棉花内生细菌HB3S-13及其在棉花黄萎病防治中的应用

摘要

本发明涉及植物病理学，具体涉及棉花内生细菌HB3S-13及其在棉花黄萎病防治中的应用。本发明的棉花内生细菌HB3S-13，是从健康棉株茎部和根部分离筛选获得的，其分类命名为：（Agrobacterium？sp.）HB3S-13，已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏编号是：CCTCC？NO:M2015604，保藏日期：2015年10月13日。本发明的HB3S-13能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，以利于工厂化生产和推广应用。本发明的棉花内生细菌HB3S-13对棉花黄萎病具有较好防效的细菌，其防治效果为64.87～75.21%，且防效稳定，与生产上应用较多的枯草芽孢杆菌（防效为46.0%～52.9%）相比，防治效果提高50%左右。现有技术中尚没有该菌在棉花黄萎病上的生防效果报道，具有较大的潜力开发成为商业的生防制剂。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病理学，具体地说，本发明涉及棉花内生细菌HB3S-13及其在棉 花黄萎病防治中的应用。

背景技术

棉花黄萎病(Verticilliumwiltofcotton)是棉花上的一种重要病害，棉花黄萎病是由 大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)引起的土传真菌病害，它能导致棉花严重减产 甚至植株死亡。棉花黄萎病的常规防治方法有培育抗病品种、农业措施和化学防治等。 由于大丽轮枝菌的变异性，使得抗病品种的培育和推广受到制约。水旱轮作被证明是一 种较为有效的方法，但其对棉田结构和水源的要求较高。化学防治方法会造成对环境的 污染，而且这种方法不仅杀死了病原菌，也杀死了土壤中的有益微生物，后者无论对自 然还是农业土壤系统的维持都有重要的作用。鉴于此，人们致力于寻找有效的替代方法。 生物防治是一种有应用前景的方法，利用生物防治对棉花黄萎病进行防治，能在改善作 物生长和产量的同时确保自然环境的安全，具有可持续发展的战略意义。

利用有益微生物控制植物病害的发生危害具有经济、环境友好的特点。关于用内生 菌作为生防菌来防治棉花黄萎病的研究，国内的报道也并不鲜见，但是目前实现规模化 生产并能够用于生产实践的却并不多，其中枯草芽孢杆菌算是一个较为成功的例子，其 生物防治的作用机理主要是是产生杆菌肽等多种抗菌物质来抑制病原菌，对黄萎病的防 治具有一定的效果，但是在生产应用中存在不少问题，其中最主要的问题是大田防治效 果较低，国内登记的枯草芽孢杆菌剂型对棉花黄萎病的防治效果在45％左右，且在不同 年份效果不稳定。因此，有必要发掘出对棉花黄萎病的防治更加有效的菌种资源，为将 来生物源农药的开发提供相应的基础。

内生细菌作为生防菌的优势在于细菌为单细胞，生长繁殖快，便于大规模的发酵生 产和保存。细菌防治植物病害的机制主要有抗生作用，营养和位点的竞争作用，重寄生 作用以及诱导植物抗性作用。

发明内容

发明目的：本发明的发明人针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种 棉花内生细菌HB3S-13，以实现用其对棉花黄萎病进行生物防治。

本发明的另一目的在于提供上述所述棉花内生细菌HB3S-13在棉花黄萎病防治中 的应用。

技术方案：为了实现本发明上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种棉花内 生细菌，其分类命名为：(Agrobacteriumsp.)HB3S-13，已保藏于中国典型培养物保藏 中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号是：CCTCCNO:M2015604， 保藏日期：2015年10月13日。

所述棉花内生细菌HB3S-13，是从健康棉株茎部和根部分离筛选获得的对棉花黄萎 病具有较好生防效果、且防效效果稳定的内生细菌，该内生细菌能在棉花体内很好的定 殖，对人畜、昆虫、植物安全无毒，还具有如下性质：

1、形态特征

菌株HB3S-13在NA培养基上的菌落形态为淡黄色，菌落为圆形，有凸起；对菌 株HB3S-13进行革兰氏染色，判断HB3S-13为革兰氏阴性杆状细菌。

2、16SrRNA分析

用16SrRNAITS序列的相应引物扩增，扩增产物进行纯化和测序，测序结果与 NCBI上的序列进行比对后发现，HB3S-13内生细菌与根瘤菌属的16SrRNAITS序列 的同源性达到100％，因此，将HB3S-13归属为根瘤菌属(Agrobacteriumsp.)。

