一种豆科植物根瘤固氮共生体固氮能力的快速评估方法

摘要

本发明涉及了一种豆科植物根瘤固氮共生体系固氮效率的快速评估方法。主要步骤为：一)植物-根瘤菌转录本信息共提取；二)固氮酶表达原位检测；三)以固氮酶基因nifH的相对转录丰度来评估大豆根瘤固氮共生体的固氮能力。本发明的优势在于：(1)操作步骤简单、方便；(2)可用于田间快速、实时检测固氮水平。

说明书

技术领域

本发明涉及一种豆科植物根瘤固氮共生体固氮能力的快速评估 方法。

背景技术

大气中氮气的比例占79％，但是所有的动植物以及大多数微生物 都不能利用分子态氮作为氮源，而所有的生命都需要氮。生物固氮是 指微生物将氮还原为氨的过程。据联合国粮农组织(FAO)1995年的 粗略估计，全球每年由生物固氮作用固定的氮量接近2×10⁶吨，占全 球植物需氮量的约3/4。根据固氮微生物与高等植物以及其他生物的 关系，可以分为三大类：自生固氮体系、共生固氮体系和联合固氮体 系。共生固氮是自然界最主要的固氮体系，包括根瘤菌与豆科植物、 弗兰克氏菌与非豆科植物、固氮蓝细菌与植物以及蓝细菌与真菌的共 生体地衣等，其中根瘤菌与豆科植物的共生固氮最为突出。根瘤菌共 生固氮是在豆科植物根瘤共生组织中进行的生理过程，根瘤的固氮活 性和固氮效率将直接决定了豆科植物的生理特征。

豆科植物是我国重要的经济作物。以大豆为例，大豆生长过程中， 大豆植物与大豆根瘤菌形成的固氮共生体是大豆氮源的主要摄取途 径，大豆根瘤固氮共生体固氮能力的强弱直接影响着大豆的产量和品 质，对大豆种植有着非常重要的指导意义。在此过程中，对大豆根瘤 固氮共生体中根瘤菌编码的固氮酶活性的检测，是评估其固氮能力的 基础指标。但由于固氮酶本身不易提取且容易失活，另外受限于根瘤 菌的生理特性，编码固氮酶的相关基因仅在共生状态下进行表达，因 此目前对于固氮效率的检测多采用间接方法。

目前，¹⁵N同位素稀释法是确定豆科植物和根瘤菌固氮共生体固氮 能力的常用方法，该方法检测指标直接，但检测周期长，并且需要提 前施用同位素，所以不能用于田间检测，也不能做到实时检测。因此， 实际农业产生需要一种能够快速低成本评估大豆根瘤固氮共生体固 氮能力的方法。

发明内容

本发明提供一种豆科植物根瘤固氮共生体固氮效率的快速、实时 评估豆科植物根瘤固氮共生体系固氮能力的方法。

nifH基因是根瘤菌固氮酶的结构基因，存在于nif基因簇，其编 码产物是固氮酶的结构组分，nif基因是固氮的关键基因。

本发明通过提取根瘤总RNA，再将mRNA逆转录成cDNA，荧光定量 PCR检测利用nifH基因的表达丰度的检测，可以分析不同环境中豆科 植物根瘤固氮共生体中固氮酶基因的转录效率，进而间接评估不同实 验或田间条件下的豆科植物与根瘤菌的共生固氮效率的变化。

发明内容包括：

一种豆科植物根瘤固氮共生体系固氮能力的快速评估方法，包 括：

一：植物-根瘤菌转录本信息共提取：(1)设定对照组和待测组， 对照组和待测组分别由一个或两个以上样本组成，分别提取各样本根 瘤总RNA；(2)用分光光度计分别检测各样本中提取的总RNA，得到 总RNA的浓度和质量；

二：固氮酶基因转录水平原位检测：(1)分别将对各样本的mRNA 反转录成cDNA；(2)分别用荧光定量PCR方法转录各样本的固氮酶nifH 基因和参比基因16s，并用2^-ΔΔCt方法计算待测组相对于对照组，固氮 酶nifH基因的相对转录丰度；

三：以固氮酶基因nifH的相对转录丰度来评估大豆根瘤固氮共生 体的固氮能力。

所述样本取自一株或两株以上相同品种豆科植物。同组样本中， 豆科植物处于相同生长环境下；组间样本中，豆科植物生长环境不同

具体而言包括如下步骤：

(1)设定对照组及待测组，分别取对照组及待测组内各个样本的 新鲜根瘤50-200mg,在液氮中研磨成细粉状，立即加入RNA提取液 1-2ml，继续研磨成匀浆；

(2)将匀浆1-2ml转移到离心管中，加入200-400ul氯仿，混匀；

(3)加入50-100ulRNase-freeddH₂O及50-200ul氯仿,混匀，离 心5-20分钟，4℃，12,000×g-16,000×g；

(4)将600ul-800ul上清液转移到RNase-free离心管中，加入等 体积的异丙醇，混匀，离心5-20分钟，12,000×g-16,000×g，弃 上清；

