肽及其复合物、组织修复用支架及其表面处理方法、以及表面处理液或处理液组

摘要

提供一种肽、含有该肽的复合物、使用该肽或该复合物进行了表面处理的组织修复用支架、使用该肽或该复合物进行的组织修复用支架的表面处理方法、以及该表面处理方法中使用的处理液或处理液组，所述肽能够进行组织修复用支架的表面处理，所述表面处理能够不使用对活体组织的修复产生不良影响的材料地促进活体组织的修复。将含有粘接性部位和碱性部位的肽与糖胺聚糖组合而进行组织修复用支架的表面处理，所述粘接性部位和碱性部位分别包含规定的氨基酸残基。

说明书

技术领域

本发明涉及适合用于组织修复用支架的表面处理的肽和含有该肽的复合物。此外，本发明涉及使用该肽或该复合物进行了表面处理的组织修复用支架。进而，本发明涉及使用该肽或该复合物进行的组织修复用支架的表面处理方法、以及含有该肽或该复合物的组织修复用支架的表面处理用的处理液或处理液组。

背景技术

以往，各种活体组织的修复使用的是成为细胞生长的架子的、称为支架的材料。作为这样的支架的材质，使用各种天然或合成高分子、无机材料，但这些材料与活体组织的亲和性不一定高。因此，有时即使在活体组织的修复中应用支架也无法将组织修复至期望的程度，或者组织的修复需要大量时间。

为了解决这样的问题，已知将支架与细胞生长因子一起使用。作为将支架与细胞生长因子一起使用的活体组织修复用材料，已知例如含有支架和成纤维细胞生长因子(FGF)等细胞生长因子的骨再生材料(参照专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2012-016517号公报

发明内容

发明所要解决的课题

可是，正如专利文献1记载的那样，只是将支架和细胞生长因子物理混合而使用则细胞生长因子会在对组织进行修复时从支架游离，难以获得期望的促进组织修复的效果。为了防止细胞生长因子从支架游离，可以考虑利用化学交联剂、静电相互作用将细胞生长因子固定在支架上。可是，这样的方法中，不仅有细胞生长因子的结构发生变化、活性降低的可能，而且有固定化所用的材料对活体组织的修复产生不良影响的可能。

本发明是鉴于上述课题做出的，其目的在于，提供一种肽、含有该肽的复合物、使用该肽或该复合物进行了表面处理的组织修复用支架、使用该肽或该复合物进行的组织修复用支架的表面处理方法、以及该表面处理方法中使用的处理液或处理液组，所述肽能够进行组织修复用支架的表面处理，所述表面处理能够不使用对活体组织的修复产生不良影响的材料地促进活体组织的修复。

用于解决课题的方法

本发明人等发现，通过将含有粘接性部位和碱性部位的肽与糖胺聚糖组合而进行组织修复用支架的表面处理能够解决上述课题，从而完成了本发明，所述粘接性部位和碱性部位分别包含规定的氨基酸残基。

发明的效果

根据本发明，能够提供一种肽、含有该肽的复合物、使用该肽或该复合物进行了表面处理的组织修复用支架、使用该肽或该复合物进行的组织修复用支架的表面处理方法、以及该表面处理方法中使用的处理液或处理液组，所述肽能够进行组织修复用支架的表面处理，所述表面处理能够不使用对活体组织的修复产生不良影响的材料地促进活体组织的修复。

附图说明

图1是实施例8中拍摄的、显示埋入支架后第7天的ICR小鼠的皮下组织的图像的图。

图2是实施例9中拍摄的、显示埋入支架后第7天的ICR小鼠的皮下组织的图像的图。

图3是比较例1中拍摄的、显示埋入支架后第7天的ICR小鼠的皮下组织的图像的图。

图4是参考例1中拍摄的、显示埋入支架后第7天的ICR小鼠的皮下组织的图像的图。

图5是参考例2中拍摄的、显示埋入支架后第7天的ICR小鼠的皮下组织的图像的图。

图6是参考例3中拍摄的、显示埋入支架后第7天的ICR小鼠的皮下组织的图像的图。

图7是参考例4中拍摄的、显示埋入支架后第7天的ICR小鼠的皮下组织的图像的图。

图8是实施例10中拍摄的、显示埋入支架后第28天的ICR小鼠的皮下组织的HE染色和抗CD31抗体免疫染色后的图像的图。

图9是实施例11中拍摄的、显示填充支架4周后的小鼠的骨缺损部的X射线CT图像的图。

图10是比较例2中拍摄的、显示填充支架4周后的小鼠的骨缺损部的X射线CT图像的图。

具体实施方式

[第1方式]

本发明的第1方式涉及的肽是氨基酸序列中具有粘接性部位和碱性部位的肽，所述粘接性部位包含2,3-二羟基苯基或3,4-二羟基苯基的氨基酸残基，碱性部位中有3个以上的碱性氨基酸残基相连。以下，在本申请的说明书中，也将该肽记为“粘接性肽”。该粘接性肽能够通过粘接性部位与组织修复用支架的表面结合，能够通过碱性部位与糖胺聚糖结合。以下，在本申请的说明书中，也将“组织修复用支架”简单地记为“支架”。

第1方式涉及的肽适合用于组织修复用支架的表面处理。使用经表面处理的组织修复用支架修复的组织没有特别限定。作为优选的使用经表面处理的组织修复用支架修复的组织，可以列举血管、皮肤、肌肉、软骨、骨、消化管、乳房、心脏瓣膜、牙周组织和眼周组织等。

