抗凝血药磺达肝癸钠五糖中间体的制备方法

摘要

本发明公开了一种抗凝血药磺达肝癸钠五糖中间体的制备方法，采用新的合成方法制备单糖片段A,B,C,D，缩短了合成步骤。同时，主要选取合适的保护基对羟基及羧酸进行保护，有利于后期立体专一性地实现糖苷化，得到所需的苷键类型；另外，上述多个保护基团可在一锅中进行脱除，节约了合成步骤。该制备路线实用，操作方便可行。

说明书

技术领域

本发明涉及一种治疗血栓性疾病的药物中间体的制备方法，尤其涉及抗凝血药磺达肝癸钠五糖中间体的制备方法。

背景技术

血栓性疾病是现代社会发病率最高的重大疾病之一。其中由外科手术、创伤(如大范围或下肢的创伤)、急性内科疾病(如心肌梗死、脑卒中)、癌症治疗(如激素治疗、化疗、放疗)等诱发的静脉血栓目前已成为继急性冠脉综合征与脑卒中之后的第三大心血管疾病，严重威胁人类健康。目前对于静脉血栓的预防与治疗主要以抗凝为主。以普通肝素和华法林为代表的传统抗凝药物因在临床使用中存在不同程度的缺陷而逐步被新一代抗凝药物所替代。磺达肝癸钠(fondaparinux,GSK)以Xa因子为主要靶点，是目前唯一上市的人工合成肝素类寡糖抗凝药物，主要用于预防静脉血栓栓塞。其结构中含5个单糖，化学结构如下所示。

与传统抗凝血药物肝素相比，磺达肝癸钠具有明显优越性：1)在预防重要脏器手术和骨手术后凝血、心梗及心肌缺血导致死亡方面的临床效果均优于肝素；2)作为高选择性Xa因子抑制剂，其作用机理不涉及血小板活化，因此出血风险等副作用明显降低；3)以依诺肝素为代表的低分子量肝素主要来源于猪小肠提取的普通肝素解聚，其结构无法明确表征，且受原料供应限制。而磺达肝癸钠为纯化学合成制得的单一化合物，分子量确定，质量和品质较生物制品肝素易于控制。基于以上优点，自其上市以来，磺达肝癸钠在肝素类抗凝血药物市场中一直占据重要地位(Ann.Pharmacother.2003,37,1632)。

然而，作为完全依靠化学合成的抗凝药物，磺达肝癸钠结构复杂，合成极具挑战性。早期合成磺达肝癸钠主要通过先合成下式所示的五糖中间体(2)，再通过三氧化硫三甲胺磺化、催化氢化及三氧化硫吡啶磺化精制得到(Carbohydr.Res.1987,167,67)。

该五糖中间体需要经过近50步的化学合成得到，合成路线长、难度大、产品纯度不高。由此导致后续磺达肝癸钠的生产成本高昂，限制了其在临床上的广泛应用。

鉴于磺达肝癸钠的专利已于2008年到期，高效实现该药物的合成将具有巨大的市场潜力，其中高效、高立体选择性地合成磺达肝癸钠五个单糖片段和四个糖苷键，以及发展创新的片段连接策略是现阶段需要解决的关键技术问题。

发明内容

为克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种制备五糖中间体(2)的方法，包括如下步骤：ABCDE-1在碱性条件下水解得到五糖中间体(2)：

其中R为Bz，R’为Bn；或R为Ac，R’为Me。

作为优选，ABCDE-1的制备方法包括如下步骤：CDE-3与AB-2进行糖苷化反应得ABCDE-1：

作为进一步优选，糖苷化反应所用试剂为三氟甲磺酸(TfOH)；

作为优选，AB-2的制备方法包括如下步骤：A与B偶联得AB-1，进一步脱除硅醚保护基团得到AB-2：

作为进一步优选，A，B偶联在NIS/TfOH作用下进行，专一地形成α-糖苷键得到AB-1，后者进一步在氢氟酸吡啶的作用下脱除硅醚保护基团得到AB-2。

作为优选，CDE-3的制备方法包括如下步骤：CD-7与E偶联得到三糖产物CDE-1，脱除端基的叔丁基二甲基硅醚(TBS)保护后，与三氯乙腈在碱DBU作用下生成三氯乙酰亚胺酯CDE-3

