一种用于检测线粒体tRNA

摘要

一种用于检测线粒体tRNA

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，具体涉及一种用于检测线粒体tRNA^Leu(UUR)3253T＞C突变的试剂盒及其检测方法。

背景技术

心血管疾病是全球造成死亡的首要原因，据世界卫生组织统计，2008年约有1730万人死于心血管病，到2030年，几乎有2330万人将死于心血管病，而高血压是心血管疾病的首位危险因素。高血压影响全世界超过三分之一的成年人，即大约10亿人，每年造成全世界900多万人死亡，其中半数死于心脏病和中风，高血压还可引起肾衰竭、盲症、血管破裂以及脑损伤。高血压按照发病原因可以分为原发性高血压和继发性高血压，原发性高血压约占所有高血压的90-95％。

线粒体是一种由两层膜包被的细胞器，是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所，为细胞的活动提供能量，所以有“细胞动力工厂”之称。除了为细胞供能外，线粒体还参与如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。

线粒体基因是人体内唯一的核外遗传物质。线粒体tRNA基因突变是与原发性高血压相关的突变热点区域，2009年GuanMX等人发现，位于线粒体tRNA^Leu(UUR)基因4435A＞G突变与原发性高血压相关(YuqiLiu，Min-XinGuanetal.Hypertention，2009；53：1083-1090)，2011年又进一步在细胞功能水平证明线粒体tRNA^Leu(UUR)基因4435A＞G可能影响原发性高血压的发生发展(ZhongqiuLu，Min-XinGuanetal.EurJHumGenet，2011；19：1181-1186)。

目前对于突变检测最常用方法为第一代测序测序技术，但此技术对仪器要求高，操作繁琐且成本昂贵，结果误差大、敏感性差并且存在放射性核素污染；PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)是目前应用较广泛、相对成熟的检测方法，但操作繁琐，操作过程中影响结果的不确定因素太多；近年来，变性高效液相色谱(DHPLC)和基因芯片的应用为点突变检测提供了思路，检测技术灵敏度和特异度均较高，自动化程度高，适合高通量检测，但涉及仪器昂贵，需专人操作，不适合广泛推广。因此，迫切需要一种快速、准确、操作简易的突变筛查方法应用与临床突变筛查。

发明内容

本发明通过酶切法进行线粒体tRNA^Leu(UUR)3253T＞C突变检测，克服了现有方法耗时长、操作难、成本高等缺点，提供线粒体tRNA^Leu(UUR)3253T＞C突变检测试剂盒，以及上述方法或上述的试剂盒在检测。

本发明采用的技术解决方案是：一种用于检测线粒体tRNA^Leu(UUR)3253T＞C突变的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

(1)提取全基因组DNA：运用蛋白酶K消化裂解蛋白质，酚-氯仿-异戊醇法，提取全基因组DNA；

(2)特异性PCR扩增及酶切：根据人类线粒体基因剑桥参考序列特异性设计一对引物3253F、3253R，该引物特异性的扩增含有3253位点的序列，然后利用专一性限制性内切酶BstEII特异性的识别GGTNACC回文结构，3253位点碱基突变后，产生限制性内切酶BstEII识别的回文结构，利用限制性内切酶BstEII识别的专一性，对样本的全基因组DNA进行PCR扩增和酶切；

(3)将酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据酶切后产生的DNA片段大小不同，检测线粒体tRNA^Leu(UUR)基因3253位点是否发生突变。

所述的全基因组DNA从细胞、血液以及组织样本中提取。

一种所述的用于检测线粒体tRNA^Leu(UUR)3253T＞C突变的方法的试剂盒，所述的试剂盒包括提取样本全基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、酶切反应试剂、阳性标准品、阴性标准品。

所述的取样本全基因组DNA的试剂包括包含裂解液、溶液I、酚-氯仿-异戊醇混合液和溶液II，所述溶液I的主要成分为蛋白酶K，溶液II的主要成分为氢氧化钠。

所述的PCR扩增反应试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、MgCl₂、引物、Taq酶和三蒸水。

