鬼臼毒素靛红类衍生物在抗白血病药物中的应用及制备方法

摘要

发明公开了一种式（I）所示的鬼臼毒素靛红类衍生物。本发明还公开了这类衍生物的制备方法及其用于制备抗白血病药物。

说明书

技术领域

本发明涉及鬼臼毒素靛红类衍生物及其合成方法，以及用于制备抗白血病药物。

背景技术

鬼臼毒素是一类具有木质素结构的天然产物，主要从小蘖科鬼臼属植物的根、茎中分离得到，具有抗肿瘤等活性。鬼臼毒素虽然具有较强的抗肿瘤活性，但是由于其毒副作用较强，因此在临床上鬼臼毒素主要作为外用治疗尖锐湿疣等疾病。自从上个世纪50年代开始，人们就开始了对鬼臼毒素的结构修饰，得到了大量的结构类似物，并发现了一些具有较低毒副作用，同时保持了较强抗肿瘤活性的衍生物，如目前临床上使用的抗肿瘤药物依托泊苷和替尼泊苷等，同时还有一些鬼臼毒素衍生物正处于临床和临床前研究阶段。例如,依托泊苷主要用于治疗急性白血病、小细胞肺癌等症。虽然，针对鬼臼毒素的结构修饰和改造取得了较大的进展，但是目前临床上使用的鬼臼毒素类药物仍然存在一定的缺陷，如多药耐药性、骨髓抑制等。

发明内容

本发明目的是提供鬼臼毒素靛红类衍生物及其制备方法，以及用于制备抗白血病药物，本发明鬼臼毒素靛红类衍生物对人白血病细胞K562和人白血病阿霉素耐药株K562/ADR均有较强的抗增殖作用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种式（I）所示的鬼臼毒素靛红类衍生物：

其中R为单取代，取代位置任意，R表示H、卤素或CH₃。

所述卤素为氟、氯或溴。

一种式（I）所示的鬼臼毒素靛红类衍生物的制备方法，所述的制备方法为：①化合物(b)氯乙酸酯鬼臼毒素的制备：冰浴条件下依次加入鬼臼毒素(a)、二氯甲烷和三乙胺，缓慢滴加氯乙酰氯，升至室温搅拌反应至反应结束；②鬼臼毒素靛红类衍生物（I）的制备：加入氯乙酸酯鬼臼毒素(b)、N,N-二甲基甲酰胺、碳酸钾、靛红或靛红衍生物，在80℃下搅拌反应至反应结束。

本发明的鬼臼毒素靛红类衍生物可用于制备抗白血病药物。

药理活性试验证明，本发明的通式（I）化合物能够有效的抑制K562和K562/ADR细胞的增殖。通过AnnexinV-APC/7-AAD双染法和PI单染法证实，本发明的通式（I）化合物抗肿瘤的分子机制包括：（1）诱导凋亡；（2）阻滞细胞周期。

以下是本发明部分化合物的药理活性测试方法及结果

一、体外抗增殖活性

CCK-8（CellCountingKit-8）染色法

将细胞消化、计数，配制细胞悬浮液3.0×10⁴个/毫升，96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，37℃，5%CO₂培养箱中培养24小时。每孔加入相应的含药培养基，同时设立阴性对照组，阳性对照组和溶媒组。96孔板置于37℃，5%CO₂培养箱中培养72小时，每孔加入100μLCCK-8溶液，继续培养2小时。λ=450，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率。以浓度-抑制率曲线得出回归方程，求出半数抑制浓度（IC₅₀）。

本实验按照CCK-8方法，以依托泊苷为阳性对照药，进行了通式（I）化合物对K562和K562/ADR细胞株的抑制活性测试，结果如表1：

表1本发明部分鬼臼毒素靛红类衍生物（I）的化学结构以及其体外抗增殖活性

以上实验结果显示，本发明如通式（I）所示化合物对K562和K562/ADR均具有较强的抗增殖活性，并且活性均强于阳性对照药依托泊苷。其中I-3的活性最强，对K562的IC₅₀值为0.019±0.007μM，对K562/ADR的IC₅₀值为0.067±0.010μM，分别是依托泊苷的21和30倍。