作为优选，CD-7的制备方法包括如下步骤：CD-5脱去苄叉保护生成CD-6，选择性氧化伯醇为羧酸并进一步保护成苄基酯或甲酯得到CD-7

作为优选，CD-5的制备方法包括：CD-3脱掉两个对甲氧基苄基(PMB)保护基生成CD-4；CD-4分别用苯甲酰基或乙酰基保护得到产物CD-5

作为优选，CD-3的制备方法包括：C与D偶联，生成β-糖苷键产物CD-1，CD-1脱去Lev基团得到CD-2，CD-2裸露的OH用苄基保护得到CD-3：

本发明还提供如下结构所示的化合物，作为抗凝血药磺达肝癸钠五糖中间体：

上述化合物中R为Bz，R’为Bn；或R为Ac，R’为Me。

本发明中提及的各种基团或试剂的缩写为本领域通用的含义，例如，Bz为苯甲酰基，Bn为苄基，Ac为乙酰基；PMB为甲氧基苄基；TBS为叔丁基二甲基硅基；Lev为乙酰丙酰基；Tol为甲苯基；DBU为1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯，NIS为N-碘代丁二酰亚胺。

合成路线：

1.片段的制备

片段A：可通过现有技术中公开的文献进行制备，例如参考文献方法以D-葡萄糖胺盐酸盐为原料经8步反应制备(Chem.Med.Chem.2014,9,1071)。

片段B：从已知物式I经伯醇氧化为酸，进一步甲酯化得到式II化合物；后者再经叔丁基二甲基硅醚(TBS)保护而得。其中式I化合物可通过现有技术中公开的文献进行制备，例如参考文献方法以二丙酮-D-葡萄糖为原料经8步反应制备(MethodsCarbohydr.Chem.1972,6,286；J.Am.Chem.Soc.2004,126,476；Carbohydr.Res.2006,341,1619；J.Am.Chem.Soc.2007,129,12795.)。

片段C：从已知物式III经选择性对甲氧基苄基(PMB)保护而得。其中式III化合物可通过现有技术中公开的文献进行制备，例如参考文献方法以D-葡萄糖胺盐酸盐为原料经6步反应制备(Tetrahedron:Asymmetry2014,25,1450；Tetrahedron1999,55,9867；TetrahedronLett.2005,46,4337.)。

片段D：从已知物式IV经乙酰丙酰基(Lev)保护而得。其中式IV化合物可通过现有技术中公开的文献进行制备，例如参考文献方法以二丙酮-D-葡萄糖为原料经6步反应制备(Org.Lett.2012,14,2142；J.Am.Chem.Soc.2007,129,12795.)。

片段E：可通过现有技术中公开的文献进行制备，例如参考文献方法以D-葡萄糖胺盐酸盐为原料经7步反应制备(Eur.J.Org.Chem.2003,330；J.Am.Chem.Soc.2001,123,3153.)。

2.片段的连接及五糖中间体的制备

片段A与B在NIS/TfOH作用下进行偶联，专一地形成α-糖苷键得AB-1，收率67％。后者进一步在氢氟酸吡啶的作用下脱除硅醚保护基团得到AB-2。

片段C与D在NIS/TfOH作用下进行偶联，生成β-糖苷键产物CD-1，收率80％。CD-1在吡啶/醋酸混合溶液中与水合肼反应脱去Lev基团，裸露的OH保护为苄基得到CD-3，两步总收率70％。式CD-3化合物与DDQ反应，脱掉二糖分子中的两个对甲氧基苄基(PMB)保护基可生成CD-4。后者分别用苯甲酰基或乙酰基保护得到产物CD-5，进一步与三氟乙酸(TFA)反应脱去苄叉保护生成CD-6，两步收率分别为75％和78％。最终，偶联的前体物CD-7可由CD-6出发，通过选择性氧化伯醇为羧酸、并进一步保护成苄基酯或甲酯而得。

