朱鹮抗细菌潜力检测的II类MHC基因的特异性引物及分型方法

摘要

本发明公开了一种用于扩增朱鹮Ⅱ类MHC基因序列的特异性引物及基因分型方法，其序列如SEQ？ID？NO.1～SEQ？ID？NO.7所示。采用本发明的扩增引物，可以有效扩增出朱鹮Ⅱ类MHC各位点的核苷酸序列，并通过后续的SSCP-HD技术对每个个体进行基因分型。本发明具有特异性强、操作过程简便快速的优点，通过对Ⅱ类MHC基因进行基因分型，可以评估朱鹮个体Ⅱ类MHC基因的多态性高低，检测其抵抗细菌性疾病的潜力，为朱鹮保护工作中的新种群奠基者选择、野化放归个体选择以及人工配对等工作提供重要参考。

说明书

技术领域

本发明提供了用于扩增朱鹮MHCⅡ类各位点基因序列的引物及在此基础上的利用单链构 象多态性(Single-StrandConformationPolymor-phism，SSCP)技术进行基因分型的方法。

背景技术

朱鹮，世界濒危物种及国家以及重点保护动物，隶属鸟纲鹈形目鹮科朱鹮属，是一种中 等体型的涉禽，曾经广泛分布于东亚的中国、俄罗斯、日本和朝鲜半岛等地区。19世纪末20 世纪初，由于人类活动等原因朱鹮种群数量大幅减少，俄罗斯、朝鲜半岛和日本的野生个体 相继绝迹，直到1981年科研人员在我国陕西省洋县秦岭山中重新发现了7只野生朱鹮，这7 只个体也成为了当前全球范围内所有已知个体的奠基者。

为了保护这一物种，中国政府及研究机构商讨制定了以就地保护为主，异地保护兼并的 朱鹮拯救计划。1986年中国建立了陕西省朱鹮保护观察站进行就地保护，北京、河南、浙江 等地也相继展开了异地保护。经过几十年的保护工作，虽然朱鹮种群数量在逐步回升，但仍 未走出濒危的现状，由于目前全球范围的已知个体均为1981年重新发现的两对朱鹮亲本的后 代，近亲交配严重，存在繁殖能力低下、幼鸟死亡残疾率较高等问题。

主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC),作为脊椎动物免 疫系统中的关键角色，包含一系列多基因家族成员，其中Ⅱ类MHC基因的抗原结合区能够识 别并结合外源性抗原(如细菌等)的多肽，然后将其呈递给CD4+T细胞，从而引发后续的免 疫反应。Ⅱ类MHC基因的蛋白产物由一个α链和一个β链组成，其抗原结合区由α基因的外 显子2和β基因的外显子2共同编码组成。由于Ⅱ类MHC基因负责识别外来细菌性抗原，其 抗原结合区通常具有显著的多态性，且抗原结合区多态性高的个体能够更好的抵抗细菌性疾 病。通过评估人工种群中Ⅱ类MHC的多态性，保护工作者在进行新建种群选择奠基者与野外 放归选择适应性能力强的个体等工作时，可以根据多态性高低进行科学地选择，在圈养种群 进行人工配对时，可以选择具有不同Ⅱ类MHC等位基因的个体配对从而提高子代的多态性， 增强子代对细菌性疾病的抵抗力。

发明内容

本发明提供了扩增朱鹮MHCⅡ类各位点基因序列的特异性引物及在此基础上的SSCP基因 分型方法，使用本发明提供的引物能够有效扩增各位点核苷酸序列，并以此PCR产物为基础 运用SSCP-HD技术进行基因型分型。