二、双染法检测细胞凋亡

将对数生长期的K562/ADR细胞消化接种到六孔板中，次日，待细胞贴壁后，根据组别设置加入相应的含药培养基，同时设立阴性对照组。药物作用48小时后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集细胞。用PBS洗涤细胞二次，收集5×10⁵细胞。加入500μL的BindingBuffer悬浮细胞。加入5μLAnnexinV-APC混匀后，加入5μL7-AAD，混匀。室温、避光、反应10分钟；用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况，测试结果如表2。

表2Annexin-VAPC/7-AAD双染法检测细胞凋亡

以上实验结果表明，化合物I-3能够显著诱导K562/ADR细胞发生凋亡。

三、单染法检测细胞周期

将对数生长期的K562/ADR细胞消化接种到六孔板中，次日，待细胞贴壁后，根据组别设置加入相应的含药培养基，同时设立阴性对照组。药物作用48小时后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集细胞。用PBS洗涤细胞一次，收集5×10⁵细胞。制备的单细胞悬液用体积分数为70％乙醇固定2小时，4℃保存，染色前用PBS洗去固定液。加100μLRNaseA37℃水浴30分钟，再加入400μLPI染色混匀，4℃避光30分钟。流式细胞仪记录激发波长488nm处红色荧光，测试结果如表3。

表3PI单染法检测细胞周期

上述实验结果表明，I-3化合物能够显著阻滞K562/ADR细胞停滞在G2期。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步的描述，但本发明的保护并不限于此。

实施例1

4-α-[2-氯-乙酸酯]-鬼臼毒素（b）的制备

在50ml圆底烧瓶中加入鬼臼毒素（a）（2.4mmol）、三乙胺（9.6mmol）和二氯甲烷（20ml），搅拌，冰浴下滴加氯乙酰氯（6mmol），滴毕，反应液升至室温搅拌反应。反应完毕，饱和氯化铵溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，有机层用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，柱层析得到淡黄色固体4-α-[2-氯-乙酸酯]-鬼臼毒素（b）0.95g，收率81%。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ6.77(s,1H),6.55(s,1H),6.37(s,2H),5.99(d,J=4.8Hz,2H),5.96(d,J=8.4Hz,1H),4.61(d,J=2.6Hz,1H),4.38-4.42(m,1H),4.13-4.24(m,3H),3.80(s,3H),3.75(s,6H),2.84-2.97(m,2H)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ173.41,167.94,152.65,148.41,147.70,137.11,134.53,132.55,127.21,109.78,107.97,106.92,101.71,75.64,71.13,60.75,56.13,45.52,43.64,40.69,40.48,38.46。

实施例2

4-α-[2-(1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-1）的制备

在10ml圆底烧瓶中加入氯乙酸酯鬼臼毒素（0.2mmol)、碳酸钾（0.2mmol）、靛红（0.19mmol）和N,N-二甲基甲酰胺（2ml），油浴加热至80℃搅拌反应。反应完毕，加入水（20ml）猝灭反应，二氯甲烷萃取三次，有机层用饱和氯化铵和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，柱层析得橘红色固体4-α-[2-(1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-1）0.087g，收率73%。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.63~7.69(m,2H),7.21(t,J=7.0Hz,1H),6.84(d,J=6.6Hz,1H),6.59(s,1H),6.52(s,1H),6.33(s,2H),5.99(d,J=9.6Hz,2H),5.94(d,J=8.1Hz,1H),4.70(d,J=17.2Hz,1H),4.59(s,1H),4.53(d,J=17.1Hz,1H),4.33~4.36(m,1H),4.16(t,J=8.8Hz,1H),3.81(s,3H),3.72(s,6H),2.84~2.99(m,2H)；HRMScalcdforC₃₂H₃₁N₂O₁₁[M+NH₄]⁺619.1922,found619.1926；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ181.80,173.23,167.48,158.06,152.67,149.88,148.46,147.73,146.34,138.61,134.47,132.50,126.88,125.99,124.62,117.70,109.84,109.63,107.91,106.57,101.76,75.85,71.03,63.99,60.78,56.16,45.43,41.49,38.46,35.14,29.70；IR(KBr,cm^-1)3470,1741,1615,1505,1485,1376,1340,1240,1126,1037,999,930,860.

