一种鉴定赖氨酸ε-氨基侧链单甲基化修饰的方法

摘要

本发明提供一种鉴定赖氨酸单甲基化修饰底物的方法，方法包括以下步骤：1)采用体外酰化衍生化反应，将底物蛋白赖氨酸残基单甲基化ε-胺基衍生为酰甲基化ε-胺基；2)利用特异性制备的酰甲基化赖氨酸泛抗体亲和富集丙酰甲基化修饰的肽段；3)质谱鉴定抗体亲和富集的酰甲基化修饰的位点、多肽序列及底物蛋白。

说明书

技术领域

本发明属于检测诊断领域，特别地，属于一种鉴定及定量细胞或组织中赖氨酸单甲基化修饰底物的方法；更特别的，属于利用特异性抗体的亲和富集与质谱分析的蛋白组学方法鉴定及定量细胞或组织中赖氨酸单甲基化修饰底物。

背景技术

蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基侧链可以发生单、双或三甲基化修饰。在过去的几十年里，对赖氨酸甲基化修饰(Kme)的生物学研究主要集中在核心组蛋白。前期的研究证明了这种修饰在染色体结构和功能行使中的关键作用。这种修饰状态被2组具有相反催化功能的酶所调节，即赖氨酸甲基化转移酶和赖氨酸去甲基化酶。目前有超过50个赖氨酸甲基化转移酶和约25赖氨酸去甲基化酶被发现。组蛋白来氨酸甲基化修饰与各种疾病相关，例如癌症。相应的，赖氨酸甲基化调节酶成为一系列潜在的药物靶点。

当今在组蛋白中所发现的蛋白质翻译后修饰类型(PTMs)在非组蛋白中都存在。在鉴定到的赖氨酸甲基化调节酶中，存在一些非细胞核定位的酶和新发现的不以组蛋白为底物的赖氨酸甲基化调节酶，说明赖氨酸甲基化应该在非组蛋白中广泛分布。鉴定蛋白质底物是确定蛋白质翻译后修饰功能的前提，赖氨酸甲基化生物学的研究历史将该前提的重要性阐述的非常清楚。整合我们和他人的数据后发现，赖氨酸乙酰化底物出现在染色体结构、转录调节和如新陈代谢三个研究领域中，而且相互之间具有底物的重叠性。尽管赖氨酸乙酰化修饰的底物鉴定较迟，关于它的研究表明赖氨酸乙酰化在上述三个研究领域中是协同作用。类似地，赖氨酸甲基化修饰组的鉴定和定量比较发现了一些下游的与染色体无关的非组蛋白及信号通路，这为后续的功能研究打下坚实的基础。

虽然如此，鉴定赖氨酸甲基化底物并不简单。与鉴定磷酸化修饰用引入³²P标记不同，³H或¹⁴C的低放射性使放射性同位素检测方法在赖氨酸甲基化底物鉴定上难以实施。甲基化，尤其是单甲基化(Kme1)，只在其底物中引入了一个很小的结构基团，因而被修饰的赖氨酸基团与未发生修饰的赖氨酸基团差别细微，只有一个极小的构象用来开发亲和性抗体。若要同时兼顾亲和性和特异性，开发与序列无关的甲基化抗体(泛抗体)是一个巨大挑战。其结果是，由于没有合适的甲基化肽段富集方法为后续质谱分析提供肽段，赖氨酸甲基化底物的鉴定进程缓慢。正如磷酸化和赖氨酸乙酰化组学研究中描述，亲和富集是研究蛋白质翻译后修饰(PTM)整体分析的关键步骤(Kim,S.C.etal.Substrateandfunctionaldiversityoflysineacetylationrevealedbyaproteomicssurvey.MolCell23,607-618(2006))。由于单甲基化修饰的赖氨酸和未修饰的赖氨酸的物化性质差异很小，因此采用如分离磷酸化多肽的固定化金属亲和层析(IMAC)等化学方法来分离甲基化修饰的赖氨酸多肽很困难(Ficarro,S.B.etal.PhosphoproteomeanalysisbymassspectrometryanditsapplicationtoSaccharomycescerevisiae.Naturebiotechnology20,301-305(2002))。另外，制备高特异性和高亲和性的抗赖氨酸单甲基化的抗体也很困难。因此，需要对现有的基于蛋白质组学技术进行创新才能对赖氨酸甲基化修饰进行鉴定和分析。特别地，需要对赖氨酸单甲基化修饰的底物鉴定与定量分析方法进行全新的发明创造。

发明内容

为解决这个技术困难，本发明开发了一个新的化学蛋白质组学方法。利用该方法可以高效、准确的鉴定肽段中是否发生赖氨酸ε-胺基单甲基化修饰以及修饰的位点，定量分析修饰的变化水平。

一方面，本发明提供一种鉴定底物肽段或蛋白中是否在赖氨酸的ε-胺基上发生单甲基化修饰的方法，方法包括：采用体外氮酰化衍生化反应，让所述的底物上的单甲基化ε-胺基的赖氨酸残基衍生为酰甲基化ε-胺基；用抗酰甲基化的泛抗体亲和富集发生酰甲基化修饰的肽段；用液质联用质谱仪鉴定抗体亲和富集的多肽是否发生了丙酰甲基化修饰。

优选的，根据液质联用质谱仪检测获得的结果，并由此判断或推定底物蛋白或肽段上是否实际存在的赖氨酸单甲化修饰。

优选的，对底物蛋白赖氨酸残基单甲基化ε-胺基进行氮酰化修饰的修饰基团的碳原子总数小于8个。优选的碳原子总数小于6个。优选的，该修饰基团可以包括烷基或者芳香基，其中烷基或者芳香基的碳原子总数小于8个。优选的，烷基的碳原子总数小于6个，或，芳香基的碳原子总数小于8个。

优选的，让胺基的赖氨酸残基衍生为乙酰甲基化ε-胺基，丁酰甲基化ε-胺基,异丁酰甲基化ε-胺基，戊酰甲基化ε-胺基，2-甲基丁酰化甲基化ε-胺基，3-甲基丁酰化甲基化ε-胺基，2,2-二甲基丙酰化ε-胺基，琥珀酰化甲基化ε-胺基或丙二酰化甲基化ε-胺基等。酰化试剂包括各种羧酸，酸酐，酰氯，和其他的一切酰化试剂。

优选的，酰化试剂为具有稳定同位素的酰化试剂。同位素酰化试剂为含碳，氢，氧，氮稳定同位素的羧酸，酸酐，酰氯，羧酸酯，酰胺和其他的一切酰化试剂。优先地，稳定同位素试剂是¹²C₆H₁₀O₃丙酸酐，¹³C₆H₁₀O₃丙酸酐或¹²C₆D₁₀O₃丙酸酐。

在另一些优选的方式中，让底物蛋白或肽进行氮酰化反应在体外进行。在一些优选的方式中，底物蛋白或肽的酰化反应可以在蛋白酶消化底物之前或者之后进行。优选的，底物蛋白或多肽提取于任何细胞、组织或体液。所述的底物蛋白或多肽为总蛋白或总的多肽。

在一些优选的方式中，从细胞或组织中提取总蛋白与丙酰酐在pH值为8.5的碳酸铵-碳酸氢钠缓冲液中发生化学反应产生赖氨酸丙酰化体外衍生蛋白，反应完全后经胰蛋白酶消化产生赖氨酸丙酰化衍生酶解多肽。在一些优选的方式中，制备丙酰化反应完全的赖氨酸丙酰化体外衍生蛋白的方法包括：200μL丙酸酐被迅速加入到含20mg总蛋白的细胞裂解液中，震荡并将加入适量2MNaOH将pH调至8，然后在室温孵育30分钟；反应后的赖氨酸丙酰化体外衍生蛋白通过三氯乙酸(TCA)沉淀法沉淀。为进一步产生赖氨酸丙酰化衍生酶解多肽将沉淀蛋白在2ml的消化缓冲液(0.1MNH₄HCO₃,pH＝8.5)中重悬，然后用溶于消化缓冲液胰蛋白酶(trypsin)消化蛋白16小时；消化完全后，通过20,000xg的10分钟离心除去沉淀，获得赖氨酸丙酰化衍生酶解多肽上清。优选的方式中，胰酶与赖氨酸丙酰化体外衍生蛋白的比例为1:100(w/w)。