式CD-7化合物与片段E在三氟甲磺酸(TfOH)存在下进行连接，得到三糖产物CDE-1，产率分别为75％或85％。脱除端基的叔丁基二甲基硅醚(TBS)保护后，式CDE-2化合物与三氯乙腈在碱DBU作用下生成三氯乙酰亚胺酯CDE-3。上述所得的糖基供体与AB片段(式AB-2化合物)在三氟甲磺酸(TfOH)条件下进行糖苷化得ABCDE-1，该步收率为65％或57％。最终，在碱性条件下，式ABCDE-1化合物水解直接可制备得五糖中间体(2)，其参考文献方法(Carbohydr.Res.1987,167,67)可合成磺达肝癸钠。

本发明的优点在于：采用新的合成方法制备单糖片段A,B,C,D，缩短了合成步骤。同时，主要选取苄基和苯甲酰基等对羟基及羧酸进行保护，有利于后期立体专一性地实现糖苷化，得到所需的苷键类型；另外，上述多个保护基团可在一锅中进行脱除，节约了合成步骤。该制备路线实用，操作方便可行。

具体实施方式

总体来讲，本发明分为单糖的制备、单糖片段连接以及五糖中间体的合成三个阶段，大致的合成策略如下：

为清楚描述本发明所涉及的各化合物在合成路线中的位置和作用，以下对本发明以及各产物的合成路线进行简要描述：

实施例1、单糖中间体B的制备

化合物I(2.4g,5mmol)溶于60mL二氯甲烷和30mL水配成的混合溶剂，加入四甲基哌啶氮氧化物(156.25mg,1mmol)和醋酸碘苯(4.0g,12.5mmol)，于室温下搅拌，待氧化完全后，用饱和亚硫酸钠水溶液20mL淬灭反应，盐酸调节pH至弱酸性，分液，二氯甲烷萃取水相(20mLx4)，合并有机相干燥，旋干溶剂，产物为糖浆状。

上一步得到的产品在油泵上抽0.5h后，加入碳酸钾(1.4g,10mmol)，用干燥丙酮50mL溶解，在冰浴和氮气保护条件下加入硫酸二甲酯(660uL,7mmol)，逐渐升至室温反应过夜，反应结束后用1M盐酸调节pH至中性，二氯甲烷萃取(20mLx4)，合并有机相，硫酸镁干燥，过滤，旋干，硅胶柱层析得到2.5g化合物II。两步合并收率80％。

化合物II(5.2g,10.2mmol)与2,6-二甲基吡啶(4.5mL,40.8mmol)在氮气保护下用50mL干燥二氯甲烷溶解，于室温下搅拌0.5h后，降至0℃，缓慢加入叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯(2.6mL,11.22mmol)，室温下反应过夜，TLC监测反应结束后用20mL碳酸氢钠饱和液淬灭，分液，二氯甲烷萃取(10mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，柱层析(PE：EA＝20:1)分得5.53g单糖中间体B(黄白色固体)，产率86％。

实施例2、单糖中间体C的制备

化合物III(60g,188mmol)用甲苯(1000mL)溶解，加入二丁基氧化锡(93.7g,376mmol)，加装分水器，缓慢加热至回流分水(130℃左右)，此状态下反应5h后撤去油浴。降至室温，缓慢加入对甲氧基苄基氯(63.8mL,470mmol)和四丁基碘化铵(34.7g,94mmol)，90℃左右反应3h。反应液降至室温，静置过夜，四丁基碘化铵析出。500mL水洗有机相3次，合并的水相以乙酸乙酯洗两次。合并有机相，以无水硫酸钠干燥有机相，过滤浓缩，得到粘稠油状残留物，以硅胶拌样，柱层析得到73g淡黄色油状产物C，产率70％。

实施例3、单糖中间体D的制备

化合物IV(200mg,1.0eq)和乙酰丙酸(4.8mL，1.1eq)用二氯甲烷溶解后，依次加入4-二甲氨基吡啶(5mg,0.1eq)和二环己基碳二亚胺(130mg,2.0eq)，室温下反应，TLC监测完全后冰浴下加入碳酸钠至pH中性，加入适量二氯甲烷，饱和食盐水洗涤2次，合并水相，二氯甲烷萃取3次，合并有机相，加入无水Na₂SO₄干燥，蒸干溶剂。粗品用石油醚/乙酸乙酯体系重结晶，得232mg单糖中间体D，收率96％。

