吡咯喹啉醌在制备防治骨质疏松症产品中的应用

摘要

吡咯喹啉醌在制备防治骨质疏松症产品中的应用，涉及骨质疏松症防治技术领域，上述产品包括药品和保健品。吡咯喹啉醌能够通过抑制氧化应激，刺激成骨细胞骨形成，抑制破骨细胞骨吸收，发挥预防衰老引起的骨质疏松包括颌骨疏松的作用；同时，吡咯喹啉醌能够通过抑制氧化应激，刺激成骨细胞骨形成，抑制破骨细胞骨吸收，发挥预防雌激素缺乏或雄激素缺乏引起的骨质疏松的作用。

说明书

技术领域

本发明属于骨质疏松症防治技术领域，具体涉及一种吡咯喹啉醌在制备防治骨质疏松症产品中的应用。

背景技术

骨质疏松症(Osteoporosis)为一种慢性代谢性骨疾病，由于骨的慢性丢失引起相关疾病往往需要数十年之久，在骨变得很脆弱甚至发生骨折之前通常没有明显的临床症状，因而被称为沉默的贼(thesilentthief)。全世界大约有2亿骨质疏松症患者，其中有7500万来自欧洲、美国和日本。在50岁以上患者中，大约2位女性中有1位，5位男性中有1位最终都会经历骨质疏松症骨折的发生。中国是一个人口大国，目前已经进入了老龄化社会，截止2011年底，中国60岁及以上人口为1.85亿，占全国总人口的13.7％。随着人口老龄化的不断加剧，与衰老相关的疾病发病率大幅上升，比如在50岁以上的人群中，1/3的女性和1/5的男性受到骨质疏松症的困扰。骨质疏松症由多种因素所致，它的基本病理机理是骨代谢过程中骨吸收和骨形成的偶联出现缺陷，导致人体内的钙磷代谢不平衡，使骨密度逐渐减少而引起的临床症状，被认为是一种衰老相关疾病，严重危害人类的健康。

吡咯喹啉醌(PyrroloquinolineQuinone，PQQ)首次在甲基营养菌中被鉴定为一种乙醇和葡萄糖脱氢酶的新型辅因子，目前被认为是一种重要的营养生长因子。研究发现，PQQ的化学结构为一种4,5-二氢-4,5-二氧代-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸复合物，分子式为C₁₄H₆N₂O₈，分子量为330.21，被认为是细菌葡萄糖脱氢酶氧化还原的辅因子，广泛分布于植物、细菌、动物、食物以及许多生物体液内，具有水溶性和热稳定性等特点，存在氧化和还原形式。

大量文献证实PQQ具有多种生理学功能，如促生长和生殖、抗氧化和促氧化、神经保护和心血管保护、增强免疫功能、以及抗肿瘤的作用，另有研究还发现，PQQ具有增强学习和记忆功能。然而，PQQ防治骨质疏松中的作用及机制尚未见报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种吡咯喹啉醌在制备防治衰老相关骨质疏松症产品中的应用。