在体外赖氨酸衍生化反应中，未修饰赖氨酸或单甲基化修饰赖氨酸的ε-胺基均可以发生丙酰化反应，生成丙酰化赖氨酸或丙酰甲基化赖氨酸，而二甲基化和三甲基化赖氨酸却不能发生上述反应。理论上若丙酰化反应完全，则反应后蛋白的赖氨酸残基上将不存在未修饰的赖氨酸。因此，将反应后的蛋白经酶解产生酶解多肽后，通过质谱分析鉴定赖氨酸残基上未发生任何修饰的多肽，比较该类型多肽在所有鉴定出的赖氨酸残基修饰多肽的比例即可评估丙酰化反应的反应效率。。

在一些优选的实施方式中，所述的蛋白(总蛋白或总的多肽,或特定的蛋白或多肽)在进行丙酰化反应前，提取于经过细胞培养基培养的肿瘤细胞或临床样本中。优选的，细胞为可进行基于细胞培养的稳定同位素标记(SILAC)的永生传代的肿瘤细胞。更优选的，为鉴定细胞中赖氨酸单甲基化修饰底物，细胞可培养在添加有稳定同位素氨基酸的SILAC培养基中。优先地，同位素氨基酸包括¹²C-精氨酸或¹³C-精氨酸，更优先地，¹²C-赖氨酸或¹³C-赖氨酸，更优先地，稳定同位素氨基酸为¹²CH₃-甲硫氨酸或¹³CD₃-甲硫氨酸。在一些优选的方式中，为体外提供赖氨酸甲基化修饰的甲基来源，在细胞培养基中添加了¹²CH₃-甲硫氨酸(¹²CH₃-Met)；或者，在培养基中添加¹³CD₃-甲硫氨酸(¹³CD₃-Met)。在这里，甲硫氨酸上甲基团上的¹²C被稳定同位素的¹³C所取代，H₃(氢)被稳定同位素的D₃(氘)所取代。

在定量比较一对细胞中甲基化修饰的变化时，需要将一个细胞培养在含¹²CH₃-甲硫氨酸的培养基中，另一个细胞培养在稳定同位素标记的¹³CD₃-甲硫氨酸的培养基中，该方法称之为基于细胞培养的氨基酸稳定同位素标记策略(SILAC)(OngSEandMannM.Apracticalrecipeforstableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture(SILAC).NatProtoc.1(6):2650-60.(2006))。

在一些优选的实施方式中，所述的细胞来源于商业购买的细胞系，选自K562细胞(慢性骨髓白血病细胞系)，SW620细胞(结肠癌细胞系)，A549细胞(非小细胞肺癌细胞系)和SMM7721细胞(肝癌细胞)中的一种或多种。组织来源为临床诊断为肝癌患者手术切除的肝癌组织样本。

在一些优选的实施方式中，需要对发生氮酰甲基化修饰的肽段进行特异性抗氮酰甲基化泛抗体的亲和富集。优选的方式中，氮酰甲基化赖氨酸泛抗体事先通过化学交联、共价结合或非共价结合任何不破坏抗体亲和性的基质上。所述的基质为琼脂糖树脂，通过非共价结合在蛋白A或蛋白G或蛋白A/G的琼脂糖树脂上；更优先地，非共价结合在蛋白A琼脂糖树脂上制备成抗体偶联树脂。

优选的，所述的泛抗体通过化学交联、共价结合或非共价结合到不破坏抗体亲和性的基质上。优先地，通过非共价结合在蛋白A或蛋白G或蛋白A/G的琼脂糖树脂上。更优先地，非共价结合在蛋白A琼脂糖树脂上制备成抗体偶联树脂。

在一些优选的方式中，所述的抗体为特异结合丙酰甲基化的泛抗体。该富集方法包括如下步骤：将泛丙酰甲基化泛抗体与蛋白A交联的琼脂糖树脂进行偶联，制备蛋白A抗体偶联树脂。在一些实施方式中，亲和富集还包括在4℃条件下把丙酰甲基化泛抗体与赖氨酸丙酰化衍生多肽过夜孵育。或者使用抗体偶联树脂与赖氨酸丙酰化衍生多肽过夜孵育，然后使用1mlNETN缓冲液(100mMNaCl,1mMEDTA,20mMTrispH8.0and0.5％(w/v)NP-40)洗涤孵育后的抗体偶联树脂；然后将抗体树脂上亲和富集的丙酰甲基化修饰的肽段用100μl的0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)经过3次洗脱洗下来；洗脱液合并然后用浓缩仪抽干。

在一些优选的实施方式中，在用液质联用质谱仪鉴定被修饰的肽段前，对进行丙酰化衍生化反应后蛋白的酶解肽段进行HPLC分离，分离后的赖氨酸丙酰化衍生多肽组分分别进行丙酰甲基化泛抗体的亲和富集。优选的，对富集的多肽进行离子化处理，然后进行Nano-HPLC/MS/MS的质谱分析。经特定的质谱数据分析软件(Mascot或Maxquant)分析，鉴定出赖氨酸残基上特定的丙酰甲基化修饰对应的质量位移，并由此确定多肽赖氨酸残基上的单甲基化修饰位点、修饰的定量变化、修饰多肽序列及该多肽序列对应的蛋白。最后获得对赖氨酸单甲基化修底物的鉴定与特点位点修饰水平的定量变化的结果。

有益效果

通过本方法，能够准确、特异性地对底物蛋白中赖氨酸单甲基化修饰进行鉴定及进行赖氨酸单甲基化修饰的定量分析。这通过本发明的方法，我们在403个蛋白中验证到了460个单甲基化位点，具有很高的精确度，得到了迄今为止最大的赖氨酸单甲基化谱。这460个单甲基化位点中有小部分已被以前研究所报道，证实了本发明方法的有效性。而大多数为以前未知的赖氨酸单甲基化修饰的位点，从而大大丰富了对赖氨酸单甲基化修饰的认识。本发明赖氨酸甲基化组的分析表明该修饰在胞内途径、代谢网络和复合结构中的功能。我们的结果为后续的赖氨酸单甲基化通路的功能性研究提供了丰富的数据资源。

附图说明

图1为本发明一个具体实施例子中鉴定赖氨酸单甲基化多肽的实验设计流程图。图1A为鉴定含单甲基化多肽的实验流程原理图(赖氨酸丙酰化体外衍生化反应、抗体亲和富集与质谱分析)；图1B为常用酰化试剂类型；图1C为以赖氨酸丙酰化体外衍生化反应、抗体亲和富集与质谱分析为例的鉴定含单甲基化多肽的实验流程原理图；图1D为产生特异性丙酰单甲基化赖氨酸泛抗体的丙酰单甲基化赖氨酸的化学合成技术路线图；图1E为斑点印迹(dot-spot)检测丙酰单甲基化抗体的特异性实验，其中K_pr+me代表赖氨酸丙酰甲基化多肽库，K_prop代表赖氨酸丙酰化多肽库，K_bu代表赖氨酸丁酰化多肽库，K_me代表赖氨酸单甲基化多肽库，K_me2代表赖氨酸二甲基化多肽库，K_me3代表赖氨酸三甲基化多肽库和K_cr代表代表赖氨酸巴豆酰化多肽库。图1F为来自HSP90蛋白的一条赖氨酸丙酰甲基化多肽典型质谱分析注释图。pr:propionylation,丙酰化；me:methylation,甲基化；pr+me:propionylmethylation,丙酰甲基化；bu:butyrylation,丁酰化；me2:di-methylation,二甲基化；me3:tri-methylation,三甲基化；cr:crotonylation,巴豆酰化

图2赖氨酸体外丙酰衍生化反应效率检测。K562细胞全蛋白裂解液经赖氨酸体外丙酰衍生化反应后，胰酶消化产生酶解多肽，质谱分析检测酶解多肽中的丙酰化赖氨酸。赖氨酸丙酰化效率通过丙酰化赖氨酸多肽在所有鉴定到的多肽中比例的来估算。

