一种分离自臭辣树的化合物及其抗虫用途

摘要

本发明涉及分离自臭辣树的化合物及其抗虫用途。所述化合物具有杀线虫活性，其结构式如图1所示。制备方法为：以臭辣树为原料进行分离提纯，所述分离提纯包括乙醇浸提、三氯甲烷萃取和硅胶柱层析。以本发明化合物或其盐为活性成分制备抗虫制品，可有效杀灭线虫，与杀线虫化合物呋喃丹的活性相当。由于本发明分离获得的新化合物是从臭辣树植物中提取而得，在自然条件下易分解，因此不会引起生物富集现象，并且对人畜安全，可以作为天然农药长期使用而不会产生环境污染的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病害防治技术，具体涉及分离自臭辣树的化合物及其抗虫用途。

背景技术

臭辣树(Tetradiumglabrifolium)，芸香科四数花属，为落叶乔木，多生于向阳的山坡地上， 湿润树丛中，分布于江西、浙江及长江上、下游各地。臭辣树以果入药，主治麻疹后咳嗽。 目前对于臭辣树果实的认识仅仅是具有药用活性，未曾有研究报道过臭辣树果实的抗虫活性。

南方根结线虫(Meloidogyneincognita)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫，雌雄异 体，主要危害各种蔬菜的根部，表现为侧根和须根较正常增多，并在幼根的须根上形成球形 或圆锥形大小不等的白色根瘤，有的呈念珠状，被害株地上部分生长矮小、缓慢、叶色异常， 结果少，产量低，甚至造成植株提早死亡。目前，对南方根结线虫的防治主要采用化学防治 的方法，常用杀线虫剂多为有机磷或氨基甲酸酯类的单剂或复配制剂，如噻唑磷、硫线磷、 涕灭威、克百威等。化学防治在根结线虫的防治过程中占有重要地位，见效快、防效好，是 果农、菜农深受青睐的方法。但目前使用的化学杀线剂存在毒性大、环境污染严重、易产生 抗药性等诸多问题。因此,随着农民环保意识的增强和线虫抗药性的增加，化学杀线虫剂的 应用前景黯淡。因此，需要开发一种毒性小、不易使线虫产生抗药性的环保型药物，提高蔬 菜的产量和品质，保护人类健康。

发明内容

为满足上述领域的需求，本发明提供一种从臭辣树的乙醇浸膏中分离的新化合物，该化 合物能够有效杀灭根结线虫。本发明请求保护的技术方案如下：

如式(I)所示的化合物：

权利要求1所述的化合物与无机酸或有机酸形成的盐。

权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐在防治线虫中的用途。

权利要求1所述的化合物或权利要求2所述的盐在制备抗虫制品中的用途。

一种抗虫制品，其特征在于，其抗虫活性成份包含权利要求1所述的化合物或权利要求 2所述的盐。

所述抗虫制品的制备方法，包括以下步骤：以臭辣树为原料进行分离提纯并获得权利要 求1所述的化合物或权利要求2所述的盐。

所述分离提纯包括采用乙醇浸提、三氯甲烷萃取和硅胶柱层析。

臭辣树在防治线虫中的用途。

一种抗虫制品，其特征在于，其药效成分为臭辣树的乙醇浸膏。

本发明提供一种新化合物，其结构如图1所示，所述新化合物是采用硅胶柱层析方法从 臭辣树乙醇浸膏中分离而得。经鉴定，该化合物是一种生物碱，为无色针状结晶，碘化铋钾 反应显阳性，分子式为C₁₇H₁₅N₃O，分子量为277，其化学命名是 7,8,13,14-tetrahydrobenzo[3,4][1,5]diazonino[6,7-b]indol-5(6H)-one。将所述化合物对南方根结 线虫二龄幼虫进行室内毒力测定，结果表明该化合物具有杀线虫活性。与杀线虫化合物呋喃 丹相比，新化合物的LD₅₀是阳性对照呋喃丹的1.8倍，与阳性对照的杀线活性相当，有望成 为新一代生物农药。