技术方案：吡咯喹啉醌在制备防治衰老相关骨质疏松症药品中的应用。

吡咯喹啉醌在制备防治衰老相关骨质疏松症保健品中的应用。

吡咯喹啉醌在制备雄激素缺乏引起的骨质疏松症药品或保健品中的应用。

吡咯喹啉醌在制备雌激素缺乏引起的骨质疏松症药品或保健品物中的应用。

防治骨质疏松症的药品，有效成分为吡咯喹啉醌。

防治骨质疏松症的保健品，有效成分为吡咯喹啉醌。

本发明的化合物或其药学上可接受的盐还可制成各种制剂，包含但不限于片剂、胶囊、颗粒剂、注射液、冻干粉等。

有益效果：本发明所述吡咯喹啉醌可用于制备防治衰老相关骨质疏松症药品和保健品。

附图说明

图1为小鼠基因型鉴定图；其中+/+：野生型；-/-:纯合子；+/-:杂合子；

图2为PQQ补充对Bmi-1基因敲除(BKO)小鼠下颌骨、牙、胫骨生长的影响图；A：小鼠下颌骨、牙、胫骨X射线摄影图片；B：小鼠牙、胫骨显微CT扫描断层图片。

图3为PQQ补充对BKO小鼠下颌骨、牙、胫骨骨容量的影响图；A：小鼠下颌骨、牙切片HE染色显微摄影图片(×50)；B：小鼠下颌骨、牙切片总胶原染色显微摄影图片(×50)；C：小鼠第一磨牙根管壁厚度；D：小鼠下颌骨皮质骨厚度；E：小鼠下颌骨牙槽骨骨容量；F：小鼠胫骨HE染色显微摄影图片(×50)；G：小鼠胫骨总胶原染色显微摄影图片(×50)；H：小鼠胫骨骨容量。*，P<0.05；**，P<0.01，与WT小鼠比较；##，P<0.01，与BKO小鼠比较。

图4为PQQ补充对BKO小鼠前期牙本质发育和牙本质形成的影响图；A：小鼠下颌第一磨牙牙本质HE染色显微摄影图片(×400)；B：小鼠下颌第一磨牙牙本质双糖链蛋白多糖免疫组化染色显微摄影图片(×400)；C：小鼠下颌第一磨牙牙本质牙本质涎磷蛋白免疫组化染色(×400)；D：小鼠下颌第一磨牙前期牙本质厚度；E：小鼠下颌第一磨牙双糖链蛋白多糖阳性面积；F：小鼠下颌第一磨牙牙本质涎磷蛋白阳性面积。*，P<0.05；***，P<0.001，与WT小鼠比较；##，P<0.01；###，P<0.001，与BKO小鼠比较。

图5为PQQ补充对BKO小鼠下颌骨及胫骨成骨细胞骨形成的影响图；A：小鼠下颌牙槽骨及胫骨HE显微图片(×400)；B：小鼠下颌牙槽骨及胫骨碱性磷酸酶(ALP)组织化学染色显微图片(×400)；C：小鼠下颌骨及胫骨I型胶原(ColⅠ)免疫组织化学染色显微图片(×400)D：小鼠下颌骨及胫骨骨钙素(OCN)免疫组织化学染色显微图片(×400)；E：小鼠下颌牙槽骨及胫骨成骨细胞数；F：小鼠下颌牙槽骨及胫骨成骨细胞面积百分比；G：小鼠下颌牙槽骨及胫骨ALP阳性面积；H：小鼠下颌骨及胫骨ColⅠ阳性面积百分比；I：小鼠下颌骨及胫骨OCN阳性面积百分比。N.Ob/B.Pm(#/mm)：每毫米骨周径成骨细胞数；Ob.S/B.S(％)：成骨细胞面积百分比，*，P<0.05；**，P<0.01，***，P<0.001，与WT小鼠比较；#，P<0.05；##，P<0.01，###，P<0.001，与BKO小鼠比较。

图6为PQQ补充对BKO小鼠下颌骨及胫骨破骨细胞骨吸收的影响图；A：小鼠下颌牙槽骨抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)组织化学染色显微图片(×400)；B：小鼠胫骨TRAP组织化学染色显微图片(×400)；C：小鼠下颌牙槽骨及胫骨破骨细胞数；D：小鼠下颌牙槽骨及胫骨破骨细胞面积百分比。N.oc/B.Pm(#/mm)：每毫米骨周径破骨细胞数；oc.S/B.S(％)：破骨细胞面积百分比，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，与WT小鼠比较；#，P<0.05；##，P<0.01，与BKO小鼠比较。