图3赖氨酸丙酰甲基化修饰特征谱。图3A为经¹³CD₃-Met标记的典型丙酰甲基化修饰的多肽的MS谱图。图3B为HeLa细胞中EZH2蛋白的YSQADALK_pro-meYVGIER多肽的MS/MS质谱图。上边为被¹²CH₃-标记的YSQADALK_pr+meYVGIER肽段MS/MS质谱图，其中，下边是¹³CD₃-标记的多肽的质谱图，显示同一条丙酰甲基化多肽的b-,y-离子在稳定同位素标记后的4Da质量迁移。图3C为来自“轻”(¹²CH₃-)“重”(¹³CD₃-)甲硫氨酸标记的HeLa细胞裂解液混合物中鉴定到的甲基化多肽数目对比图。图3D显示碱性HPLC柱子分离获得的20个多肽组分经泛丙酰甲基化抗体富后质谱鉴定到的赖氨酸单甲基化多肽的数量及抗体的富集效率。pr:propionylation,丙酰化；me:methylation,甲基化；pr+me:propionylmethylation,丙酰甲基化。

图4高置信度的蛋白质赖氨酸单甲基化组。图4a为所有样本中鉴定到的全部463个单甲基化多肽的Mascot离子得分分布图；仅显示Mascot离子得分高于30的多肽。图4b为从5个肿瘤细胞系中鉴定到的赖氨酸单甲基化多肽数目的维恩对比图(HeLa(宫颈癌细胞),K562(慢性骨髓性白血病细胞),SW620(结肠癌细胞),A549(肺癌细胞)和SMM7721(肝癌细胞)。

图5K562细胞中CDC5L蛋白K114上丙酰甲基化位点的质谱验证图。图5a为合成的丙酰甲基化多肽LANTQGK_pr+meK_prAK_prR串联质谱分析，与来自K562细胞鉴定到的相同多肽表现出相同的离子强度图，图的上方为体内通过本发明鉴定的多肽LANTQGK_pr+meK_prAK_prR的质谱图，下方为合成的多肽的质谱图。图5b为体内多肽LANTQGK_meK与其体外合成多肽LANTQGK_meK的串联质谱分析。y-ion和b-ion部分4Da迁移，与赖氨酸甲基残基的位置迁移一致。pr:propionylation,丙酰化；me:methylation,甲基化；pr+me:propionylmethylation,丙酰甲基化。

图6赖氨酸丙酰甲基化多肽的质谱验证。质谱注释图来自于细胞内赖氨酸丙酰甲基化多肽与相应的合成多肽的对比。其中，图6A为HeLa细胞中KHDRSB1蛋白鉴定PVK_pr+meGAYR肽段的(其中K_pr+me表示丙酰单甲基化的赖氨酸)二级质谱(MS/MS)图。图6B为对应的体外合成多肽的质谱图(PVK_pr+meGAYR)。图6C为K562细胞EIF4H蛋白鉴定的K_pr+meGGPDDR肽段的(其中K_pr+me表示丙酰单甲基化的赖氨酸)二级质谱(MS/MS)；图6D为对应的体外合成多肽的二级质谱图(K_pr+meGGPDDR)。pr:propionylation,丙酰化；me:methylation,甲基化；pr+me:propionylmethylation,丙酰甲基化。

图7为本发明对不同细胞进行鉴定的修饰位点图，5个肿瘤细胞系(HeLa(宫颈癌细胞)，K562(慢性骨髓性白血病细胞)，SW620(结肠癌细胞)，A549(肺癌细胞))和SMM7721(肝癌细胞)中都鉴定到的29个赖氨酸单甲基化修饰蛋白列表。

详细说明

赖氨酸单甲基化修饰的底物标记

氨基酸的甲基化修饰是生命体自然发生的一种现象或过程。基于目前的研究表明，在细胞体内，S-腺苷-L甲硫氨酸(SAM)是甲基基团最重要的直接供体，而甲硫氨素(Methionine,Met)是合成SAM的直接前提。因此，当在培养基中添加甲硫氨酸时，经过细胞体内一系列反应途径后，甲硫氨酸上的甲基基团(CH₃-)就会转移到赖氨酸的ε-胺基上形成甲基化修饰。这构成了赖氨酸甲基化修饰底物标记的一般原理，即在细胞培养基中添加不同稳定同位素标记的甲硫氨素，如¹²CH₃-Met或¹³CD₃-Met，则将分别使底物蛋白带上¹²CH₃-的甲基基团或¹³CD₃-Met的甲基基团。标记途径简述如下：

A:¹²CH₃-甲硫氨酸→S-腺苷-L蛋氨酸-^-12CH₃(SAM)→赖氨酸-¹²CH₃(赖氨酸单甲基化)

B:¹³CD₃-甲硫氨酸→S-腺苷-L蛋氨酸-^-13CD₃(SAM)→赖氨酸-¹³CD₃(赖氨酸单甲基化)。

对于含有一个赖氨酸单甲基化修饰的同一序列多肽来说，采用¹²CH₃-Met或¹³CD₃-Met标记的唯一差别在于，由于稳定同位素的的分子量的差异，¹³CD₃-Met标记的该多肽将比¹²CH₃-Met标记的同一序列多肽重4.02Da(图3a)，从而在质谱分析上能够通过质量位移的改变将这两条多肽区别开来，而多肽本身的量的多少可以通过质谱分析的丰度反应出来。这构成了分析同一蛋白在不同条件下蛋白质修饰定量分析的理论基础，称之为基于细胞培养的氨基酸稳定同位素标记策略(SILAC)(OngSEandMannM.Apracticalrecipeforstableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture(SILAC).NatProtoc.1(6):2650-60.(2006))。对于细胞或组织中的赖氨酸单甲基化修饰底物的定性分析来说，无须引入稳定同位素的标记策略，直接通过抗体富集、质谱分析的方法即可实现。而对于定量分析一对遗传背景一致的细胞样品中赖氨酸单甲基化修饰水平时，则需要引入¹²CH₃-Met或¹³CD₃-Met标记的SILAC策略，随后通过抗体富集、质谱分析的方法加以实现。

对于如何采用质谱技术来定性或定量分析某种蛋白质修饰，包括赖氨酸甲基化修饰，本领域一般技术人员所知晓的技术方法。

赖氨酸单甲基化修饰的丙酰化衍生化反应

通常情况下，某种蛋白质修饰底物的鉴定首先需要用该修饰的特异性泛抗体对具有该修饰多肽进行亲和富集，如乙酰化底物的鉴定。然而对于赖氨酸单甲基化修饰来说，由于甲基基团过小(CH₃-)以及很弱的免疫原性，很难直接获得赖氨酸单甲基化修饰的泛抗体。为了克服该困难，发明人设想可以特异性在发生赖氨酸单甲基化修饰的赖氨酸ε-胺基上通过体外衍生化反应引入额外的基团，从而增加赖氨酸ε-胺基修饰基团的空间结构，为抗体的制备提供更大的决定簇和更强的免疫原性。

赖氨酸丙酰化反应是一种化学反应及合成领域一般技术人员知晓的体外衍生化反应，通过丙酸酐与底物蛋白在体外特定反应条件下反应，可在底物蛋白的赖氨酸ε-胺基上人工引入丙酰基团，形成衍生化的丙酰化赖氨酸。对于赖氨酸单甲基化修饰来说，由于赖氨酸ε-胺基上仍有额外的一个丙酰酐反应位点，因此也可以发生丙酰化反应，产生衍生化的丙酰甲基化赖氨酸(图1a)。而二甲基化修饰或三甲基化修饰赖氨酸上的ε-胺基没有可供丙酰酐反应位点不能产生丙酰衍生化反应(Garcia,B.A.etal.Chemicalderivatizationofhistonesforfacilitatedanalysisbymassspectrometry.Natureprotocols2,933-938(2007))当体内赖氨酸单甲基化修饰经体外的衍生化反应形成赖氨酸丙酰甲基化修饰时，修饰基团在空间结构上大大增加，更容易被抗体所特异性识别。因此理论上可以制备一种特异性识丙酰甲基化赖氨酸的抗体，用于识别经过丙酰化衍生反应的赖氨酸单甲基化修饰多肽(图1c)。