用于朱鹮Ⅱ类MHC基因序列扩增的引物组包括4对引物对，所述引物对的引物序列如下，

引物对一：上游引物如SEQIDNO.1所示；

下游引物SEQIDNO.2所示；

引物对二：上游引物如SEQIDNO.3所示；

下游引物如SEQIDNO.4所示；

引物对三：上游引物如SEQIDNO.5所示；

下游引物如SEQIDNO.6所示；

引物对四：上游引物如SEQIDNO.7所示；

下游引物如SEQIDNO.6所示。

一种朱鹮Ⅱ类MHC基因序列PCR扩增方法是采用所述的四对引物分别进行PCR扩增， 每对引物均在10uLPCR体系中，并在特定的PCR扩增条件下进行目标片段扩增，然后运用 SSCP分型方法进行基因分型。

所述的10uLPCR体系是：

所述的特定的PCR扩增条件是：第一步，95℃预变性5分钟；第二步，95℃变性30秒； 第三步，在退火温度下下退火30秒；第四步，72℃复性30秒；第五步，重复第二步～第四步， 32个循环；第六步，72℃延伸5分钟；其中不同引物使用的退火温度不同，第一对引物的退 火温度为60℃；第二对引物的退火温度为64℃；第三对引物的退火温度为57℃；第四对引 物的退火温度为63℃。

所述的SSCP分型方法中，固定后、银染后以及显色后应分别使用双蒸水洗胶4次，以 获得清晰的SSCP条带。

所述的SSCP分型方法是：

1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将间隔 条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；

2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确认无气 泡存在后插入梳子，常温平置；

3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满0.5 ×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；

4)样品电泳，吸取8uLPCR产物，加入4uL2×loadingbuffer，快速离心混合，95℃变性7min 后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，30W，电泳8-11h；

5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL 双蒸水洗胶4次；

6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶4 次；

7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固定 液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；

8)读取条带，确定基因型。

本发明涉及的引物SEQIDNO.1～SEQIDNO.7可以有效扩增朱鹮MHC的4个二类α基 因及4个二类β基因的抗原肽结合区(peptide-bindingregion，PBR)外显子，4个α基因分 别命名为DAA，DBA1，DBA2和DBA3，4个β基因分别命名为DAB，DBB1，DBB2和 DBB3。

由于Ⅱ类区具有更高水平的序列相似性，故将8个Ⅱ类位点共分为4个group，分别为 A1、A2、B1、B2，其中A1包含位点DAA，A2包含位点DBA1、DBA2和DBA3，B1包含 位点DAB，B2包含位点DBB1、DBB2和DBB3。四个组别中，A2和B2各自的三个位点均 具有相同的内含子1和内含子2，且A2包含的三个位点具有几乎一致的全长序列(仅两处 SNP)，而B2中的DBB2和DBB3两个位点具有相同的外显子2，故对A1和B1的外显子2 采用位点特异扩增及分型；对A2和B2的外显子2采用组内三个位点同步扩增及分型，因此 此步还无法确定A2和B2所扩增出的外显子2序列各自所属位点。

扩增各group对应的引物如下表所示，其中，ⅡB1和ⅡB2共用同一条下游引物。

从分型结果看，A1和A2所有个体的单链构象均一致，且双链区仅有一条同源双链带， 表示我们所分型的所有个体均为纯合，故4个α基因位点均为单态。此外，在分型结果中还 发现，某些个体无法扩增到A2的外显子2，经多种实验反复验证，判断为位点缺失。

B1的分型结果显示，DAB位点为多态位点，外显子2共有4条等位基因，所有个体共有 九种不同的带型，其中三种为纯合，六种为4条等位基因两两组合的杂合子带型。

B2组内的三个位点的同步分型结果显示，所有个体的PCR产物中存在最多两条序列，且 两条序列在基因组中的拷贝数目不同，因此PCR产量存在明显差异，导致其中一条带姓偏弱。 带型一仅存在一条序列，即DBB2和DBB3的外显子2形成的带型；带型二存在两条序列，即 DBB1的外显子2与DBB2的外显子2(同DBB3的外显子2)形成的带型。另外还发现，在缺 失A2基因的个体中，同样无法扩增到B2基因，经反复多种实验的验证，判断为连锁位点缺 失。综上，B2组内三个位点的外显子2均为单态。