(5)加入1-2ml70-80％乙醇，混匀，6000×g-8000×g离心4-7 分钟，倒出液体，留沉淀；

(6)加入30-100ulRNase-freeddH₂O，混匀；

(7)分光光度计分别测定各样本的RNA浓度和质量，并用 RNase-freeddH₂O将各样本稀释成同样浓度；(第一，检测RNA质量 是否可以进行后续实验，第二，确定RNA浓度方便后续反转录实验统 一RNA质量)

(8)获得的RNA进行反转录，将mRNA逆转录成cDNA；

(9)采用荧光定量PCR(Real-timePCR)，以cDNA为模板分别 扩增个样本的固氮酶基因nifH和参比基因16s；

(10)根据Real-timePCR得到的Ct值，用2^-ΔΔCt方法计算分析待 测组相对于对照组，固氮酶基因nifH的相对转录丰度；

(11)以nifH基因的相对转录丰度来评价固氮能力，当相对转录 丰度为1时，表明待测组相对于对照组，固氮能力相同；当相对转录 丰度低于1时，表明待测组相对于对照组，固氮能力低；当相对丰度 大于1时，表明待测组相对于对照组，固氮能力高。

步骤(1)中，取新鲜根瘤100mg，RNA提取液为TrizolA+,加入量 为1ml；步骤(2)中，将匀浆1ml转移到PhaseLockGel管，加入400ul 氯仿，混匀。

步骤(2)和步骤(3)中，所述混匀后，将匀浆分别冰上放置5-20 和3-7分钟，氯仿加入量分别为400ul和200ul。

步骤(3)和步骤(4)中，所述离心为4℃，12,000×g，离心15 分钟。

步骤(5)中75％乙醇加入量为1ml，所述离心为4℃，7500×g， 离心5分钟。

步骤(6)中室温放置2-3分钟后，加入30ulRNase-freeddH₂O。

步骤(8)中逆转录反应体系为30ul反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：37℃，45min-60min；85℃,5s。

步骤(9)中荧光定量PCR方法采用相对定量方法，内参基因选择 16S，目标基因为固氮酶结构基因nifH；反应体系为25ul反应体系， 由下列成分组成：

Real-timePCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30sec，58℃ 退火1min，72℃延伸1min，共40个循环，再72℃延伸10min，4℃ 保温。

本发明的优点在于：

1)操作步骤简单、方便，全部操作分析过程可在一个工作日内完成；

2)通过修改RNA提取过程中各类试剂的添加量，提取得到的植物- 根瘤总RNA质量较高，可以从图1中看出，RNA浓度达到 1000ng/ul以上，A260/A280在1.8-2.0之间。

3)通过调整整合RNA提取以16S基因的转录丰度为参比对照，通过 计算基因转录丰度的比率，反转录及实时荧光定量PCR方法可以 准确稳定的评估，最终可以达到检测nifH基因的转录水平来指 示根瘤固氮豆科植物共生体固氮能力效率的变化，从图3和图4 中可以看出，本发明针对nifH基因转录变化的检测分析结果和 同位素稀释法检测分析的共生固氮酶活性变化的结果表现一致。

4)本方法适合用于田间快速、实时评估土壤环境干预下(农药或污 染物等)豆科植物根瘤固氮共生体固氮能力的变化。

附图说明

图1为分光光度计检测总RNA的结果图；

图2是荧光定量PCR的扩增曲线(左)和熔解曲线(右)图；

图3是氯嘧磺隆胁迫处理下固氮酶基因nifH的表达效率变化图；

图4是用稳定同位素¹⁵N稀释法检测的氯嘧磺隆胁迫处理下共生根 瘤固氮酶活性的变化。

具体实施方式

本发明所述参数组合是经过实验设计优化而得，与现有提取方法 相比，可以用较少的根瘤样本(50mg即可)，以相对较短的时间，提 取出质量较高的RNA样本。以下实施例用于进一步说明本发明，但发 明不限于实施例。

实施例1：

本实验原位检测根瘤菌固氮酶基因的表达效率，并评估固氮能力 的方法按以下步骤进行：

对照组：无菌蛭石盆栽实验；

待测组：与对照组相同的无菌蛭石盆栽实验，分别加入氯嘧磺隆 除草剂A)正常田间用量(20ug/kg)、B)5倍田间用量(100ug/kg)、 C)25倍田间用量(500ug/kg)。

每组包括3个样本，每个样本取自3株大豆植株。

每个样本取大豆根瘤100mg，用自来水冲洗干净后，立即放入液 氮制冷；研钵和杵于121℃灭菌20min，烘干，研磨前用液氮预冷；研 磨成细粉状时，立即加入RNA提取液TrizolA+1ml，继续研磨成匀浆

(1)将1ml匀浆转移到离心管中(离心管用前12,000×g离心 30s)，冰上放置15分钟后，加入200--400ul，如300ul氯仿，上下 颠倒混匀；

(2)加入75ulRNase-freeddH₂O及100ul氯仿,颠倒混匀，冰 上放置5分钟后，4℃，12,000×g离心5-20分钟，如15分钟，；

(3)将700ul上清液转移到新的RNase-free离心管中，加入等 体积的异丙醇，上下颠倒混匀，冰上放置20-30分钟，离心5-20分 钟，如15分钟，4℃，12,000×g，弃上清；

