砂梨品种清香果皮全褐性状基因位点的分子标记及其筛选方法

摘要

本发明涉及分子遗传学领域，公开了一种砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，还公开了该种砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记的筛选方法。对砂梨品种‘清香’(♀)与‘翠冠’(♂)杂交获得的F1的各单株的基因型和各单株的果皮全褐性状进行遗传连锁分析，获得‘清香’果皮全褐性状基因位点Rus.zaas-8的分子标记。通过果皮全褐性状基因位点的分子标记来检测‘清香’及其衍生品种(系)中是否含有该基因位点，可预测其果实皮色，大大提高砂梨果实皮色选择效率。

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，涉及一种砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，尤其涉及该种砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记的筛选方法。

背景技术

砂梨是我国重要的南方果树，属于多年生木本植物，童期较长。果皮色泽是最重要的果皮性状之一，果皮颜色一致、无果锈是优质商品梨的重要指标。果皮褐色属于果实性状，传统杂交育种选育方法周期长、难度大。一般需要3～5年结果后才能开展初步鉴定。通过定位果皮褐色性状基因位点来辅助育种可以有效解决这一问题。

遗传研究表明，梨果皮全褐性状受单个或数个主效基因位点控制，不同的材料其控制果皮全褐性状的基因位点可能会存在差异。

‘清香’是由‘新世纪’(♀)与‘三花梨’(♂)杂交选育而成，果皮褐色性状来自‘三花梨’。‘三花梨’属我国优良的地方品种，栽培历史悠久，品质优良，是我国砂梨育种的重要亲本之一。‘清香’(♀)与‘翠冠’(♂)进行杂交得到杂种F1中，果皮全褐与非全褐单株比经卡方检测满足1：1的分离比，这表明‘清香’的果皮全褐性状是单基因控制。

发明内容

本发明针对现有的不足，公开了一种砂梨品种清香果皮全褐性状基因位点的分子标记，还公开该种砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记的筛选方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决。

砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，基因位点位于砂梨品种‘清香’8号染色体，与其紧密连锁的分子标记为Zaasp867引物，其序列为：

左端引物序列CCACCTCACCTTATCCCTCA，

右端引物序列GCGTTTGCTCCTCGTACTTC。

扩增砂梨全褐果皮品种或育种材料DNA，获得的扩增片段为145bp，即为砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，该基因位点位于砂梨品种‘清香’8号染色体，利用PCR对‘清香’与‘翠冠’杂交得到的F1代进行检测，果皮全褐单株准确率96.3％，利用Excel软件测得与果皮全褐性状不相关的概率P值为0.004。

砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，基因位点位于砂梨品种清香8号染色体，与其紧密连锁的分子标记为Zaasp868引物，其序列为：

左端引物序列AAAAAGTGATGTGTGGATCGC，

右端引物序列CTGGTGACTTGCAAGCTAGG。

扩增砂梨全褐果皮品种或育种材料DNA，获得的扩增片段为129bp，即为砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，该基因位点位于砂梨品种‘清香’8号染色体，利用PCR对‘清香’与‘翠冠’杂交得到的F1代进行检测，果皮全褐单株准确率97.0％，利用Excel软件测得与果皮全褐性状不相关的概率P值为0.003。

砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，基因位点位于砂梨品种‘清香’8号染色体，与其紧密连锁的分子标记为Zaasp873引物，其序列为：

左端引物序列CGCTTTCGAACACAAAACAA，

右端引物序列CTGGCACTTTGAATTCGCTT。

扩增砂梨全褐果皮品种或育种材料DNA，获得的扩增片段为242bp，即为砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，该基因位点位于砂梨品种‘清香’8号染色体，利用PCR对‘清香’与‘翠冠’杂交得到的F1代进行检测，果皮全褐单株准确率97.0％，利用Excel软件测得与果皮全褐性状不相关的概率P值为0.003。

砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，基因位点位于砂梨品种‘清香’8号染色体，与其紧密连锁的分子标记为Zaasp876引物，其序列为：

左端引物序列CGCTTTCGAACACAAAACAA，

右端引物序列CTGGCACTTTGAATTCGCTT。

扩增砂梨全褐果皮品种或育种材料DNA，获得的扩增片段为241bp，即为砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，该基因位点位于砂梨品种‘清香’8号染色体，利用PCR对‘清香’与‘翠冠’杂交得到的F1代进行检测，果皮全褐单株准确率97.0％，利用Excel软件测得与果皮全褐性状不相关的概率P值为0.003。

