一种抗嗜水气单胞菌相关的中华鳖微卫星序列及其应用

摘要

本发明涉及一种抗嗜水气单胞菌相关的中华鳖微卫星序列及其应用，其核苷酸序列分别为SEQ？ID？NO.1，引物序列为SEQ？ID？NO.2和SEQ？ID？NO.3，本发明开发出了一种适用于抗嗜水气单胞菌中华鳖个体筛选的微卫星序列及引物，本发明人还基于微卫星的核酸序列设计了特异性的引物，且本发明发现该微卫星分子标记和中华鳖抗嗜水气单胞菌的能力相关，通过基因型分析的方式可筛选出中华鳖抗嗜水气单胞菌个体，本发明的微卫星位点具有高度多态性和稳定性，可进一步应用于中华鳖分子辅助育种。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及一种中华鳖抗嗜水气单胞菌微卫星位点及其应用。

背景技术

中华鳖，又称甲鱼、王八、水鱼、元鱼、团鱼、脚鱼和老鳖，英文名ChineseSoft-shelledTurtle,拉丁文名(Pelodiscussinensis)，中国除宁夏、新疆、青海及西藏未见报道外，其余各省、市、自治区均有分布，以长江流域和华南地区为多见；国外分布于日本、朝鲜和越南。中华鳖由于其药用价值和营养价值，长期被大量消耗，而品种是中华鳖养殖的物质基础之一(品种、饲料、水质)，良种的选择和育种是增产的有效途径，同时也可以间接起到节能减排的作用。一般认为，在其它条件相同的情况下，使用优良品种可增产20～30％，因此要发展“高产、优质、高效”的中华鳖养殖业，对良种的选育应该引起足够的重视。遗传改良或品种培育是中华鳖养殖发展的动力，研究表明，遗传变异水平与生物的生长速度、抗嗜水气单胞菌能力与生产性状密切相关，因此，本发明欲建立一种筛选方式，将中华鳖抗嗜水气单胞菌基因内部的微卫星标记用于快速检测多个样本，微卫星标记的基本原理是根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率，再通过关联分析判断其抗嗜水气单胞菌能力，应用与抗嗜水气单胞菌关联分析，进一步应用于分子辅助育种。

分子标记辅助选育(MAS)是遗传育种中的重要环要节之一，它的原理是根据与某一性状紧密相连的分子标记的出现来对目标性状的基因型进行选择，MAS在鉴定优良亲本，筛选早期优良性个体，加快育种进程中发挥了重要作用。微卫星标记由于具有多态性丰富、遵循孟德尔分离定律，共显性遗传、易于PCR扩增、条带易于识别等多种优点成为开发的首选。微卫星(Microsatellites)又称简单序列重复序列(Simplesequencerepeats，SSR)，是真核生物基因组中广泛分布的简单重复DNA片段，一般由2～6个核苷酸为基本单位组成，其中，最常见的是双核苷酸重复，如((AC/TG)n及(AG/TC)n。不同的生物个体由于基本单位重复次数的不同以及重复程度的不完全形成了微卫星位点的长度多态性而显示出多态性。研究表明，可能是DNA复制过程中的“链滑(strandslippage)现象造成微卫星DNA多态性信息容量(polymorphicinformationcontent，PIC)较高。微卫星DNA的高突变性、共显性表达及其在真核生物基因组中的普遍性，目前己被广泛用于遗传多样性分析，亲缘关系鉴定，连锁图谱构建，功能基因定位，分子标记选育等研究领域，由于每个微卫星两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据其两端设计特异性引物，通过PCR技术来扩增相应位点的微卫星序列，再经电泳分析，即可显示不同个体基因型微卫星的多态性，而且，微卫星在基因组中分布密度很大，表现出高度的多态性和共显性遗传，能为种质资源的保护、合理的人工增养殖、人工放流方案的制定提供评价依据。因此，从中华鳖中分离多态性微卫星抗嗜水气单胞菌位点就成为上述工作的基础。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种中华鳖抗嗜水气单胞菌相关微卫星位点及引物,即提供1对与抗嗜水气单胞菌相关的微卫星位点,以及相应的多态性微卫星引物，从而为中华鳖筛选抗嗜水气单胞菌的相关个体选育提供分子标记。

本发明所要解决的另一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种微卫星位点为分子标记在中华鳖抗嗜水气单胞菌筛选中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种抗嗜水气单胞菌相关的中华鳖微卫星序列，核苷酸的序列为SEQIDNO：1。

