一种与非甾体类消炎药预防结直肠癌相关的SNP标志物及其应用

摘要

本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，公开了一种与非甾体类消炎药预防结直肠癌相关的SNP标志物及其应用。该标志物为rs12217975，rs1927466，rs7586006，rs17868336，rs1500482，rs16973225，rs10505806，rs6717546，rs2965667，rs73172231，rs16825767，rs1902023，rs2745559，rs73172243，rs2920421的组合。可用于结直肠癌患者采用非甾体类消炎药进行预防和治疗的临床用药指导，减少药物滥用，避免过度医疗。

说明书

发明领域

本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及与非甾体类消炎药预防结直肠癌相关的SNP标志物及其应用。

背景技术

结直肠癌是全球常见的消化道肿瘤之一，为男性第三位和女性第二位的常见肿瘤，居癌症死亡第二位。据世界卫生组织国际癌症研究署估计，2008年全世界约有120万结直肠癌新发病例，其死亡率约占全部恶性肿瘤的8％。在我国，随着社会经济的发展以及居民生活方式和饮食习惯的不断改变，结直肠癌发病率和死亡率呈现出逐年上升的趋势，位居我国恶性肿瘤发病第三位和死亡第五位，严重威胁着人们的健康和生命。

随着外科手术治疗的进步及新兴化疗药物研发，结直肠癌病人的近期疗效得到了显著提高，但晚期结直肠癌患者5年生存率仍不乐观，总存活率始终在50％～60％，因此结直肠癌的早期预防就显得尤为重要。近年来多项研究发现，非甾体类消炎药的使用可以作为化学预防的手段来降低结直肠癌的发病风险，目前认为其主要通过抑制环加氧酶2来发挥作用，其下游途径包括以下几个方面：①可使花生四烯酸的量增加，促进鞘磷脂转化为神经酰胺，从而诱导凋亡；②下调肿瘤相关血管因子的表达，并且其产物PGE2的减少也可减少成纤维细胞的有丝分裂从而抑制肿瘤内血管形成；③改变凋亡信号传导途径中的相关蛋白如caspase及Bcl-2等的表达及活性，进而诱导肿瘤细胞的凋亡；④降低生长因子的表达使肿瘤细胞受到体内的生长抑制从而使肿瘤细胞的侵袭性减弱，最终抑制了肿瘤的发生。

虽然非甾体类消炎药的使用可以降低结直肠癌的发病风险，但越来越多的研究发现其预防结直肠癌的能力取决于不同的个体，也就是说个体间对于药物的反应存在着异质性，这种异质性目前被认为是由个体的遗传因素所决定。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNP的存在被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应性，因此SNP可能是导致常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。通过利用相关SNP谱的构建，除了可以对疾病进行辅助诊断，也可以用来筛选药物预防及治疗的直接受益人群，不仅灵敏、准确和快速，还可以使我们的临床治疗更加个体化、高效化。如果能够通过特定的SNP组合确定哪些患者适合服用非甾体类消炎药，哪些患者不适合服用非甾体类消炎药，就能够指导临床用药，对于这一类潜在结直肠癌风险的患者就不必采用非甾体类消炎药进行预防，可以减少药物滥用，避免过度医疗。然而，目前尚没有将非甾体类消炎药的相关SNP应用于结直肠癌的预防用药指导及辅助诊断的报道。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与非甾体类消炎药预防结直肠癌相关的SNP位点及其应用。

本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性扩增引物和特异性延伸引物。

本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物及其特异性扩增引物与特异性延伸引物在制备非甾体类消炎药预防结直肠癌的辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明第四个目的是提供用于结直肠癌预防用药指导的辅助诊断试剂盒。

发明人通过分离和研究服用/不服用非甾体类消炎药的结直肠癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DNA中的SNP，寻找与非甾体类消炎药预防结直肠癌高度相关的SNP位点，并研制出可临床或人群应用的非甾体类消炎药预防结直肠癌的相关试剂盒，为结直肠癌的药物预防提供指导。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种与非甾体类消炎药预防结直肠癌相关的SNP标志物，该标志物为rs12217975，rs1927466，rs7586006，rs17868336，rs1500482，rs16973225，rs10505806，rs6717546，rs2965667，rs73172231，rs16825767，rs1902023，rs2745559，rs73172243，rs2920421的组合。