图7为PQQ补充对BKO小鼠下颌骨、胫骨细胞增殖及凋亡的影响图；A：小鼠下颌骨及胫骨增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色显微图片(×400)；B：小鼠下颌骨及胫骨TUNEL染色显微图片(×400)；C：小鼠下颌骨和胫骨PCNA阳性细胞百分比；D：小鼠下颌骨及胫骨TUNEL阳性细胞百分比。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，与WT小鼠比较；#，P<0.05；##，P<0.01；###，P<0.001，与BKO小鼠比较。

图8为PQQ补充在纠正卵巢切除(OVX)引起的BMD和骨容量降低中的作用图；(A)代表性胫骨上端X线摄影图片。(B)代表性胫骨上端微-CT三维重建图。(C)代表性胫骨上端总胶原组织化学染色显微图片。(D)骨密度(BMD)定量结果图。(E)骨容量(BV/TV,％)定量结果图。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，与假手术对照组(Sham)比较；#，P<0.05；##，P<0.01，与OVX组小鼠比较。

图9为PQQ补充在纠正OVX引起的骨转换增加中的作用图；(A)代表性胫骨上端干骺端HE染色显微图片。(B)代表性胫骨上端干骺端碱性磷酸酶(ALP)染色显微图片。(C)代表性胫骨上端干骺端I型胶原(ColI)免疫组化染色显微图片。(D)代表性胫骨上端干骺端抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色显微图片。(E)成骨细胞数/单位骨面(N.Ob/B.S，#/mm)定量结果图。(F)ALP阳性面积定量结果图。(G)ColI阳性面积定量结果图。(H)TRAP破骨细胞面/单位骨面(Oc.S/B.S，％)定量结果图。*，P<0.05；**，P<0.01，与假手术对照组(Sham)比较；#，P<0.05；##，P<0.01，与OVX组小鼠比较。

图10为PQQ补充在纠正OVX引起的氧化应激增加中的作用图；(A)骨组织双氧水(H₂O₂)水平。(B)骨组织丙二醛(MDA)浓度.(C)骨组织总抗氧化能力(T-AOC).(D)骨组织SOD活性水平.*，P<0.05；**，P<0.01，与假手术对照组(Sham)比较；#，P<0.05；##，P<0.01，与OVX组小鼠比较。

图11为PQQ补充在纠正睾丸切除(ORX)引起的BMD和骨容量降低中的作用图；(A)代表性胫骨上端X线摄影图片。(B)代表性胫骨上端微-CT三维重建图。(C)骨密度(BMD)定量结果图。(D)骨容量(BV/TV，％)定量结果图。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，与假手术对照组(Sham)比较；#，P<0.05，与ORX组小鼠比较。

图12为PQQ补充在纠正ORX引起的骨容量和骨发生能力降低中的作用图；(A)代表性胸椎椎体微-CT三维重建图。(B)骨容量(BV/TV，％)定量结果图。(C)代表性胸椎椎体总胶原(TotalCol)组织化学染色显微图片。(D)总胶原阳性面积定量结果图。(E)亚甲基蓝阳性成纤维细胞集落形成单位(CFU-f)图片。(F)CFU-f阳性面积。(G)碱性磷酸酶阳性成纤维细胞集落形成单位(CFU-fap)图片。(H)CFU-fap阳性面积。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，与假手术对照组(Sham)比较；#，P<0.05；##，P<0.01，与ORX组小鼠比较。

图13为PQQ补充在纠正ORX引起的骨吸收增加中的作用图；(A)代表性胫骨上端干骺端抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色显微图片。(B)TRAP破骨细胞面/单位骨面(Oc.S/B.S，％)定量结果图。*，P<0.05，与假手术对照组(Sham)比较；#，P<0.05，与ORX组小鼠比较。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。

实施例1

为了明确PQQ在防治衰老相关骨质疏松中的作用，我们通过给予衰老相关骨质疏松的小鼠模型，Bmi-1基因敲除(BKO)小鼠饮食补充抗氧化剂PQQ，以正常饮食野生型(WT)和BKO小鼠作为对照，通过影像学、组织病理学和分子生物学的方法比较分析了三组动物的表型差异，研究PQQ补充在纠正Bmi-1缺失引起骨质疏松包括颌骨疏松中的作用。