作为优选，基因位点为Rus.zaas-8。

以上提到的砂梨‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记的筛选方法，包括以下方法：

A.以砂梨品种‘翠冠’为父本与砂梨品种‘清香’进行杂交，得到杂种F1；

B.用CTAB法提取F1群体各单株的DNA，采用简单序列重复的标记SSR对两亲本进行多态性引物筛选，通过聚合酶链式反应进行扩增，扩增产物在密度为0.08g/ml的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在F1群体中进行分析，聚合酶链式反应扩增程序同上，获取群体基因型资料；

C.根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建砂梨的遗传连锁图，；

D.果实成熟期对F1每个单株进行果实皮色鉴定，获得F1每个单株的果实皮色性状；

E.根据每个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个单株的果实皮色性状，通过分析与果皮全褐性状相关的概率P值确定分子标记，P<0.05的分子标记，即为分子标记。

作为优选，步骤B中，聚合酶链式反应在扩增仪上进行。

作为优选，步骤C中，用软件Mapmaker2.0，最小LOD值设为3，获得连锁图。

作为优选，步骤E中，根据每个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个单株的果实皮色性状，分析测得与果皮全褐性状相关的概率P值，P<0.05的分子标记，即为分子标记。果皮全褐性状基因位点的位置由分子标记的染色体位置确定：在‘清香’中发现Zaasp867(P＝0.004)、Zaasp868(P＝0.003)、Zaasp873(P＝0.003)、Zaasp876(P＝0.003)标记与砂梨果皮全褐性状基因位点紧密连锁，Zaasp867标记、Zaasp868标记、Zaasp873标记和Zaasp876标记即为获得的砂梨‘清香’果皮全褐性状基因位点Rus.zaas-8的分子标记。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供砂梨‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，通过检测与果皮全褐性状基因位点连锁的分子标记，可以预测砂梨果实皮色性状，加快砂梨果实皮色性状的选择进度。

(2)通过本发明分子标记在国际上首次定位获得了砂梨品种‘清香’中的果皮全褐性状基因位点，它们可获得96.3％～97.0％的果皮褐色检出率。砂梨为自交不亲和树种，树体为F1杂种，基因组高度杂合，对砂梨果皮全褐性状基因位点的精确定位工作居于同领域前列。

(3)通过本发明分子标记定位的基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测这些与果皮全褐性状基因位点连锁的分子标记，即可以预测砂梨植株的果皮褐色性状，用于砂梨品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有果皮全褐性状，进而快速筛选目标果实皮色品种或品系用于砂梨育种。质量性状基因位点的检测方便快速，不受环境影响。

(4)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要等到植株度过童期，结果后才可进行果实褐皮性状调查，不仅周期很长，也占用了土地资源。因此传统育种不仅费时，而且成本高。通过检测果皮全褐性状基因位点，可以在苗期就鉴定出全褐果皮的单株，进行早代筛查，不仅节约生产成本而且大大提高砂梨果实皮色性状的选择效率。

具体实施方式

实施例1

砂梨‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记的筛选方法，包括以下方法，

A.以砂梨品种‘翠冠’为父本与砂梨品种‘清香’进行杂交，得到杂种F1；

B.用CTAB法提取F1群体各单株的DNA，采用简单序列重复的标记SSR对两亲本进行多态性引物筛选，通过聚合酶链式反应进行扩增，扩增产物在密度为0.08g/ml的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在F1群体中进行分析，聚合酶链式反应扩增程序同上，获取群体基因型资料；

C.根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建砂梨的遗传连锁图，；

D.果实成熟期对F1每个单株进行果实皮色鉴定，获得F1每个单株的果实皮色性状；

E.根据每个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个单株的果实皮色性状，通过分析与果皮全褐性状相关的概率P值确定分子标记，P<0.05的分子标记，即为分子标记。

步骤B中，聚合酶链式反应在扩增仪上进行。

步骤C中，用软件Mapmaker2.0，最小LOD值设为3，获得连锁图。

步骤E中，根据每个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个单株的果实皮色性状，分析测得与果皮全褐性状相关的概率P值，P<0.05的分子标记，即为分子标记。发现Zaasp867(P＝0.004)、Zaasp868(P＝0.003)、Zaasp873(P＝0.003)、Zaasp876(P＝0.003)标记与砂梨果皮全褐性状基因位点紧密连锁，Zaasp867标记、Zaasp868标记、Zaasp873标记和Zaasp876标记即为获得的砂梨‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记。