本发明分离获得的新化合物，可使用二甲苯、甲苯、C₁₀芳烃、乙醇、乙腈等作为溶剂， 加入吐温、甘油等作为助溶剂，制成抗虫制品，用于杀灭线虫，提高蔬菜的产量和品质。由 于本发明分离获得的新化合物是从臭辣树植物中提取而得，在自然条件下易分解，因此不会 引起生物富集现象，并且对人畜安全，可以作为天然农药长期使用而不会产生环境污染的问 题。在本发明的一些实施例中，所述抗虫制品也可以包含化学上相容的其它的本领域已知的 具有抗虫活性的化合物，从而增强抗虫效果。

在本发明的一些实施例中，将本发明的新化合物与无机酸或有机酸形成生理上可接受的 盐，使化合物结构更加稳定，有利于保存和制备抗虫制品，发挥抗虫活性。

实验证明，臭辣树的乙醇浸膏也具有杀线虫活性，可将其粗提物直接用于杀灭线虫，或 与适合的溶剂及辅助试剂一起制成抗虫制品。在本发明的一些实施例中，可以将臭辣树的乙 醇浸膏与本领域公知的具有杀虫活性的其它化合物同时使用，发挥综合的抗虫作用。

附图说明

图1.式(I)化合物的结构式

图2.式(I)化合物的¹H-NMR谱图

图3.式(I)化合物的¹³C-NMR谱图

图4.式(I)化合物的HMBC谱图

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，需要理解的是，下述实施方式仅作为解释 说明，而不构成对本发明保护范围的任何限制。

生物材料：

臭辣树：采自浙江温州丽水。

南方根结线虫：为中国农业大学昆虫系人工饲养。

实验仪器：

BrukerACF300和AMX500超导核磁共振仪，瑞士Bruker公司；

玻璃色谱柱：直径与长度85×550mm，40×400mm、35×400mm、30×400、25×400mm、 20×350mm，购于北京博美玻璃有限公司。

材料与试剂：

层析硅胶(200-300目)采自青岛海洋研究所；

薄层层析硅胶板(GF254)购于青岛海洋化工有限公司；

石油醚、乙酸乙酯、乙醇、丙酮等均购自国药集团化学试剂有限公司；

95％酒精采购自北京广达恒益有限公司。

本实施例未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可通过本领域常规方法配制 而得，或商购获得，规格为实验室纯级即可。

实施例1、式(I)化合物的分离

1、臭辣树乙醇浸膏的制备

将干燥的臭辣树果实依次用95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和蒸馏水分别浸泡3天，在 50℃水浴锅中旋转蒸发器浓缩至没有酒精流出，然后经过三氯甲烷萃取，将水相弃去，留三 氯甲烷相在40℃水浴锅中进行减压蒸发浓缩至没有酒精流出，除去三氯甲烷，即得到三氯甲 烷萃取物，即本发明中的臭辣树果实乙醇浸膏。

2、提取物的一级硅胶柱层析分离

(1)确定起始洗脱剂

首先采用薄层层析确定起始洗脱剂，具体步骤为：取1μL步骤1获得的乙醇浸膏，用丙 酮稀释，用毛细管点样于GF254薄层色谱板上，在层析缸中加入1mL按一定比例配比(100:2～ 0:100)的石油醚:乙酸乙酯洗脱剂。将点好样品的薄层板放入展开剂中，浸入展开剂的深度为 距薄层板底边0.3～0.5cm，盖上缸盖，待展开至距薄层板上沿0.5～1.0cm时，取出薄层板， 用电吹风吹干溶剂，在紫外灯下观察展开情况，并将薄层板放入碘缸中显色，当最前沿斑点 的Rf值在0.2～0.3时，即可确定此展开剂为起始洗脱剂。最后确定的起始洗脱剂的石油醚: 乙酸乙酯配比是100:2。