实施例4、二糖中间体AB-2的制备

将单糖中间体A(350mg,0.67mmol)、B(380mg,0.61mmol)、分子筛200mg和N-碘代丁二酰亚胺(180mg,0.79mmol)在氮气保护下用15mL二氯甲烷溶解，室温下搅拌1h后降至-40℃，然后加入三氟甲磺酸(70μl,0.79mmol)搅拌，反应约1h后加三乙胺(210μl)淬灭反应。滤除分子筛，分别用饱和亚硫酸钠水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液各20mL洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，柱层析(PE：EA＝10：1)分得二糖中间体AB-1(400mg),产率约67％。

化合物AB-1(200mg,0.2mmol)在塑料瓶中用氢氟酸吡啶(1mL,70％HF)溶解，室温下搅拌约1h后，加入10mL二氯甲烷稀释，碳酸氢钠淬灭，然后分液，二氯甲烷萃取水层(10mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，柱层析(PE：EA＝2：1)，分得二糖中间体AB-2约160mg，产率约90％。ESI/MS+(m/z):905.33。

实施例5、二糖中间体CD-7的制备

将单糖中间体C(22mg,1.0eq)、D(26.5mg,1.2eq)、分子筛和N-碘代丁二酰亚胺(18mg,2.0eq)用5mL二氯甲烷溶解，室温下搅拌1小时后转移至-40℃，缓慢滴入三氟甲磺酸(0.69uL,0.2eq)，TLC监测原料消失后，加入三乙胺淬灭反应。滤除分子筛后，抽干溶剂，直接柱层析得31mg二糖中间体CD-1，收率80％。

二糖CD-1(158mg,1.0eq)溶于4.5mL吡啶和1.5mL醋酸组成的混合溶剂中，室温下加入水合肼(15.4uL,2.0eq)搅拌约1小时后反应完全。用稀盐酸洗涤反应液3次，再用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤2次，二氯甲烷萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽干溶剂，粗品CD-2直接投入下一步反应。

将二糖CD-2粗品(138mg,1.0eq)用二甲基甲酰胺溶解，0℃下加入溴化苄(55uL,3.0eq)和四丁基碘化铵(12mg,0.2eq)，室温反应30min，移至冰浴，加入氢化钠(20mg,3.0eq)室温继续搅拌约1h。冰浴下加水淬灭，二氯甲烷萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽干溶剂，柱层析纯化得CD-3(125mg)，两步总收率约80％。

将二糖中间体CD-3(4.93g,1.0eq)用二氯甲烷/水(10：1)的混合溶剂溶解后，加入二氯二氰基对苯醌(2.8g,2.5eq)，室温反应半小时。冰浴下倾入饱和亚硫酸钠水溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽干溶剂，柱层析纯化得CD-4(3.0g)，收率约81％。

1)当R为Bz，R’为Bn时，制备过程如下：

将二糖中间体CD-4(2.6g,1.0eq)、苯甲酸酐(4.7g,6.0eq)和4-二甲氨基吡啶(0.21g,0.5eq)用干燥甲苯溶解后，于110℃下搅拌过夜。反应液降至室温后，加水淬灭，二氯甲烷萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽干溶剂得CD-5，直接用于下一步反应。

将二糖CD-5粗品(3g,1.0eq)用二氯甲烷/水(10：1)的混合溶剂溶解后，于0℃下加入三氟醋酸5mL,缓升至室温反应过夜。用水将反应液洗涤3次，收集的有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤2次，水相用二氯甲烷反萃2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽干溶剂，柱层析纯化得CD-6(2.26g)，两步收率约75％。