Garcia和Hunter两人首先将赖氨酸丙酰化应用于组蛋白(即先通过提取组蛋白，然后对提取后的5种组蛋白进行赖氨酸丙酰化)修饰研究中(Garcia,B.A.etal.Chemicalderivatizationofhistonesforfacilitatedanalysisbymassspectrometry.Natureprotocols2,933-938(2007))当时没有测试这种化学方法在更复杂的系统中，如细胞或组织裂解液中的总蛋白是否可行。然而，本发明是对细胞或组织的总蛋白首先进行提取，然后再体外进行丙酰化反应。经蛋白酶裂解后，采用抗体富集与质谱分析的方法在全蛋白组层面上对赖氨酸单甲基化组进行分析(详细说明见后述)。

在一个优选的方式中，本发明使用的K562细胞裂解液全蛋白与丙酸酐在pH值为8.5的条件下化学反应。反应后，用胰酶在pH7.2碳酸铵-碳酸氢钠缓冲液中消化后，经质谱分析发生赖氨酸丙酰化反应的多肽。若体外丙酰化反应完全，含有未修饰赖氨酸多肽的比例将很低。鉴定结果表明，丙酰化反应后，所有检测到的2,556条多肽中只有37条多肽(占1.4％)中含有未修饰的赖氨酸，说明本发明中采用的体外丙酰化反应对于复杂的全蛋白体系有非常高的效率(图2)。

无论是采用¹²CH₃-Met或¹³CD₃-Met对细胞进行标记，标记的¹²CH₃-或¹³CD₃-赖氨酸单甲基化修饰均能发生丙酰化衍生化反应，生成丙酰¹²CH₃-赖氨酸或丙酰¹³CD₃-赖氨酸。对于通过引入丙酰化衍生化反应来定性或定量分析赖氨酸单甲基化修饰来说，采用¹³CD₃-Met标记的另一个必要原因是，由于丙酰¹²CH₃-赖氨酸所产生的质量位移与赖氨酸丁酰化一样(70.0440Da)，而丙酰¹³CD₃-赖氨酸却具有唯一的74.0640Da的质量位移，从而在质谱分析上能够区别体内的赖氨酸丁酰化修饰，达到准确鉴定赖氨酸单甲基化修饰的作用。

赖氨酸丙酰甲基化多肽的富集以及泛抗体的制备

就如磷酸化和赖氨酸乙酰化组学研究中描述，亲和富集是研究蛋白质修饰整体分析的关键步骤¹¹。由于单甲基化修饰赖氨酸和未修饰赖氨酸的物化性质差异很小，因此采用如分离磷酸化多肽的固定化金属亲和层析(IMAC)等化学方法来分离甲基化修饰的赖氨酸多肽很困难¹⁵。另外，制备高特异性和一定亲和性的赖氨酸单甲基化的抗体也很困难。为解决这个困难，本发明开发了一种新颖的富集单甲基化多肽的方法，该方法包括如下三个主要步骤：(1)将赖氨酸上单甲基化的ε氨基与丙酸酐反应，形成丙酰甲基化ε氨基化学衍生物；(2)利用特异性丙酰甲基化赖氨酸抗体富集含丙酰甲基化赖氨酸的多肽；(3)高效液相和质谱分析富集的多肽，鉴定抗体富集多肽的序列及确定修饰位点。

体外引入赖氨酸丙酰化衍生反应是基于抗体富集方法的前提，其原理与重要性已在前详述。同样重要的是，本发明方法需要用到特异性丙酰甲基化赖氨酸的泛抗体。由于丙酰甲基化基团比要大，因此制备丙酰甲基化赖氨酸的泛抗体比比制备单甲基化赖氨酸泛抗体要简单。为证实这个假设，用丙酰单甲基化赖氨酸(图1D)与KLH偶联后免疫兔子，随后从兔血清中纯化出抗丙酰甲基化赖氨酸泛抗体。利用固定位置含丙酰化赖氨酸(K_pr)、丁酰化赖氨酸(K_buty)、巴豆酰化赖氨酸(K_cr)、单甲基化赖氨酸(Kme1)、二甲基化赖氨酸(Kme2)和三甲基化赖氨酸(Kme3)的多肽库的斑点印迹(dotblot)方法测定抗体特异性(图1c)。结果表明，丙酰化甲基化赖氨酸泛抗体对丙酰甲基化赖氨酸多肽库的特异性比其他多肽库强100倍以上。尽管丙酰甲基化赖氨酸的结构与丙酰化赖氨酸和丁酰化赖氨酸的结构类似，但斑点印迹的检测结果表明本发明所用到的丙酰甲基化赖氨酸泛抗体的具有很高的亲和性和特异性，可以用于赖氨酸丙酰甲基化多肽的富集。

基于抗体对修饰性多肽的亲和富集是高通量蛋白质修饰组学的主要方法之一，如在赖氨酸乙酰化研究中有着广泛的应用。当从细胞或组织中提取的总蛋白经体外丙酰化反应后，可以经蛋白酶酶切产生赖氨酸丙酰化衍生多肽，包括赖氨酸丙酰甲基化衍生多肽。在一个优选的方式中，蛋白酶主要为胰蛋白酶(trypsin)。随后，将特异性丙酰甲基化赖氨酸泛抗体与蛋白A(ProteinA)琼脂糖树脂共价偶联制备抗体偶联树脂，将抗体偶联树脂在特定缓冲液中与赖氨酸丙酰化衍生多肽孵育，则更具抗原-抗体的特异性亲和结合特性，赖氨酸丙酰甲基化衍生多肽即可亲和结合在抗体树脂上。洗涤缓冲液洗去非特异性结合多肽后，用低pH值的洗脱缓冲液可将抗体上特异结合的赖氨酸丙酰甲基化衍生多肽洗脱下来。抽干后进行Nano-HPLC-MS/MS质谱分析可鉴定出赖氨酸丙酰甲基化衍生多肽序列及确定修饰位点。

丙酰单甲基化赖氨酸多肽检测

化学修饰基团可使修饰底物和多肽的质量偏移，如单甲基修饰的-CH₂基团可使底物发生14.0147Da的质量偏移，而磷酸化修饰可使底物发生79.9663Da的质量偏移。赖氨酸甲基化发生的质量偏移与一些氨基酸突变发生的质量偏移一样，如丝氨酸替突变成苏氨酸，天冬氨酸替突变成谷氨酸，缬氨酸替突变成亮氨酸或异亮氨酸，天冬酰胺替突变成谷氨酰胺。另外，丙酰甲基化与丁酰化使赖氨酸发生相同的质量偏移。赖氨酸丁酰化也是体内蛋白质一种修饰方式。因而，当对某种特异氨基酸上是否发生单甲基化修饰或者体外发生基团修饰进行检测的时候，若没有正确的质量控制，鉴定丙酰甲基化多肽就很可能发生假阳性的结果。因此，本法明利用现有的¹³CD₃同位素标记甲基化多肽的方法可避免出现假阳性的结果。

例如在鉴定赖氨酸上是否发生单甲基化修饰的时候，应用同位素标记方法培养细胞时，将常规培养基中的甲硫氨酸¹²CH₃替换成¹³CD₃。细胞中，已知赖氨酸甲基化前体-S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是从甲硫氨酸转化形成的。因此，细胞中赖氨酸甲基化，¹³CD₃甲硫氨酸转化成¹³CD₃S-腺苷甲硫氨酸(¹³CD₃-SAM)，致使赖氨酸发生18.027Da质量偏移。¹³CD₃-甲基化赖氨酸在体外发生丙酰化后发生74.0640Da质量偏移。而质谱检测可将这一独特的质量偏移与其他任何已知的蛋白质修饰类型或氨基酸突变发生的质量偏移区别出来。如在本发明的一个实施例中，从HSP90蛋白中鉴定出一条丙酰甲基化多肽(图1c)，通过74.0640Da的质量偏移，可准确定位此多肽的第三位赖氨酸上发生丙酰甲基化修饰，并由此实际推断该位点发生了赖氨酸单甲基化修饰。