实施例2

砂梨‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记的筛选方法，包括以下方法，

A.以砂梨品种‘翠冠’为父本与砂梨品种‘清香’进行杂交，得到杂种F1；

B.用CTAB法提取F1群体各单株的DNA，采用简单序列重复的标记SSR对两亲本进行多态性引物筛选，通过聚合酶链式反应进行扩增，扩增产物在密度为0.08g/ml的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在F1群体中进行分析，聚合酶链式反应扩增程序同上，获取群体基因型资料；

C.根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建砂梨的遗传连锁图，；

D.果实成熟期对F1每个单株进行果实皮色鉴定，获得F1每个单株的果实皮色性状；

E.根据每个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个单株的果实皮色性状，通过分析与果皮全褐性状相关的概率P值确定分子标记，P<0.05的分子标记，即为分子标记。在‘清香’中发现Zaasp867(P＝0.004)、Zaasp868(P＝0.003)、Zaasp873(P＝0.003)、Zaasp876(P＝0.003)标记与砂梨果皮全褐性状基因位点紧密连锁，Zaasp867标记、Zaasp868标记、Zaasp873标记和Zaasp876标记即为获得的砂梨‘清香’果皮全褐性状基因位点Rus.zaas-8的分子标记。

步骤B中，聚合酶链式反应在扩增仪上进行。

实施例3

砂梨‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记的筛选方法，包括以下方法，

A.以砂梨品种‘翠冠’为父本与砂梨品种‘清香’进行杂交，得到杂种F1；

B.用CTAB法提取F1群体各单株的DNA，采用简单序列重复的标记SSR对两亲本进行多态性引物筛选，通过聚合酶链式反应进行扩增，扩增产物在密度为0.08g/ml的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在F1群体中进行分析，聚合酶链式反应扩增程序同上，获取群体基因型资料；

C.根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建砂梨的遗传连锁图，；

D.果实成熟期对F1每个单株进行果实皮色鉴定，获得F1每个单株的果实皮色性状；

E.根据每个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个单株的果实皮色性状，通过分析与果皮全褐性状相关的概率P值确定分子标记，P<0.05的分子标记，即为分子标记。在清香中发现Zaasp867(P＝0.004)、Zaasp868(P＝0.003)、Zaasp873(P＝0.003)、Zaasp876(P＝0.003)标记与砂梨果皮全褐性状基因位点紧密连锁，Zaasp867标记、Zaasp868标记、Zaasp873标记和Zaasp876标记即为获得的砂梨‘清香’果皮全褐性状基因位点Rus.zaas-8的分子标记。

步骤B中，聚合酶链式反应在扩增仪上进行。

步骤C中，用软件Mapmaker2.0，最小LOD值设为3，获得连锁图。

实施例4

砂梨‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记的筛选方法，包括以下方法，

A.以砂梨品种‘翠冠’为父本与砂梨品种‘清香’进行杂交，得到杂种F1；

B.用CTAB法提取F1群体各单株的DNA，采用简单序列重复的标记SSR对两亲本进行多态性引物筛选，通过聚合酶链式反应进行扩增，扩增产物在密度为0.08g/ml的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在F1群体中进行分析，聚合酶链式反应扩增程序同上，获取群体基因型资料；

C.根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建砂梨的遗传连锁图，；

D.果实成熟期对F1每个单株进行果实皮色鉴定，获得F1每个单株的果实皮色性状；

E.根据每个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个单株的果实皮色性状，通过分析与果皮全褐性状相关的概率P值确定分子标记，P<0.05的分子标记，即为分子标记。在‘清香’中发现Zaasp867(P＝0.004)、Zaasp868(P＝0.003)、Zaasp873(P＝0.003)、Zaasp876(P＝0.003)标记与砂梨果皮全褐性状基因位点紧密连锁，Zaasp867标记、Zaasp868标记、Zaasp873标记和Zaasp876标记即为获得的砂梨‘清香’果皮全褐性状基因位点Rus.zaas-8的分子标记。

步骤B中，聚合酶链式反应在扩增仪上进行。

步骤C中，用软件Mapmaker2.0，最小LOD值设为3，获得连锁图。

步骤E中，根据每个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个单株的果实皮色性状，分析测得与果皮全褐性状相关的概率P值，P<0.05的分子标记，即为分子标记。