所述的酶切反应试剂包括限制性内切酶BstEII和酶切缓冲液。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种一种用于检测线粒体tRNA^Leu(UUR)3253T＞C突变的试剂盒及其检测方法，本发明的所用标本血液、尿液、组织等采集后仍可用于后续实验研究，如血液样本可建立永生化类淋巴母细胞系、尿液细胞可用于成纤维细胞培养、组织可用于诱导多功能干细胞的建立，可保存珍贵的遗传资源，本试剂盒借助特异性PCR技术与专一性限制性内切酶BstEII特异性的识别GGTNACC回文结构的特点，每份DNA样本用1对特异性引物进行PCR扩增，然后用专一性限制性内切酶BstEII进行1次酶切即可在几小时内对线粒体tRNA^Leu(UUR)基因T3253C突变进行检测。另外值得一提的是，本试剂盒提供的阳性标准品和阴性标准品可以对应用本试剂盒的检测结果进行对比分析，从而更直观、更清晰的分析检测结果。

附图说明

图1：特异性条带扩增循环条件。

图2：突变样本、对照样本PCR产物及酶切产物图(泳道8为Maker；泳道4、5、6、7为突变样本酶切产物；泳道1、2、3分别为正常样本酶切产物)。

图3：突变样本、对照样本测序验证酶切方法图。

具体实施方式

1.DNA的提取：运用酚-氯仿-异戊醇法提取血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中的DNA。

2.特异性引物设计及特异性条带PCR扩增：使用Primer5.0软件根据人类线粒体基因序列(NC_012920.1)在3253前后设计上游引物3253F、下游引物3253R；采用上述引物对包含3253的特异性条带进行扩增。

3.专一性酶切及电泳鉴定：采用专一性限制性内切酶BstEII对上述特异性条带进行酶切，酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，即可鉴定是否发生3253T＞C突变。

具体步骤如下：

1.收集标本：在上述检测线粒体tRNA^Leu(UUR)基因T3253C突变的方法中，可从细胞、血液以及组织样本中快速提取全基因组DNA，针对采样方式、样本来源以及样本形式的不同，对不同样本和样本形式选择相应的方法进行预处理，处理方法如下：

(1)收集样品前准备好灭菌的收集容器，每人251ml瓶子2瓶(内有5ml双抗)，选择晨尿，主要收集中段尿，瓶口不要碰到任何皮肤部位，收集150-200ml尿液，将尿液转移至50ml的离心管中，400g离心10min，弃上清，加10mlPBS，清洗一次，400g离心10min，弃上清；

(2)指尖采血：用手指按摩采血部位，使中指或无名指指尖自然充血，再用医用酒精棉球消毒皮肤，待酒精挥发干燥后，右手持消毒刺针，自指尖腹侧迅速刺入2mm，立即出针，让血液自然流出，用消毒棉球擦去第一滴血后，按需要依次采血，采血完毕，用消毒干棉球压住伤口片刻。静脉采血：先用碘酊棉签自所选静脉穿刺处从内向外、顺时针方向消毒皮肤，待碘酊挥发后，再用医用酒精棉签以同样方法拭去碘迹，然后左手拇指固定静脉穿刺部位下端，右手拇指和中指持注射器针筒，使针头斜面和针筒刻度向上，沿静脉走向使针头与皮肤成30度角快速刺人皮肤，然后以5度角向前穿破静脉壁进人静脉腔，见回血后，将针头顺势探人少许。取50～100μl血液标本(如一滴血)或1cm²的血滤纸片放入1.5mlEppendorf管中，用PBS补至200μl，室温静置10分钟；

(3)收集组织前，要让受检者了解研究内容，并自愿同意参加试验的原则并签订《知情同意书》。先用医用酒精棉球从内向外对采集皮肤处进行消毒，然后涂上局部麻醉软膏，贴上麻醉贴，然后用采集皮肤组织的器具采集米粒大小的皮肤组织，将组织放入含有双抗的PBS溶液中。

然后用细胞裂解液和溶液I对上述样本进行消化裂解，再用酚-氯仿-异戊醇沉淀DNA，用乙醇清洗有机溶剂，最后用溶液II溶解DNA后于-20℃保存备用。

2.特异性引物设计

使用Primer5.0软件根据人类线粒体基因序列(NC_012920.1)在3253位点前后544bp和251bp处设计上游引物3253F、下游引物3253R，该引物特异性的扩增包含3253位点的序列，并且扩增的序列中不含有其它GGTNACC回文结构。具体参数如表1；此对引物中无连续出现的5个同一碱基，GC含量为55.6％，无引物二聚体和发夹结构。设计引物人工合成(委托生物公司)，用于后续实验。