(2)装柱

采用湿装法装柱，将玻璃色谱柱(85×550mm)垂直固定在铁架台上，在柱的下端塞少许 脱脂棉花，倒入一药匙石英砂，防止硅胶泄漏。将200～300目硅胶放入烧杯中，加入适当量 的起始洗脱剂，经充分搅拌，将硅胶内的气泡除去后再加入柱内，一边沉降一边添加。硅胶 加完后，仍使起始洗脱剂流一段时间，然后使色谱柱中高于硅胶面上的起始洗脱剂几乎全部 流入接受瓶内。然后用橡皮塞在色谱柱外敲打，将硅胶柱内的气泡赶净。色谱柱装好后，使 其静置过夜，以压实硅胶，提高分离效果。

(3)加样

样品的加入，采用干法加样。待硅胶柱静置过夜后，先将色谱柱中硅胶面上的多余洗脱 剂放出。用丙酮溶解样品，加入适当量的200-300目硅胶拌匀，用吹风机吹干溶剂成粉末状， 用小勺将拌匀后的样品缓慢加入色谱柱中。样品加入后，用滴管吸取少量起始洗脱剂缓缓冲 洗色谱柱壁，打开活塞将洗脱剂慢慢放出，待柱面上没有洗脱剂时，将一块脱脂棉平铺于柱 面，压上玻璃棒，防止加入洗脱剂时破坏色谱柱面，加入洗脱剂后，开始分离。

(4)洗脱

洗脱剂采用石油醚-乙酸乙酯-乙醇，按极性从小到大梯度洗脱 (100:2:0,100:5:0,100:10:0,100:20:0……100:100:0,100:100:2,100:100:5……100:100:50)，采用 等馏分收集法(500mL)收集，使用旋转蒸发仪回收溶剂，在回收过程中将馏分经薄层层析 (TLC)检验后将成分相同或相似者合并。洗脱时先加起始洗脱剂，每个洗脱剂梯度一般收 集5-6个500mL馏分，按从小到大增加洗脱剂(石油醚：乙酸乙酯：无水乙醇)极性。加到 50％无水乙醇后，当收集5-6个收集瓶后，洗脱剂不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶 剂时，加入无水乙醇洗脱，收集5-6个收集瓶时，洗脱剂不再倒回色谱柱内，待到柱内表面 没有溶剂时，加入水洗脱，洗脱下来的溶液用三氯甲烷萃取，萃取液经旋转蒸发仪回收试剂。 臭辣树乙醇浸膏经一级柱层析分离，并通过薄层层析检测合并相同的组分，然后继续进行细 分离。

3、提取物的二级硅胶柱层析分离

(1)确定起始洗脱剂：采用薄层层析检验，确定各部分起始洗脱剂，方法同一级硅胶柱层析 分离。

(2)装柱：采用湿法装柱，玻璃色谱柱规格为35×400mm，30×400mm，40×400mm，其余 同一级硅胶柱层析分离。

(3)加样：样品的加入，采用干法加样，方法同一级硅胶柱层析分离。

(4)洗脱：二级柱层析分离采用等梯度洗脱，按等馏分收集法(150mL)收集，使用旋转蒸 发仪回收溶剂，经薄层层析(TLC)检验后将成分相同或相似者合并。当活性成分成功洗脱 后，洗脱液不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂时，加入无水乙醇洗脱，收集4-5个 收集瓶后，洗脱液不再倒回色谱柱内，直到没有洗脱液可收集。

4、NMR和MS分析

将样品用氘代氯仿(CDCl3)溶解，加入核磁管，由北京师范大学分析测试中心核磁共 振实验室应用BrukerDRX500核磁共振波谱仪测定¹H-NMR，¹³C-NMR和HMBC。由北京师 范大学放射性药物教育部重点实验室应用QuattroMicro串联四级杆质谱仪测定ESI。