为进一步验证该方法的可靠性，将¹³CD₃甲硫氨酸标记方法与SILAC方法结合。实验时，将HeLa细胞平行培养在¹²CH₃-甲硫氨酸和¹³CD₃甲硫氨酸培养基中，对甲基集团进行标记。标记完全后，将相同量的两种裂解蛋白混合，体外丙酰化衍生化反应，然后胰酶消化制备酶解多肽。为降低样品的复杂度及提高质谱分析的通量，用制备型高效液相色谱(HPLC)仪分离多肽，共制备20个多肽组分。对制备的每一个多肽组分，用泛丙酰甲基化赖氨酸泛抗体进行丙酰甲基化多肽的亲和富集，富集多肽洗脱后nano-HPLC/MS/MS分析。

质谱分析时，发生赖氨酸丙酰甲基化修饰的多肽因甲基基团中氢离子与¹²C碳离子均分别被置换氘(D)离子与¹³C碳离子，将会产生4.002道尔顿的质量偏移(图3A)。为确保分析的准确性，所有通过质谱数据分析软件Mascot搜索的MS/MS图谱进一步经过人工核对。应用这种方法，从HeLa细胞中鉴定出183个高可信度的丙酰甲基化修饰多肽(图3C)。20个酶解多肽组分中，富集效率在3％到41％之间(图3D)。通过人工核对原始数据，其中，180个丙酰甲基化修饰多肽具有一对前体离子，对应于162种蛋白中的190个甲基化修饰位点。只有两个多肽只含“重(heavy)”离子，一个多肽只含“轻(light)”“离子。说明¹³CD₃替换甲基基团的方法用于单甲基化位点图谱分析和剔除假阳性结果是可靠的。也证明这种方法用于鉴定单甲基修饰多肽是可靠的。

蛋白质赖氨酸单甲基化组学的范围

接着应用¹³CD₃甲硫氨酸标记方法检测了K562细胞(慢性骨髓白血病细胞)，SW620细胞(结肠癌细胞)，A549细胞(肺癌细胞)和SMM7721细胞(肝癌细胞)4种人源肿瘤细胞中的赖氨酸单甲基化修饰。多肽鉴定采用严格的1％的假阳性率和剔除MASCOT分值低于20的多肽，并人工确认每个图谱的准确性。经过上述严格的质量控制后，本发明总共在四个肿瘤细胞中鉴定出448个非冗余的赖氨酸单甲基化修饰多肽，对应403个蛋白中的460个位点。这些多肽中，73％的Mascot分值高于30(图4A)。通过检索公共Uniprot数据库，鉴定出来的大部分单甲基位点尚未报道。本发明鉴定出的单甲基赖氨酸多肽和蛋白的完整清单见图7。

核心组蛋白的赖氨酸单甲基化修饰已经广泛研究，因而可以用来作为好的阳性对照。与预计的一致，本发明共鉴定出12个组蛋白单甲基修饰位点。除了鉴定出已广泛研究的组蛋白H3的K4、K9、K27、K36、K79和组蛋白H4的K20几个甲基化位点外，还鉴定出少见研究的组蛋白H3的K18单甲基化修饰位点。由于已知在5种细胞中存在这些赖氨酸单甲基化修饰位点，本发明鉴定到了这些位点说明这种检测赖氨酸单甲基化修饰的方法是稳定可靠的。重要的是，利用本发明所述的方法，发明人还从很多已知的单甲基化修饰蛋白中鉴定出一些新的修饰位点。如WIZ蛋白，除鉴定出已报道的赖氨酸K976位点外，还鉴定出K1321和K1463两种新的赖氨酸单甲基化位点。

为了进一步验证本发明方法的有效性，发明人接着分析了人的肝癌组织中的赖氨酸单甲基修饰，来研究临床组织中赖氨酸单甲基化修饰的底物范围。与上面5种肿瘤细胞中鉴定到了赖氨酸单甲基化修饰数据比较，结果表明肝癌组织中的29个单甲基化修饰多肽中的32个单甲基化位点在这5种细胞中全部含有，包括20个新的赖氨酸甲基化位点和6个组蛋白H3的赖氨酸单甲基位点(图7)，进一步表明本发明方法的可靠性

新鉴定的赖氨斯案单甲基化修饰位点的验证

由于绝大多数非组蛋白的赖氨酸单甲基化修饰的位点特异性抗体不能够商业化获得，从而无法利用免疫印迹(westernblotting)的生化方法对质谱鉴定的位点进行验证。因此本发明采用了合成相应的赖氨酸单甲基化修饰性多肽来验证质谱鉴定出的赖氨酸单甲基化修饰性多肽的方法。质谱鉴定出的细胞内赖氨酸单甲基化多肽与相应的人工合成的修饰性多肽，在相同的质谱分析条件下，应该得到相同的二级质谱图(MS/MS)，这是相同多肽验证的标准。为此，从Mascot分值为20到60之间的多肽中，任意挑选了9个质谱鉴定出的丙酰单甲基化多肽序列并人工合成。以K562细胞中CDC5L蛋白K114位点上鉴定到了丙酰甲基化修饰为例，通过对人工合成的LANTQGK_pr+meK_prAK_pr多肽的质谱分析，表明合成多肽与抗体亲和富集后质谱鉴定到的多肽除了因同位素标记引起的4Da的差别外具有完全一致的二级质谱图(图5A)。采用除采用合成多肽的方法来验证以外，还在细胞内验证了CDC5L蛋白中的赖氨酸单甲基化修饰。通过免疫沉淀将内源性CDC5L蛋白从培养的K562细胞中纯化出来后进行质谱分析。如前所述，用¹³CD₃-标记甲基基团，接着质谱分析纯化的CDC5L蛋白。从细胞内纯化的CDC5L蛋白中鉴定出K164的单甲基化多肽LANTQGK¹³CD_3-meK。为进一步验证这个位点，通过分析对应的合成多肽的图谱，表明与胞内多肽的图谱除了因同位素标记引起的4Da的差别外，基本一致(图5B)。

同样的验证方法也证明了在HeLa细胞中KHDRSB1蛋白鉴定的PVK_pr+meGAYR肽段的二级质谱图(图6A)与人工合成的PVK_pr+meGAYR肽段的二级质谱图(图6A)一致；在K562细胞EIF4H蛋白鉴定的K_pr+meGGPDDR肽段的二级质谱图(图6C)与对应的体外合成多肽K_pr+meGGPDDR的二级质谱图(图6D)一致。由此证明了本发明所提供的方法能够高置信度的鉴定赖氨酸单甲基化修饰。

具体实施方式

本发明采用具体的实施方式来对细胞或组织中是否存在赖氨酸单甲基修饰的肽或蛋白进行鉴定或定量，这种列举只是示范性的举例说明本发明的方法是如何实现的，并不能对本发明起到任何的限制。本领域的一般技术人员都可以在不违背本发明的精髓的情况下对本发明做任何的改进和变化，但是这种变化都被包含在本发明的权利要求的范围中。

实施例子1：甲硫氨酸稳定同位素标记、体外丙酰化衍生反应与蛋白酶解

1.1甲硫氨酸稳定同位素标记

本发明所用到的细胞，包括HeLa细胞(宫颈癌细胞系)，K562细胞(慢性骨髓白血病细胞)，SW620细胞(结肠癌细胞)，A549细胞(肺癌细胞)和SMM7721细胞(肝癌细胞)，培养在RPMI或DMEM培养基中(LifeTechnologies,CA)进行甲硫氨酸稳定同位素标记。培养基中主要包含如下成分：¹²CH₃-蛋氨酸或¹³CD₃-蛋氨酸(Sigma-Aldrich,MO)，10％的透析胎牛血清(v/v)(dialyzedFBS)(LifeTechnologies,CA)和1×抗生素(ThermoScientific,MA)以及其他适合细胞生长的营养元素。培养基中细胞在37℃及5％CO₂中进行生长培养。

稳定同位素标记的关键在于标记效率要达到97％以上，并有质谱检测加以确认。根据细胞每分裂一代50％的¹²CH₃-被¹³CD₃-的计算(生理状态下为¹²CH₃-)，当细胞连续分裂6代以后，体内超过99％的¹²CH₃-被¹³CD₃-替换，从而满足理论所需的稳定同位素标记效率。在平行进行的“轻”(¹²CH₃-Met)或“重”(¹³CD₃-Met)稳定同位素的细胞标记过程中，当“重”(¹³CD₃-Met)稳定同位素的标记达到要求后，“轻”(¹²CH₃-Met)或“重”(¹³CD₃-Met)稳定同位素标记的细胞需要继续培养直至所需的细胞数量(10⁸)能够提取足够的蛋白用于后继的实验。当细胞培养至满足要求后，如进行细胞中赖氨酸单甲基修饰的定性鉴定，仅收集“重”(¹³CD₃-Met)标记的细胞后进行总蛋白提取。如进行细胞中赖氨酸单甲基修饰的定量分析，则“轻”(¹²CH₃-Met)或“重”(¹³CD₃-Met)标记的细胞收集后等量混合进行蛋白的提取。