本发明还提供了上述抗嗜水气单胞菌相关的中华鳖微卫星序列设计的微卫星引物对，其序列分别为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3，其中

上游引物的核苷酸序列SEQIDNO.2为：F:AGCAGCCCAACCCTATTGAC；

下游引物的核苷酸序列SEQIDNO.3为：R:TGCCTGGGTGCAACTTGTAA。

本发明还提供了一种应用，该应用不用于疾病的诊断和治疗，其应用步骤为：

1)基因组DNA的提取：使用基因组DNA提取试剂盒从中华鳖群体中分别提取基因组DNA作为扩增的模板；

2)微卫星PCR扩增：利用该微卫星引物对对基因组DNA进行PCR扩增；

3)扩增产物电泳：采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法及银染法检测微卫星扩增产物；

4)检测：通过检测不同个体中微卫星位点的电泳结果进行多态性分析，中华鳖群体中至少存在五个等位基因，分别是153bp、165bp、177bp、185bp、201bp，其中153bp处等位基因在中华鳖抗嗜水气单胞菌群体中表达具有特异性，该微卫星位点可作为筛选抗嗜水气单胞菌中华鳖个体的分子标记。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明开发出了一类适用于中华鳖抗嗜水气单胞菌的微卫星序列，本发明人还基于微卫星的简单重复序列设计了特异性的引物，且本发明发现该微卫星位点分子标记与中华鳖抗嗜水气单胞菌的性状相关，通过基因型分析的方式可筛选出中华鳖抗嗜水气单胞菌个体，本发明个微卫星位点具有高度多态性和稳定性，可进一步应用于中华鳖分子辅助育种

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1嗜水气单胞菌攻毒的方法的建立

1、实验样品采集

选取200g/只的中华鳖黄河群体，用嗜水气单胞菌T4菌株做攻毒处理，最先死亡的50只为易感群体，最后死亡的50只为抗嗜水气单胞菌群体(其中抗嗜水气单胞菌的鳖用细菌注射了5-6次依然很活跃)。屠宰后取其肌肉组织-80℃保存。

2、试验方法

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)T4菌株由南京农业大学陆承平教授惠赠。T4菌株复壮后接种于普通营养琼脂培养基，28℃恒温培养12h(OD600<1.0)，用灭菌生理盐水洗下菌体，平板计数并稀释到4×10⁸cfu/mL，用1.0×10⁸cfu/50g体重浓度对中华鳖进行攻毒。

中华鳖经20天预饲养后，进行T4菌半致死量确定，所用菌液浓度为：1.0×10⁷CFU/mL、5.0×10⁷CFU/mL、1.0×10⁸CFU/mL、5.0×10⁸CFU/mL、1.0×10⁹CFU/mL和5.0×10⁹CFU/mL，对照组注射等量的生理盐水。注射剂量为1mL，每个浓度梯度10只中华鳖，共70只，统计攻毒10天后各组的死亡数。用半致死量浓度对养殖于30个水族箱的600只健康中华鳖注射。实验间隔时间10d，对照组注射等体积无菌生理盐水(0.9％NaCl)。日换水率20％，连续观察实验鳖的活动情况，以身体僵直、碰触无反应为死亡评判标准；以趴在料台上不动，反应迟缓作为嗜水气单胞菌鳖的判断标准。每日观察两次，及时取出死亡个体，以分成易感组和抗嗜水气单胞菌组。每只中华鳖单独进行采样，取肌肉组织冷冻保存，以备后续的DNA提取。经过攻毒后，按照中华鳖死亡的顺序进行排号，易感的个体发生了严重的炎症反应，肠道大量充血，背甲和腹甲发生穿孔，鼻腔内流血，这些是嗜水气单胞菌感染的典型症状。经过连续4次攻毒后还剩下51只完好的中华鳖，这些中华鳖体表光滑无伤，行动活泼，解剖后肠道没有发生明显的充血，肠道中可见有食物，作为抗嗜水气单胞菌组。同时根据抗嗜水气单胞菌中华鳖的数量，选择最早感染嗜水气单胞菌发病的51只中华鳖为易感组。