实验结果：

NMR和MS的测定结果如下所示，分析鉴定出的新结构化合物是一种生物碱，为无色针 状结晶，碘化铋钾反应显阳性，分子式为C₁₇H₁₅N₃O，分子量为277，其结构如图1所示，化 学命名为7,8,13,14-tetrahydrobenzo[3,4][1,5]diazonino[6,7-b]indol-5(6H)-one。

mp:223-225℃；ESI-MSm/z:579.29[2M+Na]+，301.14[M+Na]+；¹H-NMR(500MHz, CDCl₃)δ(ppm):3.26(2H,dd,J＝6.8、6.4Hz,6-H),4.61(2H,dd,J＝6.8、6.4Hz,5-H),7.20(1H,t, J＝7.5Hz,10-H),7.35(1H,t,J＝7.5Hz,11-H),7.45(1H,d,J＝8.0Hz,9-H),7.46(1H,t,J＝7.8Hz, 18-H),7.65(1H,d,J＝8.0Hz,12-H),7.66(1H,d,J＝8.0Hz,16-H),7.71(1H,t,J＝8.0Hz,17-H), 8.33(1H,d,J＝8.0Hz,19-H),9.54(1H,brs,N-H).¹³C-NMR(125MHz,CDCl₃)δ(ppm):19.7 (C-6),41.2(C-5),112.1(C-12),120.2(C-10),120.2(C-20),120.6(C-7),120.6(C-9),125.3(C-11), 126.3(C-8),126.6(C-18),127.4(C-19),127.4(C-16),134.8(C-17),138.9(C-13),145.1(C-2), 145.1(C-15),161.1(C-1).

实施例2、式(I)化合物及臭辣树乙醇浸膏对南方根结线虫的毒力测定

试验药物：实施例1中获得的式(I)化合物及臭辣树乙醇浸膏。

试虫：南方根结线虫。

试验方法：

以无水乙醇为溶剂配制浓度为10mg/250μL的式(I)化合物母液备用。试验中用含有1％ 无水乙醇的蒸馏水溶液作为稀释剂，配制浓度分别为400ppm、200ppm、100ppm、50ppm、 25ppm的式(I)化合物溶液各4ml，每个浓度重复三次。将试虫放置在24孔培养板内，每 孔放入40-60头均一大小的南方根结线虫。记录放入活虫数，每个重复加入1mL已配制好的 式(I)化合物溶液，加入溶液时从培养板边沿缓慢加入，以免对试虫造成不利影响。将培养 板置于温度为25℃恒温培养箱内，72h后检查活虫数，即得死亡虫数。判断方法为：卷曲或 者游动均为活。利用SPSS软件计算得到式(I)化合物的致死中浓度。以呋喃丹作为阳性对 照。

臭辣树乙醇浸膏的毒力测定步骤与化合物相同，只是母液配制为20mg/250μL，并稀释 为800ppm、400ppm、200ppm、100ppm、50ppm。

死亡率(％)＝100×死虫数/试虫数

校正死亡率(％)＝100×处理组死亡率-对照组死亡率/1-对照组死亡率

半致死剂量(LD₅₀)即引起50％试虫死亡率的剂量，使用Probit软件包计算得到半致死 剂量。

实验结果：

式(I)化合物对南方根结线虫的毒性测定结果如表1所示。

表1式(I)化合物及对南方根结线虫的毒性

处理 测试浓度(μg/mL) LD₅₀(μg/mL) 95％置信区间 Χ²(卡方值) 乙醇浸膏 50.0-800.0 292.08 260.37-328.28 9.50 新化合物 25.0-400.0 130.62 100.24-174.21 4.22 呋喃丹 25.0-400.0 72.29 37.86-117.97 13.57

呋喃丹作为阳性对照对根结线虫的LD₅₀为72.29μg/mL，新化合物的LD₅₀是阳性对照呋 喃丹的1.8倍，与阳性对照的杀线活性相当。从表1可以看出，臭辣树的乙醇浸膏也具有杀 线虫活性。

本发明分离获得的式(I)化合物是从臭辣树植物中提取，在自然条件下易分解，不会引 起生物富集现象，并且对人畜安全，可以作为天然农药长期使用而不会产生环境污染的问题。