为了实现本发明的另一目的，本发明提供了上述所述棉花内生细菌HB3S-13在棉花 黄萎病防治中的应用。

本发明的有益效果：

1、HB3S-13能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，用于生物防治的菌株必 须能够在人工培养基上培养，以利于工厂化生产和推广应用。

2、本发明的棉花内生细菌HB3S-13对棉花黄萎病具有较好防效的细菌，其防治效 果为64.87～75.21％，且防效稳定，对作物生长无毒负作用，对人畜、昆虫和作物安全， 环境友好，与生产上应用较多的枯草芽孢杆菌(防效为46.0％～52.9％)相比，防治效 果提高50％左右；另外，本发明的棉花内生细菌HB3S-13经鉴定此细菌为革兰氏阴性杆 状细菌，为根瘤菌属(Agrobacteriumsp.)，尚没有该菌在棉花黄萎病上的生防效果报道， 具有较大的潜力开发成为商业的生防制剂。

附图说明

图1为HB3S-13在NA培养基上的形态；

图2a、图2b分别为革兰氏染色HB3S-13后的形态图；

图3为HB3S-13的16SrRNA序列在NCBI上的比对结果图；

图4为HB3S-13对大丽轮枝菌的拮抗作用结果图；

图5为大丽轮枝菌孢子液与HB3S-13细菌菌液等体积混合后得到的混合液1对棉 苗接种后30d的防治效果图；

图6为大丽轮枝菌孢子液与HB3S-13细菌发酵液等体积混合后得到的混合液2对 棉苗接种后30d的防治效果图；

图7为仅接种大丽轮枝菌孢子液后30d的棉苗生长对照图(阳性对照组图)；

图8为HB3S-13细菌与大丽轮枝菌对扣培养的对照生长速度比较图，其中(a)为 与HB3S-13细菌对扣培养14d后大丽轮枝菌的菌落生长情况，(b)为与空白皿对扣培 养14d后大丽轮枝菌的菌落生长情况。

内生细菌HB3S-13，于2015年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015604。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明 的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本 发明的保护范围之内。

以下实施例所使用的培养基配方为：

查氏培养基配方：硝酸钾2g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸 亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂15g，蒸馏水1L，pH7.3±0.2；

PDA平板培养基配方：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1L；

NA培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，pH7.3，

蒸馏水1L。

实施例1

棉花内生菌HB3S-13的分离方法。

棉花内生菌的分离过程全部在超级工作台内进行，主要针对棉花的茎秆和主根进行 分离。将棉花的茎秆和主根切成3cm长的植物片段样品，然后将切成的植物样品按照 以下程序进行表面消毒:利用70％(v/v)的酒精消毒1min，然后用5％(v/v)的次氯酸 钠消毒5min，再次用70％(v/v)的酒精消毒30s，最后用无菌水漂洗3～5次，每次3 min。消毒完成的植物样品放在无菌的干燥滤纸上，无菌条件下吸干表面的水分。用消 毒的手术刀将茎秆和根的样品两端浸入消毒剂，其余部分用消毒手术刀切片，每片大约 2mm厚。切好的样品薄片立刻放在准备好的PDA平板或者NA培养基上，置于25℃ 培养，获得的真菌或细菌菌落通过单孢或者单菌丝进一步纯化。

实施例2内生细菌HB3S-13进行形态鉴定。

菌株HB3S-13在NA培养基上的菌落形态为淡黄色，菌落为圆形，有凸起；菌体杆 状，见图1。对菌株HB3S-13进行革兰氏染色，判断其为革兰氏阴性杆状细菌，其形态 如图2a、图2b所示。

实施例316SrRNA分子鉴定。

用16SrRNA序列的相应引物扩增，16SrRNA的长度为1333bp，具体如SEQIDNo.1 所示。

SEQIDNo.1

序测结果与NCBI上的序列进行比对后发现，其与Agrobacteriumsp.的16SrRNAITS 序列的同源性达到100％，将HB3S-13归属为根瘤菌属(Agrobacteriumsp.)。综合HB3S-13 形态特征、生理特征和分子鉴定结果，将HB3S-13归属为Agrobacteriumsp.。

实施例4内生细菌HB3S-13对棉花黄萎病菌的拮抗作用(室内)。

将新鲜的大丽轮枝菌V225菌饼接种在PDA平板的中央，25℃培养3d后，分别吸 取50ulHB3S-13菌液置于离菌落边缘2cm处的四个角，观察两个菌是否存在拮抗作用。 对峙培养结果如图4所示，结果表明，两个菌之间并不存在拮抗作用，均生长良好。