材料与方法

实验动物

实验动物的繁殖Bmi-1基因敲除杂合子小鼠(由荷兰肿瘤研究所AntonBerns教授惠赠)由南京医科大学SPF级实验动物中心饲养，进行雌雄配对合笼，得到的子代小鼠用PCR方法进行基因型鉴定，获得同窝配对的野生型(WT)和Bmi-1^-/-(Bmi-1knockout，BKO)小鼠用于实验研究。

实验动物的分组取子代小鼠WT和BKO小鼠将分别给予以下不同处理：

A.正常饮食(WT)组：普通饮食饲养三周龄断奶后WT小鼠；

B.正常饮食(BKO)组：普通饮食饲养三周龄断奶后BKO小鼠；

C.PQQ补充(BKO+PQQ)组：普通饮食中添加PQQ(4mgPQQ/kg普通饲料)饲养三周龄断奶后BKO小鼠。

实验方法

基因型鉴定小鼠鼠尾片段用酚-氯仿-异戊醇的方法进行抽提DNA。通过PCR的方法进行基因型的鉴定^[MolofskyAV，HeS，BydonM，MorrisonSJ，PardalR.Bmi-1promotesneuralstemcellself-renewalandneuraldevelopmentbutnotmousegrowthandsurvivalbyrepressingthep16Ink4aandp19Arfsenescencepathways.GenesDev.2005；19(12):1432–1437.^]。

Bmi-1的正向引物序列为5′-CAGTTAGGCAGTATGTAGTTTTC-3′，

反向引物为5′-GTTGTGGTGGAGTGTAAGAGTGT-3′。

NEO基因的正向引物为5′-AAGATGTTGGCGACCTCGTATTGG-3′，

反向引物为5′-GCAAGACCTGCCTGAAACCGAACT-3′。

引物由上海Invitrogen公司合成。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s；57℃退火30s；72℃延伸45s；共进行30循环；72℃延伸10min。使用Bio-RadMycyclerPCR扩增仪。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，Bmi-1扩增产物为687bp，NEO扩增产物为399bp。

仅有Bmi-1扩增产物为687bp条带为野生型，仅有NEO扩增产物399bp条带为纯合子，2条扩增产物均有者为杂合子(图1)。

取材取7周龄WT、BKO以及BKO+PQQ小鼠，麻醉后拍照，立即行颈椎脱臼处死，取同侧下颌骨、胫骨，使用能更好保存酶活性和组织抗原性的PLP(2％副醛，75mM赖氨酸，10mM过碘酸钠)固定液固定，经常规脱水、石蜡包埋、切片，用于HE染色、组织化学染色和免疫组化及TUNEL染色。取另一侧下颌骨、胫骨提取蛋白质用于Westernblot分析。

X-线摄影固定后的下颌骨、胫骨使用FaxitronModel805radiographic检测系统(FaxitronContact，Germany；22kVand4-minuteexposuretime)进行X线摄影，观察骨骼形态和骨密度的改变。

Micro-CT扫描和三维重建取固定后的下颌骨、胫骨，使用我们先前报道的方法^[MiaoD，HeB，LanskeB，etal.SkeletalabnormalitiesinPTH-nullmiceareinfluencedbydietarycalcium.Endocrinology.2004；145(4):2046–2053.^]进行Micro-CT扫描(SkyScan1072Scanner，电压100kV，电流98mA)和三维重建，选择经中切牙横断面、第一磨牙、第二磨牙和第三磨牙近中根纵切面进行比较分析观察；选择胫骨近端冠状面观察已钙化次级骨化中心、生长板、皮质骨和小梁骨的改变。

HE染色石蜡切片常规脱蜡水化，苏木精(美国Sigma公司)染色，1％盐酸酒精分化，流水冲洗返蓝，伊红(美国Sigma公司)复染，常规脱水透明，中性树胶封片.