实施例2微卫星位点的获得以及引物设计

1、易感组和抗嗜水气单胞菌组中DNA的抽提

采用DNA的酚抽提和乙醇沉淀法：

(1)取0.025g中华鳖肌肉样品，放入1.5mL离心管中。加入100mLSTE裂解缓冲液，在冰上用眼科小剪刀剪碎，再补加400mLSTE裂解缓冲液，50μLSDS(10％)，5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后放入56℃消化4h，期间1h混匀一次。直至裂解液澄清。

(2)加入酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)500mL，抽提10min，在12000rpm条件下离心10min。

(3)取离心后的上清液，重复上述步骤一次，直至水相与有机相间无蛋白质层。

(4)取离心后的上清液加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)500μL，抽提10min，12000rpm离心10min。

(5)取上清液加入50μLNaAc(3M)，1000μL冷无水乙醇缓慢摇匀，可见丝状DNA析出。放入-20℃冰箱10min，使DNA充分析出。13000rpm离心10min。

(6)小心的弃去上清液，用100070％乙醇洗涤沉淀，10000rpm下离心5min，重复一遍。

(7)吸出乙醇，通风干燥3-5min。

(8)加入50μL灭菌双蒸水，轻弹至DNA全部溶解，放在-20℃冰箱中保存备用。

(9)提取好的DNA需要用1％琼脂糖电泳检测其纯度。

(10)采用微量核酸测定仪检测样本DNA的浓度和纯度，并稀释到100ng/μL，-20℃保存。

2、微卫星位点的筛选及引物的获得

对于采用微卫星位点为遗传标记的种群遗传学研究，选择出合适的微卫星位点显得尤为重要。首先，其单元结构要求简单，因为结构复杂(重复的碱基多，或者有其非重复碱基的插入)将会对后续分析带来一定的偏差；其次，微卫星位点所在的位置应该远离基因编码区，如果处于或接近基因编码区，这些位点就可能会在种群的传代过程中丢失，不能真实地反映群体的遗传特征；第三，所选取的微卫星位点原始序列要具有高度的特异性。此外，在被研究样本大小的选择上也有很高的要求，如果选取的样本数量太小，可能会失去一些等位基因，从而给样本之间遗传差异的计算带来偏差。因此，合适的微卫星位点的选择需要经过大量的分析和试验工作。而引物选择主要是考虑以下几个方面，首选是确定引物的多态性，并参考以下标准：应为公共所有，微卫星座位间不连锁，微卫星座位遗传符合孟德尔遗传规律，每个微卫星座位至少应有4个等位基因。此外，综合考虑微卫星座位的引物序列组成，多态性和产物大小等多方面因素。从基因组数据库获取初始数据，并经过如下原则的筛选：a)3-4个碱基重复(例如CGG，TACC)；b)各位点不包含复杂结构；c)序列为中华鳖基因组特异；d)微卫星的重复次数在10-25次；e)位点所处的位置应该远离编码区。

本发明人经过转录组测序(RNA-seq)即高通量RNA测序，这种测序方法是将物种总的RNA进行反转录合成cDNA，将其打断并连接特异接头，将己连接了接头的DNA片段结合在含有接头的芯片上并固定，每条分子经扩增成为一个单分子簇测序模板，加入不同荧光标记的脱氧核苷酸，采用边合成边测序法测序，转录组测序具有通量高、精度高、覆盖范围广等特点，能够在单核苷酸水平检测任意物种的整体转录活动，还可以发现未知转录本及稀有转录本，另外，转录组测序具有很高的检测通量，对于基因组和转录组信息都比较缺乏的物种，通过转录组测序，不仅能提供大量的候选功能基因，同时也是快速获得大量基因序列资源的新方法，可为SSR、SNP等分子标记的开发提供丰富的序列基础。

因此，本发明人对上述中华鳖进行高通量转录组测序，并进行微卫星序列搜索，然后针对每一个微卫星位点设计微卫星引物；对上述获得的微卫星引物进行预扩增及多态性引物筛选，其中筛选条件是微卫星序列长度最短为15bp，产物大小介于150bp到350bp之间，预扩增模板DNA来自于上述健康中华鳖样品的基因组DNA，然后进行PCR扩增，并通过温度梯度来确定引物的最佳退火温度，接着在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行EB染色(溴化乙锭染色法)，凝胶成像系统拍摄电泳图后读带，从而筛选出具有多态性的引物。

本发明人通过转录测测序发现了包含SEQIDNO：1所示的微卫星序列和位点——然后对该位点进行引物设计——筛选出多态性引物——分析引物在抗菌群体和易感群体中的表达——筛选出两个群体中有差异的等位基因位点——最终确定目标微卫星位点及特异性等位基因，其中，引物序列如表1。