(4)加入1ml75％乙醇，颠倒混匀，4℃,7500×g离心5min， 倒出液体(注意沉淀不要倒出)；

(5)室温放置晾干2-3分钟，加入30-100ul，如 75ulRNase-freeddH₂O，混匀；

(6)对提取获得的根瘤总RNA，采用NANODROP分光光度计结果 检测，结果显示(图1)：植株-根瘤菌共提取得到的总RNA浓度较高， A260/A280的比值均在1.9-2.0之间，说明没有蛋白污染；以 RNase-freeddH₂O将各样本稀释成同样浓度

(7)获得的RNA采用TaKaRaRTreagentKit (Takara,Japan)进行反转录，将mRNA逆转录成cDNA；

所用反转录体系为30ul反应体系：

PCR扩增条件为：37℃，60min；85℃,5s。

(8)采用荧光定量PCR(Real-timePCR)，以cDNA为模板扩 增固氮酶基因nifH；

所用反应体系为25ul反应体系，由下列成分组成：

Real-timePCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30sec， 58℃退火1min，72℃延伸1min，共40个循环，再72℃延伸10min， 4℃保温。

Real-timePCR所用引物序列：

16S上游引物：5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’，下游引物：5’ -CTACCAGGGTATCTAATCC-3’；nifH上游引物：5’- AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3’，下游引物：5’- TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3’)

荧光定量PCR的扩增曲线图(图2左)显示，扩增曲线整体平行性 较好，表明各反应管的扩增效率接近，满足应用相对定量方法的要求； 溶解曲线图(图2右)显示，熔解曲线呈现单一峰，说明没有非特异 性扩增，所用扩增引物满足条件，且单一峰的TM值位于90左右，说明 扩增片段不是引物二聚体。因此，实验结果可用于后续计算分析。

(9)根据Real-timePCR得到的Ct值，用2^-ΔΔCt方法计算分析 固氮酶基因的相对表达量:

1)用内参基因16SDNA的Ct值归一nifH基因的Ct值：

ΔCt(对照组)＝Ct(对照组，nifH)-Ct(对照组，16S)

ΔCt(待测组)＝Ct(待测组,nifH)-Ct(待测组,16S)

2)待测组与对照组间的ΔCt之差：

ΔΔCt＝ΔCt(待测组)-ΔCt(对照组)

3)计算nifH基因的表达效率：

nifH基因的表达水平比率＝2^-ΔΔCt(即待测组与对照组相比，nifH 基因的相对表达量。)

(10)用Graphpadprism5软件进行方差分析、显著性差异分析 及作图。

对照组及不同实验待测组的nifH基因转录表达效率结果图(图3) 显示：在正常田间施用浓度(20ug/kg)和25倍田间施用浓度 (500ug/kg)氯嘧磺隆处理下，2^-ΔΔCt的数值都低于1，nifH基因的转 录表达相比对照组显著受到抑制；在5倍田间施用浓度(100ug/kg) 氯嘧磺隆处理下，nifH基因的丰度相比对照组降低，但没有显著性差 异，但相比20ug/kg和500ug/kg待测组表达升高。

对比例1

如实施例1中，用稳定同位素¹⁵N稀释法检测实验条件中的固氮酶 活性，结果(图4)显示不同浓度的氯嘧磺隆胁迫处理下，共生根瘤 固氮酶活性的变化趋势和固氮酶nifH基因的表达效率的变化趋势一 致。

图3和图4的对比表明，固氮酶nifH基因相对转录丰度2^-(ΔΔCt)的 变化可以同步的反映出固氮能力的变化，2^-(ΔΔCt)数值越大，表明nifH 基因的相对转录丰度越高，其固氮共生体的固氮能力也越强；反之 2^-(ΔΔCt)数值越小，表明nifH基因的相对转录丰度越低，固氮酶蛋白 的表达相比对照组显著受到抑制，固氮能力也越低。

稳定同位素¹⁵N同位素稀释法检测实验条件中的固氮酶活性的具 体操作步骤如下：1)该法在无菌蛭石盆栽实验中进行，每个待测组 中12个为接种根瘤菌的种子，3个为不接根瘤菌种子作为固氮效率检 测中的非固氮对照植株；2)在出苗时，每升营养液施入2.324g含 10.28％¹⁵N的(NH₄)₂SO₄(0.21g¹⁵N/L)；3)实验植株80℃烘干至恒重， 研磨，过200目筛；4)取样，用稳定同位素比例质谱仪测定植株¹⁵N/¹⁴N； 5)按下列公式计算植株的固氮效率：

$\%\mathrm{Ndfa}=(1-\frac{\%\mathrm{NdfF}}{\%\mathrm{NdfNF}})\times 100,$％Ndfa表示植物的固氮效 率，％NdfF表示固氮植物体内的¹⁵N原子百分超，％NdfNF表示参考植物 (非固氮植物)体内的¹⁵N原子百分超。

结果表明，使用本发明的方法，可以实时评估不同条件下豆科植 物根瘤共生体固氮能力的变化。