1.2标记细胞中总蛋白的提取

培养标记的细胞在收集前用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，然后在预冷的裂解缓冲液中裂解细胞(8M尿素溶于2:1的0.1MNH₄HCO₃缓冲液(PH＝8)和0.1MNaHCO₃溶液；1x蛋白酶抑制剂(v/v))，最后在冰上孵育半小时。离心(20000xg)除去细胞碎片，保留上清，并测定上清液体中总蛋白的含量。

1.3总蛋白的体外丙酰化衍生反应及蛋白酶解

总蛋白的体外丙酰化衍生反应的具体的步骤如下：

1)取1.2节中的各个细胞系的蛋白质提取上清液，其中每个上清液含有20mg总蛋白来制备丙酰化反应；

2)立即向收集富含蛋白质的上清液体中加入200μL丙酸酐，涡旋混匀，加入适量体积的2MNaOH，将pH调整至8.0，室温反应1小时。

3)重复步骤2一次。重新加入200μL丙酸酐于步骤2中的溶液中，混匀，加入适量体积的2MNaOH，调整pH至8.0，室温反应2小时。

4)反应接束后，随后加入10μL乙醇胺(ethanolamine)，室温30分钟，终止步骤3的丙酰化反应。

5)向步骤4中的溶液中，逐滴加入三氯乙酸(TCA)至终浓度为20％(v/v)，摇床上轻摇，4℃沉淀过夜。

6)第二日16,000Xg，4℃离心10min，弃上清。

7)加入4℃预冷的丙酮重悬蛋白沉淀，再16000Xg，4℃离心10min，弃上清。

8)重复步骤7两次。

9)加入2mL100mM碳酸氢铵，pH＝8重悬步骤8中的蛋白沉淀。

10)按胰酶与蛋白沉淀的底物1:50(w/w)的比例，加入适量的胰酶于上述蛋白溶液中，37℃恒温水浴中酶解过夜。

11)第二天，离心，加入二硫苏糖醇(DTT)至终浓度为5mM，55℃恒温水浴中反应30分钟。

12)离心，加入新鲜配制的碘乙酰胺水溶液至终浓度为15mM，室温避光反应30min。

13)反应结束后，离心，加入0.72M半胱氨酸，至终浓度30mM，室温反应30min。

14)再按胰酶与底物1:100(w/w)的比例，加入适量胰酶，37℃恒温水浴酶解3小时后，¹⁸C柱脱盐，用HPLC分离多肽组分。

实施例子2：基于HPLC的多肽组份分离

在亲和纯化之前，通过实施例子1获得的来自每个样品的丙酰化衍生化的胰酶肽段首先通过HPLC被分离。分离的方法如下：本次分离使用的是VarianSD1LC(AgilentTechnologies,CA)和XbridgeC18(19X150cm；Waters,MA)，采用2至40％的bufferB(10mM氨水或80％ACN,pH8.5)，梯度设置为70分钟，以流速10ml/min洗脱。等时间收集样品，共收集到60个组份(约10ml/管)，然后合并为20个组份。所有20个组份的每个组分分别用真空浓缩仪(ThermoFisher)抽干。

实施例子3：赖氨酸丙酰甲基化泛抗体偶联树脂的制备与修饰性多肽的亲和富集

赖氨酸丙酰甲基化泛抗体偶联树脂的制备：1ml蛋白A琼脂糖树脂(LifeTechnologies,CA)经预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次后，和4mg赖氨酸丙酰甲基化泛抗体(在2ml预冷的磷酸盐缓冲液)在4℃条件下孵育4小时；500xg离心30s后，抗体-蛋白A琼脂糖树脂用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤三次去除未结合的抗体，制备成赖氨酸丙酰甲基化泛抗体偶联树脂。

修饰性多肽的亲和富集：由实施例2获得的酶解多肽(2mg)溶于200ul预冷的NETN缓冲液(100mMNaCl,1mMEDTA,20mMTrispH8.0and0.5％(w/v)NP-40)，然后加入20ul赖氨酸丙酰甲基化泛抗体偶联树脂，4℃条件下过夜孵育。500xg离心30s，亲和富集多肽-抗体-蛋白A琼脂糖树脂用NETN缓冲液洗涤三次后，再用ddH2O洗涤两次。结合在抗体-蛋白A琼脂糖树脂上的亲和富集多肽用100ul的0.1％三氟乙酸(TFA)洗脱，共三次。混合三次的洗脱液，用真空浓缩仪抽干后用于后继的质谱分析。

实施例子4：HPLC-MS/MS分析和数据库检索蛋白序列

洗脱肽段的离子化：将实施例子3中富集到的丙酰甲基化肽段(20个组分的肽段)分别溶于3μlHPLC缓冲液A(0.1％甲酸水溶液,v/v)然后依次进入毛细管RPLC捕集柱(100μm内径x2cm,LunaC18填充,5μm,孔径中国迪马)和最大压强为250帕的自动取样器，缓冲液为100％缓冲液A(HPLC级的0.1％FA水溶液)。进样和洗脱结束后，将肽段转移到填充C18树脂(3-μm颗粒大小,孔径,中国迪马)的分析柱(10cm长，75μmID)，并将分析柱连接EASY-nLC1000HPLC系统(ThermoFisherScientificInc,MA)。

质谱分析：洗脱下来的肽段被离子化后，然后通过纳米喷雾导入到LTQOrbitrapElite质谱仪中(ThermoFisherScientificInc,MA)。以R＝24,000和m/z400的分辨率，进行全范围质谱扫描(从m/z300至m/z2,000)。10种最高丰度的离子一次在线性离子阱中分离出来，经过碰撞然后分裂(CID)，该归一化能量为35％。与数据无关的排除间隔为30秒，重复计数为2，排除窗口设置在+2Da和-1Da。获取的HPLC-MS/MS数据采用Mascot(v2.3,MatrixScience,UK)分析。峰列表通过ThermoFisher的extract_msn.exe软件生成。Mascot分析中母离子质量误差设置为±10ppm，片段质量误差设置为±0.6Da。将所得数据在UniProtHuman(88,817条序列)数据库中搜索，并将搜索参数做如下设置：固定修饰设置为半胱氨酸残基脲甲基化，低质量肽段的可变修饰为¹³CD₃-蛋氨酸、¹³CD₃-蛋氨酸氧化、赖氨酸丙酰化(赖氨酸+56.0262)，赖氨酸丙酰¹³CD₃-甲基化(赖氨酸+74.0640)和赖氨酸丙酰-甲基-甲基化(赖氨酸+70.0418)。所有质谱数据采用高于20的mascot离子分数过滤和手工验证。

实施例子5：K562细胞中CDCL1蛋白的纯化

将¹³CD₃-蛋氨酸重标的K562细胞溶解于1xNETN缓冲液(100mMNaCl,1mMEDTA,20mMTrispH8.0和0.5％w/v,NP-40)。细胞匀浆在12,000×g，4℃条件下离心10分钟出去细胞碎片。

裂解液中加入抗CDC5L抗体(SantaCruz,Texas)4℃过夜，然后加入蛋白A/G琼脂糖树脂(SantaCruz,Texas)在4℃孵育4小时。洗涤非特异性结合蛋白后，免疫沉淀物在上样缓冲液中热裂解后在4–12％SDS-PAGE(LifeTechnologies,CA)上分离。把目的蛋白对应的胶条切下并在胶内酶解，然后将酶解肽段溶于到0.1％TFA缓冲液并导入到实施例子4的HPLC-MS/MS质谱中分析。

