离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法

摘要

本发明公开了一种离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法，该方法包括：制备含有吡咯喹啉醌的混合液，采用离子对双水相萃取体系对含有吡咯喹啉醌的混合液进行萃取，分离上层，得到富含吡咯喹啉醌的有机层，将富含吡咯喹啉醌的有机层上阴离子交换树脂，依次用双蒸水、稀酸冲洗，收集稀酸部位，冷冻干燥，纯化，得到吡咯喹啉醌。本发明根据PQQ结构的特点，即PQQ的结构中包含3个羧基，显示酸性，利用离子对双水相体系对其进行分离纯化。本发明采用四丁基氢氧化铵作为离子对试剂，与PQQ结合在一起，使PQQ选择性的分配在有机相中，而其他水溶性杂质分配到水相中，从而达到高效性、高选择性地分离纯化PQQ。

说明书

技术领域

本发明涉及一种离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法，属于生物化工领域。

背景技术

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinolinequinine，PQQ)是一种水溶性醌类化合物，是葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的辅酶，被认为是新的B族维生素(Nature2003；422:832)。PQQ分子量为330，最早是在微生物中发现，随后研究表明其也存在于动植物体内，结构式如下式所示：

目前已证明PQQ具有重要的生理功能，比如维持皮肤健康、刺激神经生长因子、增强免疫功能、促进细胞生长、抗氧化、清除自由基、增强细菌对极端环境条件的耐受性以及参与细胞信号传导等。在医药领域，PQQ具有防治肝损伤、保护神经组织、刺激能量生成、强化免疫等生理功能。因此，可以用于治疗帕金森综合症、老年痴呆、心脏病、肝硬化等。在畜禽养殖业中，PQQ作为一种新型类维生素物质，可促进机体生长、提高繁殖、抗氧化、抗应激和增强免疫，比如在饲料中添加适量PQQ可以在一定程度上提高蛋鸡产蛋率和鸡蛋品质，并能显著提高蛋鸡的抗氧化能力。由于其独特的理化性质和多样的生理功能，可用于食品、医药、农业、工业等领域，具有广泛的开发应用前景。

在PQQ生产中，从混合物中分离纯化PQQ，获得高纯度产品是至关重要的步骤。但是，PQQ水溶性强、反应液中浓度低，普通萃取方法萃取效率低、选择性差，严重制约着PQQ的大规模生产应用。因此，寻找一种简便高效的分离纯化方法迫在眉睫。

双水相萃取体系是一种性质温和的分离体系，可适用于生物化工、金属及络合物的分离、中草药中有效成分的提取及有机物的分离等领域。该体系具有体系简单、原料价廉、低毒、无乳化现象等优点，是一种具有潜在工业化应用价值的分离体系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法，该方法能够简单、高效分离得到吡咯喹啉醌。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：

(1)制备：利用吡咯喹啉醌生产菌制备含有吡咯喹啉醌的混合液；

(2)萃取：采用离子对双水相萃取体系对含有吡咯喹啉醌的混合液进行萃取，分离上层，对下层进行重复萃取，合并分离的上层，得到富含吡咯喹啉醌的有机层；其中，萃取体系由离子对试剂和磷酸氢钠缓冲液(PB)组成，离子对试剂和磷酸氢钠缓冲液的体积比为3-5:1-2；

(3)分离：将富含吡咯喹啉醌的有机层上阴离子交换树脂，依次用双蒸水、稀酸冲洗，收集稀酸部位，冷冻干燥，得到吡咯喹啉醌粗品；

(4)纯化：将吡咯喹啉醌粗品用超纯水溶解，pH调至3～4，加入乙醇，搅拌后静置，得到吡咯喹啉醌。

所述含有吡咯喹啉醌的混合液为吡咯喹啉醌生产菌发酵培养的发酵液。

步骤(2)萃取时萃取体系和含有吡咯喹啉醌的混合液的体积比为4-7:2-4。

所述离子对试剂为四丁基氢氧化铵溶液，浓度为0.5-1.5mol/L。

所述磷酸氢钠缓冲液浓度为0.1-0.9mol/L，pH值为4.5-6.5。

所述阴离子交换树脂为WA30型弱阴离子交换树脂。

所述稀酸为体积分数0.5-1％的稀盐酸。

步骤(4)中吡咯喹啉醌粗品用超纯水溶解至终浓度为9-12g/L，超纯水与乙醇的体积比为3-5:1。

步骤(4)中调节pH所用试剂为盐酸。

步骤(4)中搅拌温度为20-25℃，搅拌时间为5-6h，静置时间为12-24h。

本发明离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法的原理如下所示：

本发明有益效果：

1、双水相体系是一类新型萃取分离体系，它是由水溶性有机小分子和一种盐的水溶液在一定浓度下混合自发形成的两相体系。本发明根据PQQ结构的特点，即PQQ的结构中包含3个羧基，显示酸性，利用离子对双水相体系对其进行分离纯化。

