中华鳖嗜水气单胞菌荧光定量PCR检测方法的建立和应用

摘要

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）是一类广泛存在于水环境的常在菌，它不仅能引发多种水生动物的传染病，而且也是爬行类、两栖类、鸟类等动物的重要病原菌，亦可单独或与其他致病菌共同感染，引发人类的腹泻或败血症等病症，影响食品安全。因此嗜水气单胞菌已成为人兽鱼共患病原菌。随着中华鳖集约化养殖规模的发展，由气单胞菌引起的中华鳖疾病也日益成为中华鳖养殖的主要病害，其中以嗜水气单胞菌引起的病害较为常见。该菌可引起中华鳖出血性败血症、腐皮病、穿孔病、红脖子病、红底板病和白底板病等，该菌所致疾病严重阻碍了中华鳖养殖业的健康发展，给养殖业带来了巨大的经济损失。目前，在动物检验检疫中，中华鳖嗜水气单胞菌的检测方法主要以细菌的分离培养鉴定为主，直观，易操作，但耗时长。分子生物学检测方法如PCR、Real-time PCR，具有敏感性高、特异性强、快速等优点。
　　 本研究选取气溶素(aerolysin)基因aerA为待测靶基因，因其是嗜水气单胞菌的毒力基因之一，与其致病性基本上呈正相关，具有种属特异性，因此可作为致病性嗜水气单胞菌的标志。
　　 本研究从患病的中华鳖采集样品，进行细菌的分离培养、涂片染色镜检、生化试验及动物试验等，并根据分离株的细菌特征、生化试验结果及致病特性等确定分离的3株细菌均为嗜水气单胞菌。根据Ah气溶素基因的保守序列设计一对引物，建立了普通PCR检测方法。特异性试验结果表明，该方法能够从Ah阳性样品中特异性的扩增出119bp的片段，而对大肠杆菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、创伤弧菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌均无特异性扩增条带。敏感性试验显示，该方法的最低检测量为2.0×104 CFU/ml的菌液。以所建立的普通PCR方法对送检的44份样品进行检测，阳性检出率为56.8％。
　　 本研究以质粒DNA为模板，建立并优化了检测嗜水气单胞菌荧光定量PCR方法，可检测的最低值为2.1×10°个拷贝的细菌DNA，在2.1×103-2.1×108拷贝的细菌DNA范围内有很好的线性关系(r=0.999)。特异性试验中嗜水气单胞菌检测结果为阳性，而非嗜水气单胞菌检测结果均为阴性。重复性试验中批内试验和批间试验的变异系数(CV)分别小于2％和3％，说明该方法具有良好的稳定性。并且对送检的44份样品进行检测，阳性检出率为65.9％。该方法与生化鉴定法以及普通PCR法相比特异性强、敏感性高、操作简便、检测速率快等特点。
　　 综上所述，本研究建立了针对嗜水气单胞菌aerA基因的荧光定量PCR(SYBRGreen)，该方法具有较好的敏感性、特异性及重复性，为嗜水气单胞菌的快速检测、大规模检疫、流行病学调查等提供新的检测手段。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 文献综述

第一章 嗜水气单胞菌与嗜水气单胞菌病

1 病原学及形态特征

2 流行病学

3 致病性及临床症状

4 致病因子

5 防治

6 小结

第二章 嗜水气单胞菌病的诊断研究进展

1 鉴别培养基

2 生化试验

3 免疫血清学技术

4 分子生物学检测

5 小结

第三章 Real-time PCR检测技术的原理及应用

1 技术原理

2 荧光标记技术

3 应用

4 小结

第二部分 研究内容

第一章 嗜水气单胞菌的分离及鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二章 嗜水气单胞菌PCR检测方法的建立及应用

1 材料

2 结果

3 讨论

第三章 嗜水气单胞菌荧光定量PCR检测方法的建立和应用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

结论

附录1 嗜水气单胞菌荧光定量PCR快速检测技术指南

附录2 溶液配制

附录3 英文缩写注释

攻读硕士学位期间的主要成果

参考文献

致谢