实施例子6：肝癌样品中总蛋白的制备

肝癌组织来自于在中山医院(中国，上海)进行手术的肝癌患者，并且已将研究内容告知与患者或捐献人。切下的新鲜组织在做进一步处理前由液氮迅速冷冻。提取蛋白前，肝脏组织迅速使用手术剪刀剪碎并用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗去血液。置于预冷的PBS中的组织使用搅拌器搅拌均匀，结缔组织用过滤器滤除(70μM孔径)。通过离心获得肝癌细胞，并按实施例1中的1.1节的方法进行细胞培养和标记，在细胞培养基上进行培养并用¹²CH₂-甲硫氨酸或¹³CD₂-甲硫氨酸标记。细胞标记后经过实施例子1的1.2和1.3节的方法进行总蛋白的提取和进行丙酰化反应，同时也按照相同的方法用酶进行分解，采用色谱法分析丙酰化反应的程度，结果表明，在这些细胞的蛋白质中，只有极少的肽没有进行丙酰化反应，实质所有的蛋白都进行了丙酰化反应。

实施例子7：用于鉴定丙赖氨酸丙酰甲基化的泛抗体的制备

本发明实施例中使用的试剂如下列表：

表1

本发明实施例中各种溶液配方如下：

表2

泛抗体的制备

1、单甲基丙酰化赖氨酸小分子的合成(Lys(me-prop)-OH)的合成。

合成路线(图1D，其中NHFMor为保护基团)：

1)2-1用二氯甲烷(DCM)溶解，常温下持续通入新制HCl气体1.5小时后，强酸下常温继续反应5小时，TLC确认反应结束；旋干后得粘稠固体，然后加硅胶拌样进行柱层析得到2-2；

2)2-2加入丙酮溶解，在加入NaHCO₃水溶液后室温搅拌2小时(充分搅拌，除去原料中结合的HCl)，冰水浴下缓慢加入溶有丙酸酐的丙酮溶液，反应1小时；反应结束后2N盐酸调pH3.0左右，加入DCM进行萃取，取有机相旋干得粘稠固体，加硅胶进行柱层析得到2-3；

3)2-3加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和四氢呋喃(THF)溶解后加入哌啶，常温搅拌过夜，TLC确认反应结束；油泵减蒸蒸干溶剂后得混合产物。加硅胶柱层析纯化得酯化产物；加氢氧化钠、等量水与甲醇体系进行水解，冰水浴下反应2小时，酯化产物完全水解后用2NHCl调至pH3.0。旋干溶剂，再加入乙醇溶解产物，过滤后滤液旋干，得最终产物Lys(me-prop)-OH。

2、活化的修饰性赖氨酸小分子全抗原制备

1)适量KLH溶于1mL活化缓冲液，加入3.2mg的EDC，使EDC终浓度2mM；

2)反应液1中加入1.1mgSulfo-NHS；

3)充分混匀反应液1和2，室温反应15分钟；

4)加入1.4μL巯基乙醇终止EDC反应；

5)适量Lys(me-prop)溶于活化缓冲液中，随后加入活化后的KLH蛋白溶液中，调整pH至7.4；

6)充分混合反应液，室温下反应2小时；

7)加入50mMTris终止反应。

3、动物免疫程序

1)8周龄新西兰大白兔，皮下多点注射；

2)第一次免疫：取500μL浓度为0.8mg/ml的KLH偶联的小分子免疫原与同体积完全福氏佐剂混合乳化，背部皮下多点免疫；

3)3周后，取500μL浓度为0.4mg/ml的免疫原与同体积不完全福氏佐剂混合乳化后，背部皮下多点注射；

4)每隔2周，按步骤3的剂量与方法加强免疫一次；

5)第4次免疫后10天取1ml血清，用ELISA方法检测血清滴度。若血清滴度大于3万，即通过心脏采血。若血清滴度不合格，则继续重复步骤4，直至血清滴度大于3万。

4、多克隆抗体纯化

ProteinA预纯化：

1)滴度大于3万的血清10000r/min离心10分钟，吸取上清用0.45μm微孔滤膜过滤；

2)3mlProteinA树脂室温平衡1小时，4倍柱体积的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗树脂；

3)过滤后的血清20ml上样到含有ProteinA树脂的柱子中，并与ProteinA柱子室温孵育90min后，静置15min；

4)分别用10倍柱体积的清洗缓冲液A洗1次，15倍柱体积PBS洗柱子1次；

5)5倍柱体积的洗脱Buffer洗脱，随后加入中和缓冲液，4℃PBS透析过夜；

6)超滤IgG至浓度为5-10mg/ml。

抗原多肽偶联柱子制备

1)室温平衡SulfoLinkCouplingResin1小时，混匀后吸取5ml于层析空柱中，4倍柱体积的偶联缓冲液清洗两次；

2)称取5mg抗原多肽，分别溶于偶联缓冲液中，加入SulfoLinkCouplingResin层析柱柱中混匀，室温孵育15分钟；

3)静置30分钟，15倍柱体积的偶联缓冲液洗柱子；

4)加入1倍柱体积封闭缓冲液，室温孵育15分钟后，6倍柱体积清洗缓冲液B清洗柱子；

5)分别获得含有多肽1偶联柱子和多肽2偶联柱子。

抗原多肽亲和纯化

将ProteinA纯化超滤后的IgG加入至抗原多肽偶联柱子中，室温孵育2小时；舍弃流出液后，分别用5倍柱体积的清洗缓冲液和10倍柱体积的PBS清洗柱子，然后按以下步骤活动纯化抗体：

1)4倍柱体积洗脱缓冲液洗脱；

2)洗脱液中加入中和缓冲液，透析袋中于4℃PBS透析过夜；

3)超滤IgG至浓度为5-10mg/ml；

4)将上述超滤后的IgG加入至多肽2偶联柱子中，室温孵育30分钟，收集流出液，即为纯化好的抗体。

5、斑点印迹(DotBlot)检测：

1)将各种多肽(K_pr+me代表赖氨酸丙酰甲基化多肽库，K_prop代表赖氨酸丙酰化多肽库，K_bu代表赖氨酸丁酰化多肽库，K_me代表赖氨酸单甲基化多肽库，K_me2代表赖氨酸二甲基化多肽库，K_me3代表赖氨酸三甲基化多肽库和K_cr代表代表赖氨酸巴豆酰化多肽库)溶于水中，配置成初始浓度为100ng/μL的多肽溶液；

2)裁剪合适大小的PVDF膜，无水甲醇处理大约40秒，去离子水中漂洗3次，自然干燥2分钟；

3)将初始浓度为100ng/μL的多肽溶液进一步分别稀释为20ng/μL与4ng/μL。然后依次点样，1μl/点，干燥10分钟后放入六孔板中；

4)5％脱脂奶粉室温封闭60分钟，TBST洗液漂洗两次，5分钟/次；

5)用5％脱脂奶粉稀释抗体，室温孵育1小时，用TBST洗液漂洗三次，10分钟/次；

6)用5％脱脂奶粉稀释羊抗兔HRP标记抗体，室温45分钟，TBST洗液漂洗三次，10分钟/次；

7)将化学发光显色液均匀铺于膜上，孵育5分钟后曝光，结果见图1E。

斑点印迹检测表明，通过本发明设计的单甲基化丙酰化赖氨酸小分子作为抗原获得的多克隆抗体可以特异性识别赖氨酸甲基丙酰化多肽库、赖氨酸甲基丙酰化GG多肽、单甲基化丙酰化赖氨酸小分子及KLH偶联的单甲基化丙酰化赖氨酸小分子，但并不识别其他类型赖氨酸修饰的多肽(图1E)，由此说明了抗体良好的特异性。所开发的单甲基化丙酰化赖氨酸多克隆抗体能够识别4纳克的赖氨酸甲基丙酰化多肽库，但不识别结构类似的直至100纳克其他修饰性赖氨酸多肽库，这既表明所开发抗体的灵敏度，也进一步表明了该多克隆抗体的特异性。