所述SNP标志物的特异性扩增引物，该特异性扩增引物为：

rs12217975的引物序列为SEQIDNO：1、SEQIDNO：2；

rs1927466的引物序列为SEQIDNO：4、SEQIDNO：5；

rs7586006的引物序列为SEQIDNO：7、SEQIDNO：8；

rs17868336的引物序列为SEQIDNO：10、SEQIDNO：11；

rs1500482的引物序列为SEQIDNO：13、SEQIDNO：14；

rs16973225的引物序列为SEQIDNO：16、SEQIDNO：17；

rs10505806的引物序列为SEQIDNO：19、SEQIDNO：20；

rs6717546的引物序列为SEQIDNO：22、SEQIDNO：23；

rs2965667的引物序列为SEQIDNO：25、SEQIDNO：26；

rs73172231的引物序列为SEQIDNO：28、SEQIDNO：29；

rs16825767的引物序列为SEQIDNO：31、SEQIDNO：32；

rs1902023的引物序列为SEQIDNO：34、SEQIDNO：35；

rs2745559的引物序列为SEQIDNO：37、SEQIDNO：38；

rs73172243的引物序列为SEQIDNO：40、SEQIDNO：41；

rs2920421的引物序列为SEQIDNO：43、SEQIDNO：44。

所述SNP标志物的特异性延伸引物，该特异性延伸引物为：

rs12217975的引物序列为SEQIDNO：3；

rs1927466的引物序列为SEQIDNO：6；

rs7586006的引物序列为SEQIDNO：9；

rs17868336的引物序列为SEQIDNO：12；

rs1500482的引物序列为SEQIDNO：15；

rs16973225的引物序列为SEQIDNO：18；

rs10505806的引物序列为SEQIDNO：21；

rs6717546的引物序列为SEQIDNO：24；

rs2965667的引物序列为SEQIDNO：27；

rs73172231的引物序列为SEQIDNO：30；

rs16825767的引物序列为SEQIDNO：33；

rs1902023的引物序列为SEQIDNO：36；

rs2745559的引物序列为SEQIDNO：39；

rs73172243的引物序列为SEQIDNO：42；

rs2920421的引物序列为SEQIDNO：45。

所述的SNP标志物在制备与非甾体类消炎药预防结直肠癌相关的辅助诊断试剂盒中的应用。

所述的SNP标志物的特异性扩增引物和/或特异性延伸引物在制备与非甾体类消炎药预防结直肠癌相关的辅助诊断试剂盒中的应用。

一种与非甾体类消炎药预防结直肠癌相关的辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rs12217975，rs1927466，rs7586006，rs17868336，rs1500482，rs16973225，rs10505806，rs6717546，rs2965667，rs73172231，rs16825767，rs1902023，rs2745559，rs73172243，rs2920421的SNP标志物组合。

所述的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有上述SNP标志物的特异性扩增引物和/或特异性延伸引物。

所述的辅助诊断试剂盒，该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。

具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测：选择结直肠癌病例(将其分为服用非甾体类消炎药组和不服用非甾体类消炎药组)，与结直肠癌病例年龄、性别匹配的对照，在与非甾体类消炎相关通路范围内找出与预防结直肠癌相关的阳性SNP。(3)非甾体类消炎药预防结直肠癌的辅助诊断试剂盒的研制：将结直肠癌病例根据是否服用非甾体类消炎药进行分层后，对比健康对照中基因型分布频率，找出层间具有显著差异的SNP，开发SNP辅助诊断试剂盒。

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，采用SequenomMassARRAY基因分型进行单个位点的检测等。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.研究样本的选择

(1)经病理学明确诊断的结直肠癌病例；

(2)与病例年龄、性别匹配的对照；

本研究共采用1202例符合标准的样本进行研究。

2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μlDNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