组织化学染色取下颌骨、胫骨组织的石蜡切片，按照我们先前报道的方法^[MiaoD，BaiX，PandaD，McKeeM，KaraplisA，GoltzmanD.OsteomalaciainHYPmiceisassociatedwithabnormalPhexexpressionandwithalteredbonematrixproteinexpressionanddeposition.Endocrinology.2001；142(2):926–939.^]，作总胶原(totalcollagen，TCOL)、碱性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)等组织化学染色。

免疫组织化学染色取下颌骨、胫骨组织进行固定、脱水、石蜡包埋切片，按照我们先前报道的方法^[MiaoD，LiJ，XueY，SuH，KaraplisAC，GoltzmanD.Parathyroidhormone–relatedpeptideisrequiredforincreasedtrabecularbonevolumeinparathyroidhormone–nullmice.Endocrinology.2004；145(8):3554–3562.^]，作免疫组织化学染色，检测指标包括反映成牙本质细胞相关的指标：双糖链蛋白多糖(Biglycan)，牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein，DSP)；成骨细胞分化指标:I型胶原(ColI)、骨钙素(OCN)；反映下颌骨、胫骨增殖的指标：增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)。

TUNEL染色取下颌骨、胫骨组织石蜡切片，按照我们先前报道的方法^[MiaoD，HeB，KaraplisAC，GoltzmanD.Parathyroidhormoneisessentialfornormalfetalboneformation.JClinInvest.2002；109(9):1173–1182.^]，进行反映凋亡的指标TUNEL染色。

结果

PQQ补充对BKO小鼠下颌骨、牙、胫骨骨矿化的影响

为了检测PQQ对BKO小鼠下颌骨、牙及胫骨骨矿化的影响，我们使用X射线检测了7周龄WT、BKO和BKO+PQQ小鼠下颌骨、牙及胫骨的矿化情况。X线结果显示：与BKO小鼠相比，BKO+PQQ小鼠下颌骨、牙齿及胫骨的形态增大，X线透光度减少，骨密度增加(图2中A)。同时我们还利用微CT扫描观察了PQQ对BKO小鼠下颌骨、牙及胫骨的影响。与BKO小鼠相比，BKO+PQQ小鼠在下颌中切牙横断面、第一磨牙、第二磨牙和第三磨牙近中根纵切面牙量均增加，密度增高，下颌骨牙槽骨骨量和胫骨的骨量都明显增加(图2中B)。说明PQQ补充能够纠正Bmi-1缺失引起的颌骨和胫骨骨质疏松、以及牙齿发育障碍。

PQQ补充对BKO小鼠下颌骨、牙、胫骨骨量的影响

为了检测PQQ补充对BKO小鼠下颌骨、牙及胫骨骨量的影响，我们对下颌骨、牙及胫骨分别进行了HE、总胶原染色和图像分析。结果显示：在下颌骨中，与BKO小鼠相比，BKO+PQQ小鼠下颌骨中的牙容量、根管壁的厚度、皮质骨厚度和牙槽骨的容量均明显增加(图3中A-E)。在胫骨中，HE(图3中F)和总胶原染色(图3中G)结果显示：与BKO小鼠相比，BKO+PQQ小鼠胫骨中的骨小梁体积明显增加(图3中H)。

PQQ补充对BKO小鼠前期牙本质发育和牙本质形成的影响

为了检测PQQ补充对BKO小鼠前期牙本质发育和牙本质形成的影响，我们通过牙本质的HE染色(图4中A)发现：与BKO小鼠相比，BKO+PQQ小鼠下颌第一磨牙牙本质中的成熟牙本质明显增加，而前期牙本质却明显减少(图4中D)。我们应用免疫组织化学的方法检测了牙本质中的双糖链蛋白多糖(图4中B)和牙本质涎磷蛋白(DSP)(图4中C)的免疫反应活性，结果显示：与BKO小鼠相比，BKO+PQQ小鼠下颌第一磨牙牙本质中双糖链蛋白多糖阳性面积明显减少(图4中E)；然而BKO+PQQ小鼠下颌第一磨牙牙本质中DSP却明显增多(图4中F)。这些结果表明，PQQ补充具有促进前期牙本质发育成熟和牙本质形成的作用。