2、本发明采用四丁基氢氧化铵作为离子对试剂，与PQQ结合在一起，使PQQ选择性的分配在有机相中，而其他水溶性杂质分配到水相中，从而达到高效性、高选择性地分离纯化PQQ。

3、本发明通过优化萃取体系与含有吡咯喹啉醌的混合液的比例，和离子对试剂与磷酸氢钠缓冲液的比例，最大程度上提高了分离纯化得到的吡咯喹啉醌的纯度和吡咯喹啉醌的回收率。实验表明，本发明分离得到的吡咯喹啉醌纯度可达99％以上，回收率可达85％以上。

4、本发明的方法工艺操作简单、成本低廉、便于大规模工业化生产，对促进PQQ的产业化发展具有重要意义。

附图说明

以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为紫外光谱分析结果，其中，A为PQQ样品，B为本发明结晶产物；

图2为本发明结晶产物的质谱分析结果；

图3为本发明萃取液中PQQ的HPLC分析结果；

图4为本发明结晶产物的HPLC分析结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

本发明所用的培养基配制方法如下：

发酵培养基：每升培养基中含有40g山梨醇、20g酵母提取物、5g(NH₄)₂SO₄、2gKH₂PO₄、5gMgSO₄·H₂O。

富集培养基：每升培养基中含有80g山梨醇、40g酵母提取物、10g(NH₄)₂SO₄、4gKH₂PO₄、10gMgSO₄·H₂O。

实施例1

本实施例离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：

(1)制备：将氧化葡萄糖酸杆菌按照5％的接种量，接种于发酵培养基中，在28℃条件下震荡培养3d，得到种子液；然后将种子液按照10％的接种量，接种于富集培养基，在28℃条件下震荡培养5d，培养液5℃、9000r/min离心15min，收集上清液，得到含有吡咯喹啉醌的发酵液；

(2)萃取：采用离子对双水相萃取体系对含有吡咯喹啉醌的发酵液进行萃取，萃取体系和含有吡咯喹啉醌的发酵液的体积比为4:2，分离上层，对下层进行重复萃取3次，合并分离的上层，得到富含吡咯喹啉醌的有机层；其中，萃取体系由0.5mol/L的四丁基氢氧化铵溶液和0.1mol/L、pH值4.5的磷酸氢钠缓冲液按照体积比3:1的比例混合而成；

(3)分离：将富含吡咯喹啉醌的有机层上WA30型弱阴离子交换树脂，依次用双蒸水、体积分数1％稀盐酸冲洗，收集稀盐酸部位，冷冻干燥，得到吡咯喹啉醌粗品；

(4)纯化：将吡咯喹啉醌粗品用超纯水溶解，至终浓度为11g/L，用盐酸调节pH至3，加入乙醇，在20℃条件下搅拌5h后，静置12h，得到吡咯喹啉醌的晶体；其中，超纯水与乙醇的体积比为5:1。

实施例2

本实施例离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：

(1)制备：将氧化葡萄糖酸杆菌按照5％的接种量，接种于发酵培养基中，在28℃条件下震荡培养3d，得到种子液；然后将种子液按照10％的接种量，接种于富集培养基，在28℃条件下震荡培养5d，培养液5℃、9000r/min离心15min，收集上清液，得到含有吡咯喹啉醌的发酵液；

(2)萃取：采用离子对双水相萃取体系对含有吡咯喹啉醌的发酵液进行萃取，萃取体系和含有吡咯喹啉醌的发酵液的体积比为5:3，分离上层，对下层进行重复萃取3次，合并分离的上层，得到富含吡咯喹啉醌的有机层；其中，萃取体系由0.8mol/L的四丁基氢氧化铵溶液和0.5mol/L、pH值5.0的磷酸氢钠缓冲液按照体积比4:1的比例混合而成；