实施例5

材料与方法：

(一)‘清香’F1群体的构建与表型鉴定：

(1)对我国南方砂梨品种‘清香’(母本)与砂梨品种‘翠冠’(父本)进行杂交获得F1单株135个。

(2)F1单株种植于浙江省农业科学院海宁基地，位于浙江省海宁市许村镇杨渡村。果实成熟期对每个F1单株进行果实皮色性状鉴定。鉴定时将果实皮色分为全褐色与非全褐色2种类型，其中非全褐色包括了中间色和绿色。

(二)重组自交系群体的分子标记分析

(1)用CTAB法提取重组自交系群体各株系DNA；

(2)首先用977对SSR引物对‘清香’和‘翠冠’亲本的DNA多态性进行初步分析。PCR反应体积为25微升，其中10×buffer2.5微升，25mMMgCl21.5微升，2.5mMdNTPs2微升，Taq酶(5单位/微升)0.2微升，模板DNA20纳克，加水至25微升。SSR反应体系为DNA94℃预变性3min后，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸展1min，循环35次，最后72℃延伸7min。在PE9600扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(100ml聚丙烯酰胺溶液中含7.6克丙烯酰胺和0.4克甲叉双丙烯酰胺)上进行电泳分离，然后在紫外透射仪上照相，记录结果，亲本间有多态的引物在重组自交系群体中进行分析，获取群体基因型资料；

(3)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建砂梨的遗传图，所用软件为Mapmaker2.0，最小LOD值设为3，获得连锁图；

(4)利用Excel软件对各个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个单株的果实皮色进行连锁分析，定位基因位点。

(三)结果与分析：

分子标记筛选结果表明，有406对SSR引物在双亲间有差异。利用DataExcel软件对各个分子标记的群体基因型资料与其对应每个单株的果实皮色性状进行连锁分析，单向方差分析测得与果皮全褐性状不相关的概率P值和位点对果皮全褐性状的贡献率R2(表2)，P<0.05的分子标记即与一个果皮全褐性状基因位点连锁。所得分子标记在群体中的基因型按亲本‘清香’和‘翠冠’的基因型分类，如果基因型与‘清香’相同的株系表型为果皮全褐色，则该标记定位的果皮全褐性状基因位点来自‘清香’：在‘清香’中发现P＝0.004的Zaasp867标记、P＝0.003的Zaasp868标记、P＝0.003的Zaasp873和P＝0.003的Zaasp876与果皮全褐性状基因位点紧密连锁，即获得砂梨‘清香’果皮全褐性状基因位点Rus.zaas-8的分子标记。

通过上述分子标记鉴定基因位点来预测砂梨果皮全褐性状，预计可迅速提高我国砂梨品种果实皮色性状的育种进程。

表1.标记引物的序列及扩增片段大小

表2.砂梨‘清香’果皮全褐性状基因位点的单向方差分析

P：表示与果皮全褐性状不相关的概率，P<0.05表该标记与果皮全褐性状紧密连锁；R²：位点对果皮全褐性状的贡献率，值越大表明与果皮全褐性状越相关。

实施例6

砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，基因位点位于砂梨品种‘清香’8号染色体，基因位点为Rus.zaas-8。与其紧密连锁的分子标记为Zaasp867引物，其序列为：

左端引物序列CCACCTCACCTTATCCCTCA，

右端引物序列GCGTTTGCTCCTCGTACTTC。

实施例7

砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，基因位点位于砂梨品种‘清香’8号染色体，基因位点为Rus.zaas-8。与其紧密连锁的分子标记为Zaasp868引物，其序列为：

左端引物序列AAAAAGTGATGTGTGGATCGC，

右端引物序列CTGGTGACTTGCAAGCTAGG。

实施例8

砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，基因位点位于砂梨品种‘清香’8号染色体，基因位点为Rus.zaas-8。与其紧密连锁的分子标记为Zaasp873引物，其序列为：

左端引物序列CGCTTTCGAACACAAAACAA，

右端引物序列CTGGCACTTTGAATTCGCTT。

实施例9

砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，基因位点位于砂梨品种‘清香’8号染色体，基因位点为Rus.zaas-8。与其紧密连锁的分子标记为Zaasp876引物，其序列为：

左端引物序列CGCTTTCGAACACAAAACAA，

右端引物序列CTGGCACTTTGAATTCGCTT。

实施例10

砂梨品种‘清香’果皮全褐性状基因位点的分子标记，基因位点位于砂梨品种‘清香’8号染色体。与其紧密连锁的分子标记为Zaasp876引物，其序列为：

左端引物序列CGCTTTCGAACACAAAACAA，

右端引物序列CTGGCACTTTGAATTCGCTT。

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。