PQQ补充对BKO小鼠下颌牙槽骨及胫骨成骨细胞骨形成的影响

为了检测PQQ补充对BKO小鼠下颌牙槽骨及胫骨成骨细胞骨形成的影响，我们通过下颌牙槽骨和胫骨切片的HE染色(图5中A)，利用图像分析的方法，观察了下颌牙槽骨及胫骨成骨细胞数的变化。结果显示：与BKO小鼠相比，BKO+PQQ小鼠下颌牙槽骨和胫骨的成骨细胞数目(图5中E)、成骨细胞面积(图5中F)均明显增加。同样我们进行了下颌牙槽骨和胫骨ALP组织化学染色(图5中B)，观察了下颌骨牙槽骨和胫骨ALP阳性面积的改变，结果显示：与BKO小鼠相比，BKO+PQQ小鼠下颌骨牙槽骨和胫骨ALP阳性面积(图5中G)均明显增加。我们还对下颌骨和胫骨分别进行了ColⅠ和OCN免疫组织化学染色(图5中C-D)，观察了下颌骨和胫骨成骨的改变。结果显示：与BKO小鼠相比，BKO+PQQ小鼠下颌骨及胫骨ColⅠ阳性面积(图5中H)明显增加。同样BKO+PQQ小鼠下颌骨及胫骨OCN阳性面积(图5中I)也较BKO小鼠明显增加。这些结果表明，PQQ饮食补充具有促进成骨细胞骨形成的作用。

PQQ补充对BKO小鼠下颌骨及胫骨破骨细胞骨吸收的影响

为了明确PQQ补充对BKO小鼠下颌牙槽骨及胫骨骨量减少的纠正作用是否与破骨细胞骨吸收能力减弱有关，我们对下颌骨和胫骨分别进行了TRAP组织化学染色(图6中A-B)，采用图像分析的方法，观察了下颌骨和胫骨破骨细胞数的改变。结果显示：与BKO小鼠相比，BKO+PQQ小鼠下颌牙槽骨和胫骨破骨细胞数目(图6中C)均明显减少。同样BKO+PQQ小鼠下颌牙槽骨和胫骨破骨细胞面积(图6中D)也较BKO小鼠明显减少。这些结果表明，饮食补充PQQ具有抑制破骨细胞骨吸收的作用。

PQQ补充对BKO小鼠下颌骨、胫骨增殖及凋亡的影响

为了明确PQQ补充对BKO小鼠下颌骨、胫骨增殖和凋亡的影响，我们对下颌骨及胫骨分别进行了PCNA免疫组织化学染色(图7中A)和TUNEL染色(图7中B)，采用图像分析的方法，观察了下颌骨和胫骨细胞增殖及凋亡的改变。结果显示：与BKO小鼠相比，BKO+PQQ小鼠下颌骨及胫骨PCNA阳性细胞百分比(图7中C)均明显增加，而BKO+PQQ小鼠下颌骨和胫骨TUNEL阳性细胞百分比(图7中D)明显下降。这些结果表明，饮食补充PQQ具有促进下颌骨及胫骨细胞增殖，抑制细胞凋亡的作用。

应用实例1PQQ在预防雌激素缺乏引起的骨质疏松中的作用

绝经后骨质疏松症(postmenopausalosteoporosis，POP)是一种与衰老有关的常见病，主要发生在绝经后妇女，由于雌激素缺乏导致骨量减少及骨组织结构变化，使骨脆性增多易于骨折以及由骨折引起的疼痛、骨骼变形、出现合并症，乃至死亡等问题，严重地影响老年人的身体健康及生活质量，甚至缩短寿命增加国家及家庭财力与人力负担。