表1抗嗜水气单胞菌相关微卫星引物情况

实施例3对中华鳖微卫星位点进行PCR扩增

用以下条件对易感组和抗嗜水气单胞菌组的DNA进行扩增：具体见表2和表3

表2PCR扩增体系

表3PCR扩增条件

实施例4对中华鳖微卫星位点进行PCR扩增的产物进行检测

根据制胶材料的不同，常用的电泳可分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者比后者的分辨能力低，但分离范围广，可分离200bp-50kb的DNA。非变性聚丙烯酰胺凝胶一般用于分离5-500bp的小片段，可分离相差lbp的DNA片段，但制备过程较为复杂。PCR扩增之后的产物，首先用1.5％琼脂糖凝胶检测，如果扩增效果好的再采用非变性聚丙烯酰胺凝胶检测，并进行银染。具体步骤如下：

(1)称取1g琼脂糖粉末，在电炉上用100mL蒸馏水溶解至特明状。

(2)组装好制胶器，并调至水平。待溶液冷却到60℃时(放于掌心，能感觉到烫但又能忍受)，将胶倒于制胶器中，插好梳子。40min胶冷却凝固后，就可放于倒好电泳缓冲液的电泳槽中进行点样。

(3)取2μL样品溶液，加1μL6×loadingbuffer，混合均匀后进行点样。每排点样孔要点一个3μL的Marker。

(4)点完后，调整电泳仪各参数进行电泳：U：120V；A：100mA；T：40min。

(5)电泳结束，凝胶成像系统观察结果。非变性聚丙烯酰胺凝胶步骤如下：

(1)用自来水洗干净制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗最后用无水乙醇擦一遍。烘干后，用橡胶绳封闭玻璃板间的缝隙，并用夹子夹住。

(2)在100mL小烧杯内加入12％丙烯酰胺35mL，10％APS467μL，TEMED23.3μL，用玻璃棒搅匀，立即灌胶(从一侧缓缓地加入)，插入梳子，梳齿下不得存有气泡，胶板与桌面夹角小于10°。放置，常温聚合30～60min。

(3)凝胶聚合后向电泳槽加入1×TBE，用注射器排除点样孔中的气泡，并弄出点样孔中的堵塞的胶，160V预电泳10min，准备上样。

(4)取1μL上样buffer与2μLPCR产物于干净的PE手套，用移液枪反复吹打3-4次，以便充分混合均匀，用移液枪上样。

(5)接160V电压，根据溴酚蓝指示剂的位置，确定电泳时间。一般电泳8h。

(6)电泳结束小心的取下玻璃板，在玻璃板左右边划一下，小心取下胶。将胶放在蒸馏水中冲洗一下。

(7)往白瓷盘中加入500mL染色液，摇床上80转/min轻摇10min。将染色液倒回瓶中(可重复使用2-3次)。

(8)小心地取出胶，在蒸馏水中冲洗一下，再放在显影液中，80转/min显影3min。

(9)拿出胶放在蒸馏水中终止反应。

(10)把显影好的胶放在凝胶成像系统中拍照，保存图片。

实施例5抗嗜水气单胞菌相关微卫星位点的判定及统计分析

等位基因频率指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。由于微卫星呈共显性遗传，所以对测得的基因型进行统计计算即可获得等位基因频率，通过获得等位基因后计算等位基因的频率，再比较等位基因频率在中华鳖中的分布差异。

其中，每一个微卫星引物都事先检测46个样品，其中抗嗜水气单胞菌组和易感组各一半，分析基因频率在两组间是否显著。对于存在显著差异的微卫星位点再进行扩大规模检测。对于有疑问的位点，则电泳进行再次验证。检测完一个位点后，把该位点所有的等位基因(不同长度的片段)在同一块凝胶上电泳，统计该微卫星位点上各等位基因的频率。

具体结果如下表所示：

表4抗嗜水气单胞菌群体中的微卫星等位基因频率统计分析

表4的结果表明，该微卫星位点在群体中至少存在五个等位基因，分别是153bp、165bp、177bp、185bp、201bp，其中153bp处等位基因仅在抗病组中出现，具有特异性地表达。据统计，在中华鳖抗嗜水气单胞菌群体中，153bp等位基因的基因频率为37.33％。