(3)分离：将富含吡咯喹啉醌的有机层上WA30型弱阴离子交换树脂，依次用双蒸水、体积分数1％稀盐酸冲洗，收集稀盐酸部位，冷冻干燥，得到吡咯喹啉醌粗品；

(4)纯化：将吡咯喹啉醌粗品用超纯水溶解，至终浓度为9g/L，用盐酸调节pH至4，加入乙醇，在22℃条件下搅拌6h后，静置16h，得到吡咯喹啉醌的晶体；其中，超纯水与乙醇的体积比为3:1。

实施例3

本实施例离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：

(1)制备：将氧化葡萄糖酸杆菌按照5％的接种量，接种于发酵培养基中，在28℃条件下震荡培养3d，得到种子液；然后将种子液按照10％的接种量，接种于富集培养基，在28℃条件下震荡培养5d，培养液5℃、9000r/min离心15min，收集上清液，得到含有吡咯喹啉醌的发酵液；

(2)萃取：采用离子对双水相萃取体系对含有吡咯喹啉醌的发酵液进行萃取，萃取体系和含有吡咯喹啉醌的发酵液的体积比为7:4，分离上层，对下层进行重复萃取3次，合并分离的上层，得到富含吡咯喹啉醌的有机层；其中，萃取体系由1.0mol/L的四丁基氢氧化铵溶液和0.9mol/L、pH值6.0的磷酸氢钠缓冲液按照体积比5:2的比例混合而成；

(3)分离：将富含吡咯喹啉醌的有机层上WA30型弱阴离子交换树脂，依次用双蒸水、体积分数0.5％稀盐酸冲洗，收集稀盐酸部位，冷冻干燥，得到吡咯喹啉醌粗品；

(4)纯化：将吡咯喹啉醌粗品用超纯水溶解，至终浓度为12g/L，用盐酸调节pH至3，加入乙醇，在23℃条件下搅拌6h后，静置18h，得到吡咯喹啉醌的晶体；其中，超纯水与乙醇的体积比为4:1。

实施例4

本实施例离子对双水相萃取分离吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：

(1)制备：将氧化葡萄糖酸杆菌按照5％的接种量，接种于发酵培养基中，在28℃条件下震荡培养3d，得到种子液；然后将种子液按照10％的接种量，接种于富集培养基，在28℃条件下震荡培养5d，培养液5℃、9000r/min离心15min，收集上清液，得到含有吡咯喹啉醌的发酵液；

(2)萃取：采用离子对双水相萃取体系对含有吡咯喹啉醌的发酵液进行萃取，萃取体系和含有吡咯喹啉醌的发酵液的体积比为4:2，分离上层，对下层进行重复萃取3次，合并分离的上层，得到富含吡咯喹啉醌的有机层；其中，萃取体系由1.5mol/L的四丁基氢氧化铵溶液和0.6mol/L、pH值6.5的磷酸氢钠缓冲液按照体积比3:1的比例混合而成；

(3)分离：将富含吡咯喹啉醌的有机层上WA30型弱阴离子交换树脂，依次用双蒸水、体积分数0.8％稀盐酸冲洗，收集稀盐酸部位，冷冻干燥，得到吡咯喹啉醌粗品；

(4)纯化：将吡咯喹啉醌粗品用超纯水溶解，至终浓度为10g/L，用盐酸调节pH至3，加入乙醇，在25℃条件下搅拌6h后，静置24h，得到吡咯喹啉醌的晶体；其中，超纯水与乙醇的体积比为5:1。

实验例

1、产物分析

1.1、紫外光谱分析

采用紫外光谱仪对本发明的结晶产物与PQQ样品同时进行检测，结果见图1。结果表明，本发明与PQQ样品的紫外光谱结果一致。

1.2、质谱分析

采用质谱仪对本发明的结晶产物进行检测，结果见图2。将本发明的结晶产物质谱数据与已知PQQ质谱数据对比，结果表明，本发明的结晶产物与已知PQQ质谱数据一致。

1.3、HPLC法检测

检测方法：采用XB-SAX色谱柱，以乙腈：水(乙腈和pH为5.8的磷酸氢钠缓冲液)＝1:99为流动相，流速1ml/min，洗脱10min，检测波长249nm。

检测对象：萃取液(富含吡咯喹啉醌的有机层)、结晶产物。

结果分析：HPLC分析结果见图3、4。图3表明，萃取液中有较高含量的目标物，萃取具有较高选择性；图4表明，通过重结晶，结晶产物纯度达到99％以上。

1.4、回收率

对实施例1-4的结晶产物回收率进行测定，结果见下表。

表本发明PQQ回收率的结果分析