为了研究PQQ在预防雌激素缺乏引起的骨质疏松中的作用，12只7周龄雌性小鼠施行双侧卵巢切除术(OVX)后，随机分为两组。一组喂以正常饮食，另一组喂以含PQQ饮食(4mgPQQ/kg普通饲料)至15周龄。另6只7周龄假手术雌性小鼠喂以正常饮食作为对照。

经吸入麻醉后取长骨经PLP液固定，通过X线摄影和微-CT扫描后三维重建、组织化学和免疫组化等方法比较分析了PQQ补充组(OVX+PQQ)与OVX对照组(OVX)及假手术对照组(Sham)间的骨代谢相关指标的变化。

结果发现，骨密度(图8中A和D)和骨容量(图8中B、C和E)、成骨细胞数、ALP和Ⅰ型胶原阳性面积在OVX+PQQ组明显高于OVX组，尽管这些指标没有达到Sham对照组水平(图9中A-C和E-G)。TRAP阳性破骨细胞面在OVX+PQQ组明显低于OVX组(图9中D和H)。双氧水(H₂O₂)水平和丙二醛(MDA)浓度在OVX组明显升高，在OVX+PQQ组明显降低(图10中A和B)，而总抗氧化能力(T-AOC)、SOD活性和谷胱甘肽水平在OVX组明显降低，在OVX+PQQ组较OVX组明显升高(图10中C和D)。

这些结果说明PQQ能够通过抑制氧化应激，刺激成骨细胞骨形成，抑制破骨细胞骨吸收，发挥预防雌激素缺乏引起的骨质疏松的作用。

应用实例2PQQ在预防雄激素缺乏引起的骨质疏松中的作用

雄激素是男性生长发育的重要激素，除参与生殖作用外，还影响机体的其它过程如骨代谢。经研究证明，骨细胞表面有雄激素受体，表明雄激素对骨细胞的作用是直接的。青春期前因性腺功能低下，故患者无法达到峰值骨量；以后随增龄引起的睾酮水平降低，可使骨量丢失，并引起骨质疏松。

为了研究PQQ在预防雄激素缺乏引起的骨质疏松中的作用，12只2月龄雌性小鼠施行双侧睾丸切除术(ORX)后，随机分为两组。一组喂以正常饮食，另一组喂以含PQQ饮食(4mgPQQ/kg普通饲料)至12月龄。另6只2月龄假手术雌性小鼠喂以正常饮食作为对照。

经吸入麻醉后取长骨经PLP液固定，通过X线摄影和微-CT扫描后三维重建、组织化学和免疫组化、骨髓间充质干细胞培养、亚甲基蓝或碱性磷酸酶(ALP)及图像分析统计亚甲基蓝阳性成纤维细胞集落形成单位(CFU-f)面积和ALP阳性CFU-f(CFU-fap)面积等方法比较分析了PQQ补充组(ORX+PQQ)与OVX对照组(ORX)及假手术对照组(Sham)间的骨代谢相关指标的变化。

结果发现，长骨骨密度和骨容量(图11中A-D)、椎骨骨容量和总胶原阳性面积(图12中A-D)、CFU-f和CFU-fap面积(图12中E-H)在ORX+PQQ组明显高于ORX组，尽管这些指标没有达到Sham对照组水平。TRAP阳性破骨细胞面在ORX+PQQ组明显低于ORX组(图13中A-B)。

这些结果说明PQQ能够通过刺激成骨细胞骨形成，抑制破骨细胞骨吸收，发挥预防雄激素缺乏引起的骨质疏松的作用。

以上实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>南京医科大学

<120>吡咯喹啉醌在制备防治骨质疏松症产品中的应用

<130>

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cagttaggcagtatgtagttttc23

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gttgtggtggagtgtaagagtgt23

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

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<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

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