3.单个SNP的SequenomMassARRAY基因分型

(1)取受试者DNA样本；

(2)设计单个SNP的特异性引物；

(3)行PCR反应；

(4)检测并比较服用或者不服用非甾体类消炎药的结直肠癌患者与正常对照中不同基因型的分布差异。

4.辅助诊断试剂盒制备方法

SequenomMassARRAY对候选基因通路上单个SNP检测后，在是否服用非甾体类消炎药这一因素下，确定结直肠癌患者与正常对照中基因型分布频率层间具有显著差异的SNP，以此作为非甾体类消炎药预防结直肠癌辅助诊断的指标。最后筛选出的与非甾体类消炎药预防结直肠癌辅助诊断相关的SNP组成相应试剂盒(rs12217975，rs1927466，rs7586006，rs17868336，rs1500482，rs16973225，rs10505806，rs6717546，rs2965667，rs73172231，rs16825767，rs1902023，rs2745559，rs73172243，rs2920421)。试剂可以包括这些SNP的特异性引物和Taq酶、dNTP等。

5.统计分析方法

运用卡方检验(用于分类变量)或者studentt检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析。

为了进一步研究这15个SNP构成的综合指征用于评价辅助诊断的效果，我们构建了一个数学公式，在是否服用非甾体类消炎药的层因素下，综合考虑每个SNP与直肠癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，我们对每个SNP的三种基因型进行评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，以单个SNP分析时的additive模型下的回归系数为权重，综合考虑每个SNP的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值＝(-0.366×rs12217975的评分)+(0.373×rs1927466的评分)+(0.374×rs7586006的评分)+(0.379×rs17868336的评分)+(-0.383×rs1500482的评分)+(0.431×rs16973225的评分)+(0.443×rs10505806的评分)+(-0.533×rs6717546的评分)+(0.503×rs2965667的评分)+(-0.374×rs73172231的评分)+(0.421×rs16825767的评分)+(0.390×rs1902023的评分)+(0.432×rs2745559的评分)+(0.372×rs73172243的评分)+(-0.367×rs2920421的评分)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于关联研究的1202例样本中。(以rs12217975为例：-0.366为rs12217975的回归系数(见表1)；rs12217975的评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，某个SNP的基因型由仪器检测结果确定；某个样本的总评分是这些个SNP分别评分的总和，单个SNP的基因型只是计算评分的一个中间过程，不需要知道具体基因型。)综上，根据危险分值来评估受试者是否适合服用非甾体类消炎药进行结直肠癌的预防或者治疗。由危险得分的分布情况得出cutoff值为0.373，从而确定是否适合服用非甾体类消炎药的临界值，并进一步选取得分前25％的作为高危人群临界值，据此估算风险评估区间为小于等于0.373为低风险人群，大于0.373到0.804为中风险人群，大于等于0.804为高风险人群。其意义分别在于受试者危险评分位于小于等于0.373，则认为较适合服用非甾体类消炎药进行结直肠癌的预防及治疗，受试者危险评分位于大于0.373到0.804间，则不建议非甾体类消炎药进行结直肠癌的预防及治疗，受试者危险评分达到0.804以上，则强烈不建议非甾体类消炎药进行结直肠癌的预防及治疗。

表1.病例组与对照组关联分析结果

统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(PLINK1.07)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。

以下是本发明进一步的说明：

在上述568例结直肠癌患者及634例正常对照中，两组年龄、性别均衡可比。我们将这两组人群经SequenomMassARRAY进行SNP检测后获得相关结果。

根据SequenomMassARRAY的检测，本发明人检测到在比较了使用或不使用非甾体类消炎药的情况下“结直肠癌”组和“正常对照”组中基因型分布频率在测层间存在明显差异的SNP包括：rs12217975，rs1927466，rs7586006，rs17868336，rs1500482，rs16973225，rs10505806，rs6717546，rs2965667，rs73172231，rs16825767，rs1902023，rs2745559，rs73172243，rs2920421。