结果1

以HeLa细胞为例，按照上述事实例1-4的方法来鉴定HeLa细胞系中是否发生赖氨酸单甲基化修饰以及发生修饰的位点，需要将¹³CD₃甲硫氨酸标记方法与SILAC方法结合。实验室时，将HeLa细胞系分别平行培养于含¹²CH₃-甲硫氨酸和¹³CD₃甲硫氨酸培养基中。细胞标记完全并达到需要的量的时候，分别收集细胞提取总蛋白，然后将相同量的两种裂解蛋白混合后进行体外丙酰化衍生化反应，胰酶消化产生酶解多肽，用制备型HPLC分离多肽产生20个多肽组分。分离的每一个多肽组分用赖氨酸丙酰甲基化泛抗体富集，接着用nano-HPLC/MS/MS分析(具体分析方法见实施例子4)。

质谱分析时，发生丙酰甲基化修饰的多肽因甲基基团中氢离子与碳离子均被置换，将会产生4.002道尔顿的质量偏移(图3A)。为确保分析的准确性，所有通过Mascot搜索的MS/MS图谱进一步经过人工核对。应用这种方法，从HeLa细胞中鉴定出183个高可信度的丙基甲基化修饰多肽，从而间接的证明了在HeLa细胞中存在183个单甲基化修饰的赖氨酸的存在。通过人工核对原始数据，其中，180个丙基甲基化修饰多肽具有一对前体离子，对应于162种蛋白中的190个甲基化修饰位点(图3C)。只有两个多肽只含“重(heavy)”离子，一个多肽只含“轻(light)离子。

这充分说明¹³CD₃替换甲基基团的方法用于单甲基化位点图谱分析和剔除假阳性结果是可靠的。也证明这种方法用于鉴定单甲基修饰多肽是可靠的。

结果2

对于应用¹³CD₃甲硫氨酸标记方法检测了K562细胞(慢性骨髓白血病细胞)，SW620细胞(结肠癌细胞)，A549细胞(肺癌细胞)和SMM7721细胞(肝癌细胞))等另外4种人源肿瘤细胞中的赖氨酸单甲基化修饰，具体步骤如实施例子1-4所描述的步骤和条件。其中，多肽鉴定采用MASCOT算法和1％的假阳性率，剔除MASCOT分值低于20的记录，采用严格标准，人工确认每个图谱(如前所述)²²。总共鉴定出448个非冗余的单甲基多肽，对应403个蛋白中的460个位点。在这些鉴定出的多肽中，73％的MASCOT分值高于30(图4A)。通过检索公共Uniprot蛋白质数据库，本发明所鉴定出来的大部分单甲基位点尚未公开报道。

通过本发明鉴定出的单甲基赖氨酸多肽和蛋白的完整清单见附表。这表明，使用本发明的方法可以准确鉴定出那些已经通过其他方法鉴定出的单甲基赖氨酸多肽和蛋白，同时，也鉴定出了很多以前不能鉴定出的其他发生的单甲基赖氨酸多肽和蛋白。图7表明在五个肿瘤细胞系中均鉴定出的29个赖氨酸单甲基化修饰蛋白质及修饰位点。

从以上鉴定的结果可知，使用本发明的方法，可以鉴定出那些以前不知道的单甲基化修饰的赖氨酸修饰。例如在STUB1基因编码的蛋白底物上，本发明在第2位置的懒氨酸(K2)上检测到赖氨酸单甲基化修饰的存在，而该位点的赖氨酸单甲基化修饰尚未被报道。

核心组蛋白的赖氨酸单甲基化已经广泛研究，因而可以用来作为好的阳性对照。与预计的一致，本发明方法共鉴定出12个核心组蛋白的赖氨酸单甲基位点。除了鉴定出已广泛研究的组蛋白H3K4,H3K9,H3K27,H3K36,H3K79和组蛋白H4K20几个甲基化位点外，还鉴定出几乎没研究的组蛋白H3K18单甲基化位点。由于在这五种细胞中都含有大部分这些单甲基化修饰位点，说明这种检测赖氨酸单甲基化修饰的方法是稳定可靠的。此外，本发明方法还从很多已知的单甲基化修饰蛋白中鉴定出一些新的修饰位点。如WIZ蛋白中，除鉴定出已报道的K976位点外，本发明还鉴定出K1321和K1463两种新的单甲基化位点(图7)。

结果3

为了验证本发明方法的可靠性，以¹³CD₃-Met标记的K562细胞为例，通过本发明的方法，鉴定出在K562细胞的CDC5L蛋白的K114位点上存在单甲基化修饰。K562细胞的总蛋白在经过体外丙酰化反应并进过酶切后，获得的一条多肽的序列为LANTQGK^*_pr+meK_prAK_prR(K^*_pr+me表示丙酰化的单甲基化赖氨酸，K_pr表示在赖氨酸上也连接有丙酰基团)。从上面的描述可以知道，在该肽序列未进行体外丙酰化反应前，该多肽序列在生物细胞或组织中应该为：LANTQGK_me^*KAKR(K^*表示在该位点，即114位点上发生了单甲基化修饰)。为了验证该结论，发明人对人工合成的LANTQGK^*_pr+meK_prAK_prR进行了串联质谱分析。结果表明，该合成多肽与从细胞中鉴定到的LANTQGK^*_pr+meK_prAK_prR多肽具有完全一样的MS/MS二级谱图，但在相应的b-、y-离子上有4Da的质量位移(图5A)。为了进一步验证该位点在细胞体内真实地发生了赖氨酸单甲基化修饰，本发明还采用了细胞标记后体内CDC5L蛋白纯化后鉴定赖氨酸单甲基化修饰的与人工合成多肽的串联质谱分析。纯化的CDC5L蛋白中鉴定到了多肽。对人工合成的多肽的质谱分析表明，该多肽的MS/MS二级谱图与纯化CDC5L蛋白鉴定到的一致，仅因¹³CD₃-的标记在相应的b-、y-离子上有4Da的质量位移，由此证明了CDC5L蛋白中鉴定到的赖氨酸单甲基化修饰的可靠性。

对人的肝癌组织中的赖氨酸单甲基修饰的鉴定进一步验证了本发明方法的可靠性。与上述五种细胞中鉴定到的赖氨酸单甲基化修饰地物的数据比较，肝癌组织中的鉴定到的29个单甲基化修饰多肽中的32个单甲基化位点在这5种细胞中全部含有，包括20个新的甲基化位点和6个组蛋白H3的赖氨酸单甲基化修饰位点(图4B，图7)。

讨论

尽管基于亲和富集的蛋白组学策略最近已经被用于鉴定细胞裂解物的许多甲基化肽段，仍然存在挑战，特别是单甲基化修饰引起的微小理化性质使其难以用常规的赖氨酸单甲基化抗体富集的方法来鉴定。利用本发明的方法，发明人鉴定到403个底物蛋白中460个赖氨酸单甲基化位点，这代表了目前赖氨酸单甲基化的最大组学数据。该结果清晰地证实了本发明的方法的有效性和可靠性。

尽管对于赖氨酸单甲基化非常有效，我们的方法并不适用于赖氨酸二甲基化和三甲基化的组学水平检测，因为这两种修饰的氨基酸残基不能与丙酰酐反应。我们也用¹³CD₃-甲硫氨酸标记策略来改进检测单甲基化肽段的精确度。然而这种方法不能直接应用于临床组织样本，多肽识别的可靠性也可以替代方法来解决，比如严格的手工验证和合成多肽的MS/MS分析。近年来，蛋白质赖氨酸单甲基化的生物相关性引起了研究机构的广泛关注。蛋白赖氨酸甲基化酶类已经被作为不同疾病的药物可能靶点。此外，一些赖氨酸甲基化调控酶的抑制剂目前已在临床评估。然而，赖氨酸单甲基化的现有知识只局限于数量有限的蛋白，例如组蛋白和p53，从而限制了赖氨酸单甲基化修饰在基础医学研究乃至药物开发领域的应用。我们的研究不仅提供了一种有效的赖氨酸单甲基化底物高通量鉴定的方法，而且扩展了赖氨酸单甲基化蛋白的已知目录。将本发明所描述的蛋白质组学方法与甲基化酶类表达的基因操作相结合，可运用于鉴定甲基转移酶和去甲基酶的底物、疾病条件下甲基化底物的动态分析。此外，本发明所提供的赖氨酸单甲基化修饰组将是进一步生物学研究的有意义起点，实现赖氨酸单甲基化蛋白的功能特征化描述与疾病特异性赖氨酸单甲基化途径的解析。