术

手性醇是合成手性药物和其他手性化合物的重要中间体。如(3S,5R)-Dihydroxy-6-(Benzyloxy)hexanoicAcid,EthylEster是合成抗胆固醇药物Arotvastatin和Rosuvastatin的关键手性中间体(Biomolecules,2013,3:741-777)；(S)-1-(2’-bromo-4’-fluorophenyl)ethanol和(S)-methyl4-(2’-acetyl-5’-fluorophenyl)-butanol是多种抗阿尔茨海默病潜在药物合成的中间体(JMolNeurosci.,2001,17:259-267)。手性药物的两种对映异构体往往具有不同的功效或其作用效果相差甚远，如以手性芳香醇为中间体合成的(S)-氟西汀可预防偏头痛，而(R)-氟西汀则是作为抗抑郁药；(R)-沙丁胺醇具有治疗喘息性支气管炎的作用，其(S)-构型对映异构体却无此功效。因此，单一对映体在制药工业中越来越受关注，而单一对映体手性醇的获得成为合成此类药物的关键。

光学活性手性醇的合成方法主要有手性池法、手性拆分法和不对称合成等(FoodTechnolBiotechnol.,2004,42:305-325)。其中，潜手性酮的不对称还原是制备光学活性手性醇的重要方法，理论上能将100％底物酮转化为单一对映体的手性醇，具有很高的工业应用价值。

化学法不对称还原潜手性酮往往以手性氨基醇或过渡金属配合物作为催化剂，虽能够获得较高的产率，但其立体选择性往往不理想，产品光学纯度无法达到制药行业要求；另外，还存在手性催化剂制备和回收困难，价格昂贵等缺点。生物法催化的潜手性酮不对称还原在化学选择性、区域选择性和立体选择性方面更具优势，产物光学纯度高(ApplMicrobiolBiotechnol.,2013,91:8087-8096)；此外，生物催化通常在温和条件下进行，避免了剧烈化学反应过程中化合物的异构化、差向异构化、消旋和重排等现象的发生(Biomolecules,2013,3:741-777)。因此，生物催化法合成光学活性手性醇已成为最受瞩目的医药及精细化学品合成技术之一。

微生物催化潜手性酮还原制备高光学纯度手性醇已有诸多报道。能够催化该反应进行的微生物种类繁多，包括细菌、霉菌、酵母和放线菌等。Yao等利用面包酵母不对称还原4-氯-乙酰乙酸乙酯，(S)-型和(R)-型产物的ee值分别达到95％和98％(催化学报,2004,25(010):805-808)；Harald等利用源于红串红球菌的高活性(S)-醇脱氢酶还原对位卤素取代苯乙酮合成相应手性芳香醇(Tetrahedron,2004,60(3):633-640)；Ribeiro等通过黑曲霉、白地霉、汉森酵母和克鲁维酵母等微生物细胞还原α-乙酰基-γ-丁内酯，转化率和产物ee值均达到100％(Tetrahedron:Asymmetry,2006,17(6):984-988)。大多数微生物细胞催化潜手性酮不对称还原过程遵循Prelog规则，遵循反Prelog规则催化潜手性酮还原的微生物相对较少，主要包括Lactobacilluskefir、YamadazymafarinosaIFO10896、Mucorjavanicus、Pseudomonassp.、CandidaparapsilosisCCTCCM203011、TrigonopsisvariabilisAS2.1611等。因此，发掘新的遵循反Prelog规则的生物催化剂仍十分必要与迫切。

发明内容

本发明为了克服现有技术的至少一个不足，提供一株可用于制备光学纯手性醇的新菌种——短稳杆菌ZJUY-1401(EmpedobacterbrevisZJUY-1401)。其次提供该新微生物在不对称还原潜手性酮制备光学纯手性醇中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

短稳杆菌ZJUY-1401(EmpedobacterbrevisZJUY-1401)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCCNO:M2014520，保藏日期2014年10月29日。