单因素和多因素Logistic回归分析结果均表明，这15个SNP与是否服用非甾体类消炎药的结直肠癌发病存在着显著关联。

进一步分析这15个SNP的组合用于结直肠癌辅助诊断的效果，发现其组合能够很好的区分适用非甾体类消炎药和不适用非甾体类消炎药的结直肠癌人群。

根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于非甾体类消炎药预防结直肠癌的辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血标本DNA中上述SNP的特异性引物、特异性荧光探针对和其他检测试剂。

具体而言，这15个SNP的组合，或者这15个SNP的特异性引物及特异性荧光探针对的组合构成的相关诊断试剂盒有助于结直肠癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

本发明有益效果：

本发明提供的SNP标志物序列改变作为结直肠癌辅助判断的标志物的优越性在于：

(1)SNP标志物是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断及治疗相关的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为结直肠癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)采用严密的评价体系，本发明人应用Sequenome基因分型方法以获取疾病候选基因相关的SNP谱，以上方法和策略的应用加速和保证了SNP生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

(3)本发明获得的与非甾体类消炎药预防结直肠癌相关的SNP标志物谱和特异性引物，并进行了相关辅助诊断试剂盒的研制。根据检测情况，在是否服用非甾体类消炎药的层因素下，综合考虑了每个SNP与直肠癌发病的正、负关联情况和联系强度，通过危险分值来评估受试者是否适合服用非甾体类消炎药进行结直肠癌的预防或者治疗，指导临床用药，既可针对性地对适宜或潜在的结直肠癌患者进行非甾体类消炎药预防或者治疗，提高用药效果，又可以减少药物滥用，避免过度医疗。

附图说明

图1是服用非甾体类消炎药结直肠癌组与不服用非甾体类消炎药结直肠癌组的ROC曲线图。

具体实施方式

实施例1样品的收集和样品资料的整理

发明人选择了1202例符合下列标准的样本进行单个SNPSequenomMassARRAY基因分型的实验样品：

1、病理学明确诊断的结直肠癌患者568例；

2、与病例年龄、性别匹配的健康对照634例；

并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况，并通过临床病程记录摘取病例个体中是否规律服用非甾体类消炎药的情况，有362例病人规律服用非甾体类消炎药，206例病人不服用非甾体类消炎药。药物范围包括乙酰水杨酸盐类(如阿司匹林)、非水杨酸盐类和非乙酰基水杨酸盐类药物(如芬必得、布洛芬、尼美舒利、扶他林等)。

实施例2外周血DNA中SNP标志物的分型扫描

在上述符合条件的568例结直肠癌患者(其中服用非甾体类消炎药组362例、不服用非甾体类消炎药组206例)和634例正常对照中，病例对照年龄、性别匹配。将这两组人群经SequenomMassARRAY分型检测获得相关结果。具体步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度：通常能得到20-50ng/μlDNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

8、进行SequenomMassARRAY基因分型：

1)使用Sequenom公司GenotypingTools及MassARRAYAssayDesign软件对候选通路基因上的SNP设计PCR扩增引物及单碱基延伸引物。反应体系包括4μlSequenomMassARRAY基因分型PCRmastermix(0.2μl的HotstarTaq0.5U，1μl的0.5uM扩增引物混合物，0.1μl的25mMdNTPs，0.4μl的25mMMgCl₂，0.5μl的PCRBuffer，1.8μl双蒸水)，加入1μlDNA。PCR反应条件为：94℃4分钟；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃保持。

2)在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimpalkalinephosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。

3)在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系包括：2μlEXTENDMix(单碱基延伸反应液，包括其中延伸反应引物混合物0.94μl，即预先进行延伸引物的混合，按分子量大小将引物分为三组，按照8/10/15μM等摩尔量比例混合)，iPLEX酶0.041μl，Buffer0.2μl，iPLEXtermination混合物0.2μl，双蒸水0.619ul)，7μlSAP处理后PCR产物。PCR反应条件：I.94℃30秒；II.94℃5秒；III.52℃5秒；IV.80℃5秒；V.重复III、IV4个循环；VI.重复II、III、IV、V39个循环；VII.72℃3分钟；VIII.4℃保持。