表1针对3253位点设计引物参数表

3.特异性条带PCR扩增

将样本DNA、10×PCR缓冲液、dNTP(A、T、C、G四种脱氧核糖核苷三磷酸混合液)、Mg²⁺溶液、上述引物及Taq酶、三蒸水按一定比例混合，进行PCR扩增，扩增后长度为795bp，具体条件及反应体系如图1、表2所示。

4.专一性限制性内切酶BstEII酶切

专一性限制性内切酶BstEII特异性识别序列为GGTNACC，携带线粒体tRNA^Leu(UUR)3253T＞C突变样本恰好好存在GGTNACC回文结构，上述特异性扩增产物可以被酶切。将上述基因组提取试剂、PCR扩增反应试剂；酶切反应试剂，包括限制性内切酶BstEII和酶切缓冲液；阳性标准品、阴性标准品；使用说明书组合，组成用于体外检测线粒体tRNA^Leu(UUR)3253T＞C突变试剂盒，将样本DNA提取、PCR扩增、限制性内切酶酶切在试剂盒基础上一次性完成。讲上述特异性PCR产物1ug、10Unit限制性内切酶BstEII及2ul10×酶切缓冲液及三蒸水组成20ul体系，60℃加热1h，即可完成酶切。

5.琼脂糖凝胶电泳鉴定

讲上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，取0.75g琼脂糖，微波炉加热溶于50ml1×TAEBuffer中，冷却至60℃后加入0.5μg/mlEB(Ethidiumbromide，溴化乙锭)染料2.5ul；混合均匀后导入胶槽，冷却后即为1.5％琼脂糖凝胶，根据不同大小DNA分子在胶中迁移率不同，即可对突变样本和正常样本的酶切产物进行鉴定。

结果

根据图3可知，携带线粒体tRNA^Leu(UUR)3253T＞C突变样本可以被BstEII酶切，产物为544bp和251bp两条带，而不携带该突变样本不能被酶切，产物为795bp一条带。

可靠性的检验

将携带线粒体tRNA^Leu(UUR)3253T＞C突变样本和对照样本进行直接测序分析，结果与本发明方法完全吻合。结果如图3所示。

用本发明的方法及其制备的体外检测原发性高血压相关的线粒体基因T3253C突变试剂盒具有以下特点：

1.本发明的所用标本血液、尿液、组织等采集后仍可用于后续实验研究，如血液样本可建立永生化类淋巴母细胞系、尿液细胞可用于成纤维细胞培养、组织可用于诱导多功能干细胞的建立，可保存珍贵的遗传资源。

2.目前已有的点突变检测方法，例如PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)变性高效液相色谱(DHPLC)和基因芯片等检测技术灵敏度和特异度均较高，自动化程度高，适合高通量检测，但涉及仪器昂贵，需专人操作，不适合广泛推广。因此，迫切需要一种快速、准确、操作简易的突变筛查方法应用与临床突变筛查。

但由于其自身的缺陷，如费时费力、操作繁琐以及检测费用偏高而不易在临床进行推广。与这些方法相比较，本试剂盒借助特异性PCR技术与专一性限制性内切酶BstEII特异性的识别GGTNACC回文结构的特点，每份DNA样本用1对特异性引物进行PCR扩增，然后用专一性限制性内切酶BstEII进行1次酶切即可在几小时内对原发性高血压相关的线粒体tRNA^Leu(UUR)基因T3253C突变进行检测。另外值得一提的是，本试剂盒提供的阳性标准品和阴性标准品可以对应用本试剂盒的检测结果进行对比分析，从而更直观、更清晰的分析检测结果。

3.本发明提供的线粒体tRNA^Leu(UUR)3253T＞C突变检测试剂盒，提供了完整的监测体系及详细的说明书，与其他检测方法相比，本发明检测方法操作简便、易掌握；对仪器设备及操作人员无特殊要求，适合在一般医院、分子生物实验室开展，为全国性开展原发性高血压相关的线粒体tRNA^Leu(UUR)3253T＞C突变的大规模筛查和预防性检查提供条件，有效减少原发性高血压发生率，做到早筛查、早预防和早治疗。