实施例3

4-α-[2-(4-氯-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-2）的制备

用4-氯靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2，得橘红色固体4-α-[2-(4-氯-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-2），收率70%。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.55(t,J=8.0Hz,1H),7.15(d,J=8.2Hz,1H),6.75(d,J=7.9Hz,1H),6.55(s,1H),6.52(s,1H),6.32(s,2H),5.99(dd,J=6.1,1.1Hz,2H),5.93(d,J=8.6Hz,1H),4.72(d,J=17.8Hz,1H),4.59(d,J=3.9Hz,1H),4.52(d,J=17.8Hz,1H),4.32~4.36(m,1H),4.16(t,J=9.6Hz,1H),3.80(s,3H),3.72(s,6H),2.86~2.95(m,2H)；HRMScalcdforC₃₂H₂₇ClNO₁₁[M+H]⁺636.1267,found636.1271；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ178.85,173.23,167.23,157.19,152.66,150.94,148.49,147.72,138.69,137.10,134.60,134.45,132.53,126.78,126.21,114.88,109.86,107.88,106.49,101.81,70.99,60.77,56.13,45.40,43.57,41.54,38.43,29.70；IR(KBr,cm^-1)3455,2926,1743,1604,1485,1456,1420,1366,1240,1126,1036,999,930,871.

实施例4

4-α-[2-(4-溴-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-3）的制备

用4-溴靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2，得橘红色固体4-α-[2-(4-溴-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-3），收率63%。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.46(t,J=8.0Hz,1H),7.35(d,J=8.2Hz,1H),6.79(d,J=7.8Hz,1H),6.54(d,J=6.5Hz,2H),6.33(s,2H),5.99(d,J=5.7Hz,2H),5.93(d,J=8.4Hz,1H),4.71(d,J=17.7Hz,1H),4.59(d,J=3.8Hz,1H),4.51(d,J=17.7Hz,1H),4.32~4.36(m,1H),4.16(t,J=9.7Hz,1H),3.81(s,3H),3.73(s,6H),2.86~2.95(m,2H)；HRMScalcdforC₃₂H₂₇BrNO₁₁[M+H]⁺680.0762,found680.0753；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ179.27,173.09,167.16,157.10,152.72,151.39,148.51,147.75,137.34,134.37,132.59,129.36,126.81,122.43,116.63,109.87,108.32,108.07,106.44,101.77,76.01,70.92,60.73,56.18,45.44,43.61,41.46,38.44,29.67；IR(KBr,cm^-1)3463,2927,2839,1744,1506,1485,1454,1419,1367,1240,1126,1035,999,929,866,781.

实施例5

4-α-[2-(5-甲基-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-4）的制备

用5-甲基靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2，得橘红色固体4-α-[2-(5-甲基-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-4），收率46%。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.48(s,1H),7.45(d,J=8.1Hz,1H),6.73(d,J=8.0Hz,1H),6.55(s,1H),6.52(s,1H),6.33(s,2H),5.98(dd,J=9.1,1.1Hz,2H),5.92(d,J=8.6Hz,1H),4.68(d,J=17.7Hz,1H),4.58(d,J=4.0Hz,1H),4.49(d,J=17.7Hz,1H),4.32~4.35(m,1H),4.11~4.18(m,1H),3.81(s,3H),3.72(s,6H),2.83~2.93(m,2H),2.37(s,3H)；HRMScalcdforC₃₃H₃₃N₂O₁₁[M+NH₄]⁺633.2079,found633.2086；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ182.13,173.15,167.53,158.22,152.71,148.45,147.75,138.90,137.30,134.59,134.41,132.53,126.94,126.26,117.78,109.82,109.36,108.04,106.55,75.78,70.97,60.73,56.16,45.44,43.63,41.49,38.46,29.67,20.70；IR(KBr,cm^-1)3456,2935,2838,1736,1621,1598,1492,1460,1420,1337,1240,1199,1122,1033,871,798.