4)树脂纯化：

(1)将CleanResin树脂平铺到6mg的树脂板中；

(2)加16μl水到延伸产物的对应孔内；

(3)将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟，使树脂与反应物充分接触；

(4)离心使树脂沉入孔底部。

5)芯片点样：启动MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。

6)质谱检测：将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assistedlaserdesorption/ionization–timeoffligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果。

9、基因型判读：采用TYPER4.0软件(sequenom)进行。

10、数据处理和分析：利用logistic回归模型中的additive模型比较在是否服用非甾体类消炎药层因素下，每个SNP的三种基因型在病例组和对照组中分布频率的差异，筛选出存在层间异质性的15个阳性关联SNP，具体序列见表2。

实施例3利用危险度评分方法进一步分析SNP与结直肠癌的关系

根据上述结果，本发明人通过对2组样品在是否服用非甾体类消炎药的分层因素(即“服用非甾体类消炎药结直肠癌组”和“不服用非甾体类消炎药结直肠癌组”)下，进行基因型分布频率的比较，最终选择出15个阳性关联的SNP，以单个SNP回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评价诊断的灵敏性和特异性，进而分析这些SNP对是否适宜服用非甾体类消炎药预防结直肠癌发病的情况进行诊断。对15个SNP标志物的联合分析发现，这15个SNP以69.0％的AUC将适合服用非甾体类消炎药和不适合服用非甾体类消炎药的结直肠癌患者分开，最佳临界点的灵敏度为69.4％，特异度为62.1％(图1)。

因此，本发明人证明了采用rs12217975，rs1927466，rs7586006，rs17868336，rs1500482，rs16973225，rs10505806，rs6717546，rs2965667，rs73172231，rs16825767，rs1902023，rs2745559，rs73172243和rs2920421的组合能够很好地区分适合服用非甾体类消炎药和不适合服用非甾体类消炎药的人群。也就是说，这15个SNP的组合区分出的“适合服用非甾体类消炎药”的人群适合用这类药物进行预防或者治疗，区分出的“不适合服用非甾体类消炎药”的人群则不建议服用非甾体类消炎药来预防结直肠癌，以减少药物滥用，避免过度医疗。

实施例4非甾体类消炎预防结直肠癌相关SNP的辅助诊断试剂盒的制作

SNP试剂盒的制作和操作流程是基于Affymetrix6.0芯片检测和SequenomMassARRAY基因分型技术。试剂盒含有一批SNP特异性引物(包括下列引物：rs12217975的引物序列为SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3；rs1927466的引物序列为SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和SEQIDNO：6；rs7586006的引物序列为SEQIDNO：7、SEQIDNO：8和SEQIDNO：9；rs17868336的引物序列为SEQIDNO：10、SEQIDNO：11和SEQIDNO：12；rs1500482的引物序列为SEQIDNO：13、SEQIDNO：14和SEQIDNO：15；rs16973225的引物序列为SEQIDNO：16、SEQIDNO：17和SEQIDNO：18；rs10505806的引物序列为SEQIDNO：19、SEQIDNO：20和SEQIDNO：21；rs6717546的引物序列为SEQIDNO：22、SEQIDNO：23和SEQIDNO：24；rs2965667的引物序列为SEQIDNO：25、SEQIDNO：26和SEQIDNO：27；rs73172231的引物序列为SEQIDNO：28、SEQIDNO：29和SEQIDNO：30；rs16825767的引物序列为SEQIDNO：31、SEQIDNO：32和SEQIDNO：33；rs1902023的引物序列为SEQIDNO：34、SEQIDNO：35和SEQIDNO：36；rs2745559的引物序列为SEQIDNO：37、SEQIDNO：38和SEQIDNO：39；rs73172243的引物序列为SEQIDNO：40、SEQIDNO：41和SEQIDNO：42；rs2920421的引物序列为SEQIDNO：43、SEQIDNO：44和SEQIDNO：45)，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl₂，双蒸水，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物检测SNP，再通过SNP谱指导结直肠癌非甾体类消炎药的使用，不仅稳定，检测方便，且精确，可以辅助提高药物治疗的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

表2.相关SNP标志物引物信息

F：ForwardPrimer，上游引物；R：ReversePrimer，下游引物；E：ExtendedPrimer，延伸引物。