将二糖CD-6(2.3g,1.0eq)用二氯甲烷/水(2：1)混合溶剂溶解，再加入四甲基哌啶氮氧化物(83mg,0.2eq)和醋酸碘苯(2.13g,2.5eq)，室温下反应约2h，用饱和亚硫酸钠水溶液淬灭，盐酸调节pH至弱酸性，二氯甲烷萃取3次，合并有机相干燥，抽干溶剂，粗品直接用于下一步反应。

将粗产物用干燥丙酮溶解后，加入碳酸钾(0.55g,1.5eq)，溴化苄(1.25mL,4.0eq),三乙胺(0.37mL,1.0eq)，于60℃下反应1h。反应液抽干后加水，用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽干溶剂，用PE：EA柱层析分离得到CD-7(2.39g)(R为Bz)。两步总收率93％。ESI/MS+(m/z):973.38。

2)当R为Ac，R’为Me时，制备过程如下：

将二糖中间体CD-4(6.0g,1.0eq)，溶于282ml干燥甲苯与乙酸酐的混合溶剂中[乙酸酐/甲苯(V/V)＝1/8]，加入4-二甲氨基吡啶(490mg，0.5eq)，60℃～70℃下加热搅拌。反应完全后，反应液降至室温，50℃下减压旋出甲苯，二氯甲烷溶解残留物，水洗有机相2次，合并水相，水相以二氯甲烷萃取2次，乙酸乙酯萃取1次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽干溶剂得CD-5，直接用于下一步反应。

将二糖CD-5粗品(6.1g,1.0eq)用二氯甲烷/水(10：1)的混合溶剂溶解后，于0℃下加入三氟醋酸10mL,缓升至室温反应过夜。用水将反应液洗涤3次，收集的有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤2次，水相用二氯甲烷反萃2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽干溶剂，柱层析纯化得CD-6(5.0g)，两步收率约78％。

将二糖CD-6(4.6g,1.0eq)用二氯甲烷/水(2：1)混合溶剂溶解，再加入四甲基哌啶氮氧化物(193mg,0.2eq)和醋酸碘苯(4.95g,2.5eq)，室温下反应约2h，用饱和亚硫酸钠水溶液淬灭，盐酸调节pH至弱酸性，二氯甲烷萃取3次，合并有机相干燥，抽干溶剂，粗品直接用于下一步反应。

将粗产物用干燥丙酮溶解后，加入碳酸钾(1.02g,1.2eq)和硫酸二甲酯(1.25mL,4.0eq)，于室温反应。待原料消失完全后，反应液抽干、加水，用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽干溶剂，用PE：EA柱层析分离得到CD-7(R为Ac)(3.1g)。两步总收率65％。ESI/MS+(m/z):773.32。

实施例6、三糖中间体CDE-3的制备

1)当R为Bz，R’为Bn时，制备过程如下：

将二糖CD-7(2.37g,1.0eq)和单糖中间体E(2.0g,1.3eq)置于干燥的圆底烧瓶中，依次加入分子筛和干燥甲苯(22mL)，于室温下搅拌30min后，移至-40℃低温下，缓慢滴入三氟甲磺酸(85.0uL,0.4eq)，保持该温度搅拌2h。反应完全后，加入三乙胺淬灭反应，滤除分子筛后，抽干溶剂，直接柱层析得CDE-1(2.63g)，收率75％。

将三糖CDE-1(3g)用6mL乙腈溶解，冰浴下滴入氢氟酸吡啶(2.4mL)，室温下反应1h。加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取(10mL′3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽干溶剂，柱层析纯化得CDE-2(2.21g)，收率80％。

将底物CDE-2(1.65g,1.0eq)置于干燥的圆底烧瓶中，抽换N₂后，加入10mL干燥乙腈和1.5mL三氯乙腈,于室温搅拌5min后移至冰浴下，缓慢加入DBU(100uL,0.6eq),升至室温继续反应。待反应完全后抽干溶剂，柱层析分离得CDE-3(1.55g)，收率85％。ESI/MS+(m/z):1473.38。