实施例6

4-α-[2-(5-氯-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-5）的制备

用5-氯靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2，得橘红色固体4-α-[2-(5-氯-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-5），收率67%。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.65(s,1H),7.62(d,J=8.4Hz,1H),6.82(d,J=8.1Hz,1H),6.58(s,1H),6.53(s,1H),6.34(s,2H),6.00(d,J=8.6Hz,2H),5.94(d,J=8.3Hz,1H),4.69(d,J=17.6Hz,1H),4.59(d,J=3.3Hz,1H),4.51(d,J=17.7Hz,1H),4.33~4.36(m,1H),4.15(t,J=9.4Hz,1H),3.82(s,3H),3.73(s,6H),2.85~2.94(m,2H)；HRMScalcdforC₃₂H₂₇ClNO₁₁[M+H]⁺636.1267,found636.1265；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ180.87,173.07,167.19,157.52,152.73,148.52,148.14,147.76,137.90,137.41,134.37,132.61,130.51,126.81,125.84,118.56,110.96,109.90,108.15,106.47,101.78,76.03,60.74,56.21,45.45,43.61,41.52,38.44,29.67；IR(KBr,cm^-1)3447,2936,2838,1741,1607,1507,1484,1446,1419,1377,1240,1202,1120,991,868.

实施例7

4-α-[2-(5-溴-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-6）的制备

用5-溴靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2，得橘红色固体4-α-[2-(5-溴-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-6），收率71%。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.76(s,1H),6.78(d,J=8.0Hz,1H),6.59(s,1H),6.52(s,1H),6.33(s,2H),5.98(d,J=8.1Hz,2H),5.93(d,J=8.0Hz,1H),4.69(d,J=17.8Hz,1H),4.57(s,1H),4.51(d,J=17.7Hz,1H),4.32~4.36(m,1H),4.14(t,J=9.2Hz,1H),3.80(s,3H),3.71(s,6H),2.84~2.89(m,2H)；HRMScalcdforC₃₂H₂₆BrNNaO₁₁[M+Na]⁺702.0581,found702.0589；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ180.80,173.15,167.22,157.37,152.68,148.64,148.48,147.72,140.75,137.32,134.44,132.58,128.60,126.86,118.84,117.40,111.48,109.86,108.12,106.52,101.77,75.98,70.93,60.72,56.17,45.40,41.47,38.42,29.66；IR(KBr,cm^-1)3454,2968,2937,2837,1740,1604,1506,1483,1420,1373,1334,1202,1120,1031,1002,954,869,767.

实施例8

4-α-[2-(6-溴-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-7）的制备

用6-溴靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2，得橘红色固体4-α-[2-(6-溴-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-7），收率48%。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.38(d,J=7.5Hz,1H),6.83(dd,J=8.5,3.3Hz,1H),6.57(s,1H),6.53(s,1H),6.34(s,2H),5.99(d,J=8.4Hz,2H),5.94(d,J=8.4Hz,1H),4.70(d,J=17.8Hz,1H),4.59(d,J=3.8Hz,1H),4.51(d,J=17.7Hz,1H),4.33~4.36(m,1H),4.13~4.18(m,1H),3.81(s,3H),3.72(s,6H),2.86~2.94(m,2H)；HRMScalcdforC₃₂H₂₆BrNNaO₁₁[M+Na]⁺702.0581,found702.0586；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ173.12,167.31,160.86,158.40,157.85,152.71,148.50,147.74,145.98,137.37,134.40,132.60,126.85,125.07,124.83,113.10,112.86,110.95,109.88,108.13,106.48,101.76,75.97,70.93,60.73,56.19,45.44,43.60,41.53,38.44,29.67；IR(KBr,cm^-1)3447,2934,1624,1588,1487,1465,1368,1331,1240,1126,1037,999,930,786.