该新菌株特征如下：

菌落形态：30℃在LB平板培养24h，菌落呈圆形，直径2～3mm，隆起或微隆起，黄色，边缘整齐，光滑有光泽。菌落随时间的延长而增大，数天后直径可达5mm以上。

细胞形态：16h培养物的细胞呈直杆状，0.8～1.2μm×1.8～8.0μm。无芽胞，无动力。

生理生化特征：革兰氏阴性，接触酶阳性，氧化酶、过氧化氢酶阳性。利用VITEK2Compact(GN)全自动细菌鉴定及药敏分析系统对该菌株生理生化特征鉴定结果见表1。

本发明所涉及的微生物是通过以下方法筛选得到的：

(1)称取从杭州及周边地区采集的土样1g加入到9ml0.85％的生理盐水中，在涡流振荡器上充分混匀。取上清1ml，加入到49ml富集培养基中，30℃，200rpm下培养48h，然后再取1ml培养基加入到49ml的富集培养基，30℃，200rpm下培养48h，如此进行三轮富集。富集培养基以1～3g/L苯乙酮为唯一碳源，其它组分如下(g/L)：(NH4)₂SO₄：5～15，MgSO₄·7H₂O：0.5～1，NaCl：1～1.5，K₂HPO₄：1～2，FeSO₄·7H₂O：0.01～0.03，以蒸馏水配制，用1.0M盐酸或NaOH溶液调节pH至6.0～8.0。

(2)最后一次富集培养液稀释后涂布到平板培养基上，挑取单菌落至斜面保藏。平板培养基及斜面培养基为富集培养基中加入1.5～2.0％的琼脂。

(3)挑取的单菌落接种到发酵培养基，组份如下(终浓度)：胰蛋白胨6～15g/L，酵母提取粉3～7g/L，NaCl5～10g/L，pH6.0～8.0(115℃下，灭菌30min)；25～35℃下，摇瓶转速150～200rpm，培养10～24h，离心后悬浮于磷酸缓冲液体系中，加入苯乙酮作为底物，进行转化。

(4)用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。

所用气相色谱仪为福立GC9790，手性毛细管气相色谱柱为Cyclodex-B。色谱条件为：进样量1.0l，进样口、检测器的温度均为240℃；载气为氮气。

苯乙酮、4’-甲基苯乙酮、4’-氟苯乙酮、4-溴苯乙酮、对氯苯乙酮、4-甲氧基苯乙酮、4-乙氧基苯乙酮、对硝基苯乙酮、间硝基苯乙酮、2’-溴苯乙酮、2,2,2-三氟苯乙酮和2,3’,4’-三氯苯乙酮的程序升温条件为：初始温度为60℃，以5℃/min的速度升到180℃，保持20min；苯丙酮和苯丁酮的程序升温条件为：100℃，保持5min，1℃/min升温至140℃。

本发明还涉及短稳杆菌ZJUY-1401在不对称催化潜手性酮制备光学活性手性醇中的应用。

具体的，所述的应用为：以潜手性酮(I)为底物，加入短稳杆菌ZJUY-1401经发酵培养获得的湿菌体细胞，以NADH或NADPH为辅酶，20～50℃下，于pH5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物。

其中，R₁和R₂为氢、烷基、卤代烷基、卤素、烷氧基和硝基。

具体的R₁和R₂可以为-H，-CH₃，-CH₂CH₃，-CH₂X，-CX₃，-X，-OCH₃，-OCH₂CH₃；X代表F，Cl，Br，OH，NO₂。

进一步，所述转化体系中底物初始浓度为5～100mmol/L。

进一步，所述转化体系中菌体的质量用量以菌体湿重计为100～400g/L。

进一步，转化体系中还包括有机共溶剂，有机共溶剂占转化体系总体积5～15％。加入有机共溶剂后，底物初始浓度为5～100mmol/L，菌体的质量用量以菌体湿重计为100～300g/L。

进一步，所述缓冲液的pH值为6.0～9.5。

进一步，所述有机共溶剂为乙醇、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇中的一种或多种，优选的为乙醇，反应体系中乙醇的浓度为10％。

进一步，所述转化反应液分离纯化方法为：反应结束后，将转化反应液离心，取上清液用等体积的乙酸乙酯萃取，有机层即为含相应手性醇的粗品，将粗品提纯即获得相应手性醇。所述粗品提纯的方法为本领域公知技术，通常为有机溶剂萃取、色谱分离和吸附分离等。