2)当R为Ac，R’为Me时，制备过程如下：

将二糖CD-7(2.45g，1.0eq)和单糖中间体E(2.6g,1.3eq)置于干燥的圆底烧瓶中，依次加入分子筛和干燥甲苯，于室温下搅拌30min后，移至-40℃低温下，缓慢滴入三氟甲磺酸(57uL，0.2eq)，保持该温度搅拌2h。反应完全后，加入三乙胺淬灭反应，滤除分子筛后，抽干溶剂，直接柱层析得CDE-1(3.3g)，收率85％。

将三糖CDE-1(3g)用乙腈溶解，冰浴下滴入氢氟酸吡啶(6mL)，室温下反应5h。加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽干溶剂，柱层析纯化得CDE-2(2.3g)，收率84％。

将底物CDE-2(2.1g,1.0eq)置于干燥的圆底烧瓶中，抽换N₂后，加入干燥乙腈和4mL三氯乙腈,于室温搅拌5min后移至冰浴下，缓慢加入DBU(100uL,0.4eq)，升至室温继续反应。待反应完全后抽干溶剂，柱层析分离得CDE-3(1.8g)，收率77％。ESI/MS+(m/z):1273.32。

实施例7、五糖中间体ABCDE-1的制备

1)当R为Bz，R’为Bn时，制备过程如下：

将三糖CDE-3(257mg,1.0eq)和二糖AB-2(142mg,0.9eq)置于干燥圆底烧瓶中，加入适量分子筛和干燥甲苯12mL于室温下搅拌30min后，移至-40℃下，缓慢滴入三氟甲磺酸(6.0uL,0.4eq)保持该温度搅拌至反应完全后，加入三乙胺淬灭反应，滤除分子筛后，抽干溶剂，直接柱层析得ABCDE-1(226mg),收率65％。ESI/MS+(m/z):2217.79。

2)当R为Ac，R’为Me时，制备过程如下：

将三糖CDE-3(1.5g，1.0eq)和二糖AB-2(1.06g，1.0eq)置于干燥圆底烧瓶中，加入适量分子筛和干燥甲苯于室温下搅拌30min后，移至-40℃下，缓慢滴入三氟甲磺酸(21uL，0.2eq)保持该温度搅拌至反应完全后，加入三乙胺淬灭反应，滤除分子筛后，抽干溶剂，直接柱层析得ABCDE-1(1.15g)，收率57％。ESI/MS+(m/z):2018.73。

实施例8、五糖中间体(2)的制备

将五糖中间体ABCDE-1(R为Bz，R’为Bn)(70mg,0.03mmol)用四氢呋喃(3mL)溶解后，于-5℃下依次加入双氧水(30％，1.5mL)和氢氧化锂水溶液(1.25M，0.72mL)，升至室温反应16h，再往反应液中加入甲醇(1.8mL)和氢氧化钠水溶液(4M,0.9mL)，升温至35℃下继续反应待水解完全。冰浴下用稀盐酸溶液调节pH至弱酸性，用二氯甲烷萃取(6mLx2)后，合并有机相用10％亚硫酸钠洗涤(6mLx2)，再合并水相，用二氯甲烷继续萃取至少8次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥后，蒸干溶剂，用反相C-18硅胶装柱纯化(洗脱剂梯度为CH₃CN:H₂O＝1:9→11:9→7:3)，粗品用异丙醇：正己烷：乙酸乙酯＝1:2:0.2混合溶剂重结晶得到五糖中间体(2，32mg)，收率65％。ESI/MS+(m/z):1593.60。

将五糖中间体ABCDE-1(R为Ac，R’为Me)(64mg,0.03mmol)用四氢呋喃溶解后，于冰浴下依次加入双氧水(30％，1.5mL)和氢氧化锂水溶液(1.25M，0.72mL)，升至室温反应16h，再往反应液中加入甲醇(1.8mL)和氢氧化钠水溶液(4M,0.9mL)，升温至35℃下继续反应待水解完全。冰浴下用稀盐酸溶液调节pH至弱酸性，二氯甲烷萃取2次后，有机相用10％亚硫酸钠洗涤2次，再合并水相，用二氯甲烷继续萃取至少8次。合并有机相，无水硫酸钠干燥后，蒸干溶剂，反相C-18硅胶柱纯化，粗品重结晶得到五糖中间体(2，29mg)，收率60％。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。