实施例9

4-α-[2-(5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-8）的制备

用5-氟靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2，得橘红色固体4-α-[2-(5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-8），收率50%。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.52(d,J=8.0Hz,1H),7.36(d,J=7.9Hz,1H),7.03(s,1H),6.64(s,1H),6.53(s,1H),6.34(s,2H),5.99(d,J=6.9Hz,2H),5.96(s,1H),4.66(d,J=17.7Hz,1H),4.59(d,J=3.1Hz,1H),4.52(d,J=17.7Hz,1H),4.35~4.39(m,1H),4.14~4.19(m,1H),3.81(s,3H),3.73(s,6H),2.87~2.95(m,2H)；HRMScalcdforC₃₂H₂₇FNO₁₁[M+H]⁺620.1563,found620.1563；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ180.65,173.15,167.18,157.86,152.70,150.64,148.51,147.78,137.34,134.43,132.61,127.77,126.87,126.79,116.41,113.49,109.89,108.11,106.56,101.75,76.05,70.93,60.73,56.19,45.45,43.62,41.57,38.42,29.67；IR(KBr,cm^-1)3442,2936,1773,1736,1606,1507,1487,1420,1376,1241,1125,1032,999,885,768.

实施例10

4-α-[2-(6-氯-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-9）的制备

用6-氯靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2，得橘红色固体4-α-[2-(6-氯-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-9），收率39%。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.62(d,J=8.0Hz,1H),7.19(d,J=8.0Hz,1H),6.86(s,1H),6.63(s,1H),6.54(s,1H),6.35(s,2H),5.99(d,J=7.4Hz,2H),5.96(s,1H),4.66(d,J=17.7Hz,1H),4.60(d,J=3.2Hz,1H),4.52(d,J=17.7Hz,1H),4.35~4.39(m,1H),4.09~4.19(m,1H),3.82(s,3H),3.74(s,6H),2.83~2.95(m,2H)；HRMScalcdforC₃₂H₂₇ClNO₁₁[M+H]⁺636.1267,found636.1271；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ180.34,173.11,167.16,157.97,152.73,150.86,148.52,147.79,137.38,134.40,132.62,126.92,126.85,124.78,116.05,110.60,109.90,108.13,106.52,101.75,76.08,70.90,60.74,56.20,45.47,43.63,41.56,38.41,29.67；IR(KBr,cm^-1)3443,2935,2850,1777,1609,1506,1487,1457,1421,1379,1241,1125,1032,999,892,796.

实施例11

4-α-[2-(7-氟-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-10）的制备

用7-氟靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2，得橘红色固体4-α-[2-(7-氟-1H-吲哚-2,3-二酮-1-基)-乙酸酯]-鬼臼毒素（I-10），收率63%。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.52(d,J=7.4Hz,1H),7.39(dd,J=11.1,8.6Hz,1H),7.16~7.19(m,1H),6.73(s,1H),6.55(s,1H),6.37(s,2H),6.00(d,J=6.7Hz,3H),4.85~4.90(m,1H),4.60~4.70(m,2H),4.36~4.39(m,1H),4.16(t,J=9.5Hz,1H),3.82(s,3H),3.74(s,6H),2.88~2.96(m,2H)；HRMScalcdforC₃₂H₃₀FN₂O₁₁[M+NH₄]⁺637.1828,found637.1828；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ180.99,173.21,167.95,157.44,152.71,149.32,148.45,147.76,146.89,137.37,134.48,132.54,127.08,126.30,126.11,125.28,125.22,121.79,120.11,109.84,108.18,106.69,101.71,75.67,70.92,60.74,56.20,45.45,43.67,38.49,29.67；IR(KBr,cm^-1)3448,2933,2840,1749,1646,1634,1589,1558,1540,1506,1488,1419,1373,1338,1241,1190,1126,999,849,768。