进一步，所述短稳杆菌ZJUY-1401湿菌体细胞可由如下方法制备得到：

(1)斜面培养：将短稳杆菌ZJUY-1401接种至斜面培养基，在30～35℃下恒温培养24～48h后，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成：胰蛋白胨6～15g/L，酵母提取粉3～7g/L，NaCl5～10g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为水，pH6.0～8.0。

(2)发酵培养：从斜面菌体上挑取一接种环菌体，接种至发酵培养基，在30～35℃、150～200rmp条件下振荡培养10～24h，培养结束后将发酵液离心，沉淀用生理盐水洗涤后，收集湿菌体细胞，获得湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成：胰蛋白胨6～15g/L，酵母提取粉3～7g/L，NaCl5～10g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为水，pH6.0～8.0。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一株高立体选择性、高活性不对称还原潜手性酮的新菌株，通过该菌株菌体不对称还原可制备高光学纯度的手性醇；本发明中所述菌株不对称还原制备手性醇具有显著优点，能够合成高光学纯度手性醇(ee_p>99％)，催化剂易于制备、反应条件温和、底物适应性广、环境友好，具有很好的工业化应用开发前景。

进一步的，反应体系中加入有机共溶剂，可以显著提高反应的活力和立体选择性。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为菌株CCTCCNO:M2014520的16SrDNA基因PCR扩增argrose电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：菌株的分离及鉴定

(1)分离

在9mL0.85％的生理盐水中加入1g土样，在涡流振荡器上充分混匀，使成均匀的土壤悬液，静置10min；吸取1.0mL的上清接种于装有49mL富集培养基的250mL三角瓶，置于30℃，200rpm的摇床培养48h，等富集液出现浑浊后，再吸取1.0mL转接到新鲜的富集培养基中，继续培养48h；如此进行三轮富集，将富集培养液稀释多个梯度后涂布到分离平板上，获得单菌落；

富集培养基以1g/L苯乙酮为唯一碳源，其它组成如下(终浓度)：(NH4)₂SO₄5g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，NaCl1g/L，K₂HPO₄2g/L，FeSO₄·7H₂O0.01g/L，以蒸馏水配制，用1.0M的盐酸或NaOH溶液调节pH至7.0；

挑取的单菌落接种到发酵培养基，组份如下(终浓度)：胰蛋白胨10g/L，酵母提取粉5g/L，NaCl10g/L，pH7.2；30℃下，摇瓶转速200rpm，培养24h，离心后悬浮于磷酸缓冲液体系中，加入苯乙酮作为底物，进行转化。用手性毛细管气相色谱法分析产物(R)-1-苯乙醇的对映体过量值(ee值)，ee值超过93％的，即为所述的微生物短稳杆菌ZJUY-1401。

(2)鉴定

菌落形态：30℃在LB平板培养24h，菌落呈圆形，直径2～3mm，隆起或微隆起，黄色，边缘整齐，光滑有光泽。菌落随时间的延长而增大，数天后直径可达5mm以上。

细胞形态：16h培养物的细胞呈直杆状，0.8～1.2m×1.8～8.0m。无芽胞，无动力。

生理生化特征：革兰氏阴性，接触酶阳性，氧化酶、过氧化氢酶阳性。利用VITEK2Compact(GN)全自动细菌鉴定及药敏分析系统对该菌株生理生化特征鉴定结果见表1。

表1短稳杆菌ZJUY-1401生理生化特征

注:+,阳性；-,阴性

16SrDNA序列鉴定：以提取到的细胞总DNA为模版，利用通用引物primerA27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和primerB

1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增菌株的16SrDNA基因，再将PCR产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图1。菌株ZJUY-1401经PCR扩增获得一段长约为1.4kb的片段，经测序确认该菌株16SrDNA的扩增产物实际长度为1386bp，序列如下：