实施例5内生细菌HB3S-13对棉花黄萎病的抑制作用。

将大丽轮枝菌V225(落叶型菌株)菌块接种到查氏培养基中，25℃、150rpm摇菌 培养7～10d，然后用灭菌4层纱布过滤后获得黄萎病菌孢子液，所述孢子液浓度为5╳10⁶个孢子/ml，备用；

将HB3S-13的菌液接种到NA培养基中，28℃、150rpm摇菌培养3d后，用血球计数 板调整菌液浓度为1╳10⁸个/ml，然后将菌液移至50ml离心管中，常温下6000r/min离 心10分钟，离心后，上清液为HB3S-13菌株的代谢产物，即HB3S-13细菌发酵液；将离 心后得到的下层沉淀用无菌水悬浮，得到HB3S-13细菌菌液；

将上述大丽轮枝菌孢子液与HB3S-13细菌菌液等体积混合均匀后得混合菌液1，将 大丽轮枝菌孢子液与HB3S-13细菌发酵液进行等体积均匀混合后得混合菌液2，另外还 分别将大丽轮枝菌孢子液3以及无菌水4作为阳性对照和阴性对照组，对后续棉苗进行浸 根处理。

以感病品种冀棉11为供试品种，将感病品种冀棉11的棉种脱绒后，浸泡1h，种入 棉花基质中，待棉苗长至1～2片真叶时将棉苗从基质中移出，待接种用；接种的方法即 将棉苗的根部分别浸入上述所述混合菌液1、混合菌液2、大丽轮枝菌孢子液3、无菌水4 中，20min后再用基质分别种入到一次性塑料杯中，每组分别处理15株棉苗，分装在5 个塑料杯中，每个杯中3株苗子。

接种后第15d开始调查病情指数，每隔两天调查一次病情指数至接种后25d，计算 病情指数、病株率以及防治效果。实验重复3次，试验结果如图5、图6、图7所示，病情 调查结果见表一和表二，结果表明，阳性对照的病情指数远远高于HB3S-13处理后的病 指，无菌水阴性对照不发病。多次重复的结果表明HB3S-13细菌菌液对棉花黄萎病的平 均防治效果为71.15％，HB3S-13细菌发酵液对棉花黄萎病的平均防治效果为60.67％。

表一：温室病情指数情况调查表

表二：多次重复实验防效结果表

实施例6内生细菌HB3S-13的挥发性物质对大丽轮枝菌的抑制作用。

采用对扣培养法，取直径为90mm的培养皿两个，在皿底(a)、皿底(b)中分 别倒入20ml的PDA培养基，然后将大丽轮枝菌菌饼接种到皿底(b)中的PDA培养基中， 将内生细菌HB3S-13菌液100ul均匀涂布在皿底(a)中的PDA培养基中，将两个皿对扣， 用封口膜封住，置于25℃恒温培养箱中培养，以皿底(a)中不接菌作为对照。实验重 复三次。观察大丽轮枝菌的生长状况，第8d开始采用十字交叉法计算菌落直径计算其生 长速度，每隔1d测一次，直到第14d。以第14d所测出的数值计算HB3S-13内生细菌挥发 性代谢产物对大丽轮枝菌生长的抑制率，14天后大丽轮枝菌的生长状况见图8(b)。另 外，设计一组对照实验，准备上述相同大小的培养皿，按上述同样步骤对大丽轮枝菌进 行对扣培养，区别仅在于皿底(a)中不涂布内生细菌HB3S-13菌液。

抑制率＝(对照平均直径-处理平均直径)/对照平均直径×100％。结果见表三。

结果表明HB3S-13菌液产生的挥发性物质能够抑制黄萎病菌的生长，抑制率为 52％。

表三：HB3S-13与大丽轮枝菌对扣培养组和对照组中大丽轮枝菌生长情况比较表

实施例7内生细菌HB3S-13对棉花种子出苗率的影响。

以感病品种冀棉11为供试品种，将感病品种冀棉11的种子脱绒后，浸入到HB3S-13 菌液中浸泡12h后，种入棉花基质中；以清水处理过的冀棉11的种子作为对照组，3d 后计算其出苗率。结果表明，HB3S-13菌液处理后的种子出苗率为68.67％，清水处理 后的种子(对照组)出苗率为75.5％，说明，HB3S-13内生细菌对种子出苗率的影响小。