附图说明

图1显示的是第二对引物扩增的Ⅱ-A1位点基因序列。

图2显示的是第四对引物扩增的Ⅱ-B1位点基因序列。

图3显示的是第二对引物所扩增的Ⅱ-A1位点的分型条带图。

图4显示的是第四对引物所扩增的Ⅱ-B1位点的分型条带图。

具体实施方式

本发明提供的朱鹮MHCⅡ类PBR外显子引物筛选及基因分型分为以下步骤：1、根据已得 的朱鹮MHC基因序列设计Ⅱ类的特异性引物；2、通过PCR扩增检测各位点引物的有效性；3、 运用SSCP-HD技术进行基因分型。

下面结合实例来对本发明作进一步说明：

实例一：

1.样品准备：朱鹮血液和组织样品来自德清、佐渡、北京、河南、洋县和楼观台等人工 种群。

2.DNA提取：酚氯仿法提取血液和组织DNA。

3.引物合成：根据已得的朱鹮Ⅱ-类MHC基因序列设计Ⅱ-A1位点的特异性引物扩增外显 子2，用于改位点的基因分型，华大基因合成引物。引物序列如下表：

4.引物扩增：将上述扩增引物分别应用于PCR，扩增所提取的样品DNA。设置PCR热 循环退火温度范围为64℃。

5.扩增结果检测：取2ul上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度为1.5％。结果 如图1所示，此引物可以有效扩增目的条带，目的条带的片段大小均处于350bp，可用于后 续的SSCP-HD实验从而进行基因分型。

6.引物扩增体系：5ul2×GCbufferⅠ,0.8uldNTP(2.5Mm)，0.3ul上游引物 (10uM),0.3ul下游引物(10uM)，1ulgDNA，0.1ulEx-Taq(5U/ul),2.5ul双蒸水。体系总 体积10ul。

7.引物扩增条件：

8.在上述的PCR扩增产物基础上，利用SSCP-HD技术进行基因分型，步骤如下：

(1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板， 将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；

(2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确 认无气泡存在后插入梳子，常温平置；

(3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装 满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；

(4)样品电泳，吸取8uLPCR产物，加入4uL2×loadingbuffer，快速离心混合，95℃ 变性7min后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，30W，电泳8-11h；

(5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒 入500mL双蒸水洗胶4次；

(6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速 洗胶4次；

(7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL 固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次。

(8)读取条带，如图3所示，此位点为单态。

实例二：

1.样品准备：朱鹮血液和组织样品来自德清、佐渡、北京、河南、洋县和楼观台等人工 种群。

2.DNA提取：酚氯仿法提取血液和组织DNA。

3.引物合成：根据已得的朱鹮Ⅱ类MHC基因序列设计Ⅱ-B1位点的特异性引物扩增外显 子2，华大基因合成引物。引物序列如下表：

4.引物扩增：将上述扩增引物分别应用于PCR，扩增所提取的样品DNA。设置PCR热 循环退火温度范围为63℃。

5.扩增结果检测：取2ul上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度为1.5％。结果 如图2所示，此引物可以有效扩增目的条带，目的条带的片段大小为150bp，此PCR产物用 于后续的SSCP分型。

6.引物扩增体系：5ul2×GCbufferⅠ,0.8uldNTP(2.5Mm)，0.3ul上游引物(10uM),0.3ul 下游引物(10uM)，1ulgDNA，0.1ulEx-Taq(5U/ul),2.5ul双蒸水。体系总体积10ul。

7.引物扩增条件：

8.在上述的PCR扩增产物基础上，利用SSCP-HD技术进行基因分型，步骤如下：

(1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板， 将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；

(2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确 认无气泡存在后插入梳子，常温平置；

(3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装 满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；

(4)样品电泳，吸取8uLPCR产物，加入4uL2×loadingbuffer，快速离心混合，95℃ 变性7min后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，30W，电泳8-11h；

(5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒 入500mL双蒸水洗胶4次；

(6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗 胶4次；

(7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL 固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次。

(8)读取条带，如图4所示，此位点为多态。