该序列与GenBank中相关数据进行相似性分析，结果表明，菌株ZJUY-1401与短稳杆菌(Empedobacterbrevis)的部分菌株序列同源性较高。菌株ZJUY-1401与EmpedobacterbrevisNBRC14943(GenBank登记号为No.NR112974.1，序列同源性99％)、EmpedobacterbrevisLMG4011(GenBank登记号为No.NR042471.2，序列同源性99％)和EmpedobacterbrevisY7D(GenBank登记号为No.EU293154.1，序列同源性99％)的系统发育关系最近。

综合生理生化特征及分子生物学鉴定，确定该菌株为短稳杆菌(Empedobacterbrevis)，该菌株命名为短稳杆菌ZJUY-1401(EmpedobacterbrevisZJUY-1401)。

实施例2：菌株的培养

斜面培养基组成(终浓度)：胰蛋白胨10g/L，酵母提取粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂20g/L，用蒸馏水配制；

于平板上挑取短稳杆菌ZJUY-1401的单菌落，接种至斜面，于30℃恒温培养箱内培养24h后，放入4℃冰箱内保藏备用。

实施例3：湿菌体细胞的获得

培养基配制：胰蛋白胨10g/L，酵母提取粉5g/L，NaCl10g/L，用蒸馏水配制，pH7.2；

250mL摇瓶装液量20％，接种一环短稳杆菌CCTCCNO:M2014520，于30℃、200rmp振荡培养12h；培养结束后发酵液离心并用生理盐水洗涤两次，收集湿菌体细胞，于-20℃保存备用。

实施例4：短稳杆菌ZJUY-1401不对称还原苯乙酮

在1mL、100mM的磷酸盐缓冲液中(pH7.0)，加入0.25g实施例3中所得到的湿菌体细胞；再分别加入8mM苯乙酮和2.5mMNADH作为底物和辅酶。于30℃恒温摇床振荡(200rpm)反应。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(R)-1-苯乙醇的光学纯度95.1％，转化率76.2％。

实施例5：短稳杆菌ZJUY-1401不对称还原苯乙酮

在1mL、100mM的磷酸盐缓冲液中(pH7.0)，加入0.25g实施例3中所得到的湿菌体细胞；再分别加入8mM苯乙酮和2.5mMNADPH作为底物和辅酶。于30℃恒温摇床振荡(200rpm)反应。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(R)-1-苯基乙醇的光学纯度94.3％，转化率54.6％。

实施例6：短稳杆菌ZJUY-1401不对称还原苯乙酮

在900L、100mM的甘氨酸-NaOH缓冲液中(pH9.0)，加入100L无水乙醇，加入0.25g实施例3中所得到的湿菌体细胞；再分别加入10mM苯乙酮和2.5mMNADH作为底物和辅酶。于35℃恒温摇床振荡(200rpm)反应。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(R)-1-苯乙醇的光学纯度大于99％，转化率99.1％。

实施例7：短稳杆菌ZJUY-1401不对称还原苯乙酮

在900L、100mM的甘氨酸-NaOH缓冲液中(pH9.0)，加入100L甲醇，加入0.25g实施例3中所得到的湿菌体细胞；再分别加入10mM苯乙酮和2.5mMNADH作为底物和辅酶。于30℃恒温摇床振荡(200rpm)反应。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(R)-1-苯基乙醇的光学纯度96.0％，转化率63.8％。

实施例8：短稳杆菌ZJUY-1401不对称还原苯乙酮

在900L、100mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中(pH6.0)，加入100L乙醇，加入0.25g实施例3中所得到的湿菌体细胞；再分别加入8mM苯乙酮和2.5mMNADH作为底物和辅酶。于30℃恒温摇床振荡(200rmp)反应。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(R)-1-苯乙醇的光学纯度大于99％，转化率91.8％。

实施例9-21：短稳杆菌ZJUY-1401不对称还原潜手性酮

在900L、100mM的甘氨酸-NaOH缓冲液中(pH9.0)，加入100L乙醇，加入0.3g实施例3中所得到的湿菌体细胞；再加入10mM苯乙酮和2.5mMNADH分别作为底物和辅酶。于35℃恒温摇床振荡(200rpm)反应。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物光学纯度及转化率如下表所示。

虽然本发明已由较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟知此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求书所要求保护的范围为准。

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