在不损害本发明的目的的范围内，构成第1方式涉及的肽的氨基酸残基的数目没有特别限定。典型而言，构成粘接性肽的氨基酸残基的数目优选为4个以上100个以下，更优选为5个以上50个以下，特别优选为10个以上30个以下。

粘接性肽所具有的粘接性部位包含具有2,3-二羟基苯基或3,4-二羟基苯基的氨基酸残基。粘接性部位具有两个羟基相邻的二羟基苯基，因此能够与支架的表面结合。当支架由金属材料形成时，利用存在于支架的表面的金属原子与二羟基苯基的螯合，粘接性肽通过粘接性部位结合于支架的表面。当支架由具有羟基、氨基那样的含有活性氢的官能团的有机高分子、陶瓷等材料形成时，利用二羟基苯基氧化生成的醌与羟基、氨基那样的含有活性氢的官能团的反应，粘接性肽通过粘接性部位结合于支架的表面。

2,3-二羟基苯基和3,4-二羟基苯基中，从与支架的表面反应的容易度出发，优选3,4-二羟基苯基。作为具有3,4-二羟基苯基的氨基酸的具体例子，可以列举3-(3,4-二羟基苯基)-L-丙氨酸(L-多巴)、3-(3,4-二羟基苯基)-2-甲基-L-丙氨酸(甲基多巴)和(3R)-3-(3,4-二羟基苯基)-L-丝氨酸(DOPS)等。其中，实际上，从以在贻贝那样的生物中构成肽的氨基酸的形式进行利用、调制肽时容易获得等方面出发，优选3-(3,4-二羟基苯基)-L-丙氨酸(L-多巴)。

粘接性肽通过碱性部位与糖胺聚糖结合，第1方式涉及的粘接性肽具有3个以上的碱性氨基酸残基相连的碱性部位，因此在使粘接性肽与糖胺聚糖接触时，能够有效地使糖胺聚糖结合于碱性部位。构成碱性部位的连续的碱性氨基酸残基的数目优选为3个以上30个以下，更优选为3个以上10个以下。构成碱性部位的碱性氨基酸残基从赖氨酸残基(Lys)、精氨酸残基(Arg)、组氨酸残基(His)、以及5-羟基赖氨酸、鸟氨酸、犬尿氨酸和经修饰的上述氨基酸残基中选择。这里，关于氨基酸残基的修饰，只要修饰后的氨基酸残基是碱性的就没有特别限定，可以从各种公知的氨基酸残基的修饰中选择。

粘接性肽中，粘接性部位与碱性部位优选通过间隔区部位而结合。构成间隔区部位的氨基酸残基的数目没有特别限定，优选为1个以上50个以下，更优选为3个以上30个以下。当粘接性部位与碱性部位通过由这样的数目的氨基酸残基构成的间隔区部位而结合时，以粘接性部位为起点从支架的表面伸出的肽链能够比较自由地运动，因此容易利用碱性部位捕捉糖胺聚糖、利用碱性部位所结合的糖胺聚糖捕捉细胞生长因子。

粘接性肽中，优选N末端或C末端是在末端或其附近具有碱性部位的碱性末端。在末端或其附近具有碱性部位是下述状态：在比该碱性部位更靠近碱性末端一侧不存在氨基酸残基或存在包含1个以上5个以下的氨基酸残基且不含粘接性部位的部位。当比碱性部位更靠近碱性末端一侧存在某种程度长度的肽链时，有时由于比碱性部位更靠近碱性末端一侧的肽链的空间位阻而难以利用碱性部位捕捉糖胺聚糖。可是，若碱性部位位于粘接性肽的末端或其附近，则难以发生这样的不良状况。

此外，粘接性肽中，优选除碱性末端以外的另一端为在末端或其附近具有粘接性部位的粘接性末端。在末端或其附近具有粘接性部位是下述状态：从粘接性末端开始的5个氨基酸残基内含有粘接性部位且不含碱性部位。若粘接性肽具有粘接性末端，则形成粘接性肽的大体整个长度能够在支架的表面自由地运动的状态，因此容易利用碱性末端捕捉糖胺聚糖。

作为具有这样的碱性末端和粘接性末端的粘接性肽，优选从C末端开始的9个残基的氨基酸序列是下述序列号1所示的氨基酸序列。下述序列号1所示的氨基酸序列是贻贝所产生的粘接性肽的氨基酸序列中重复存在的序列。贻贝所产生的粘接性肽具有包含这样的重复序列的部位，因此能够牢固地对各种基质进行结合。

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Xaa-Lys···(1)

(序列号(1)中，Xaa为L-多巴残基。)

粘接性肽可以按照设计的氨基酸序列通过公知的方法取得。作为合适的方法，可以列举Fmoc法、Boc法那样的固相合成方法。通过这样的固相合成方法得到的粗制粘接性肽可以根据需要使用反相HPLC等方法来精制。可以通过公知的方法确认得到的粘接性肽是否是期望的序列。作为这样的方法，可以列举对通过MALDI-TOF/MS测定的粘接性肽的分子量与从氨基酸序列算出的粘接性肽的理论分子量进行比较的方法。

以上说明的粘接性肽能够通过粘接性部位结合于各种支架的表面，能够使糖胺聚糖结合于碱性部位。此外，糖胺聚糖能够与各种细胞生长因子结合。因此，若在用第1方式涉及的粘接性肽对支架进行表面处理后，进一步用糖胺聚糖、糖胺聚糖与细胞生长因子进行表面处理，则能够显著促进通过使用支架进行的组织修复。

[第2方式]

本发明的第2方式是包含上述粘接性肽与糖胺聚糖的复合物。该复合物中，粘接性肽的碱性部位结合有糖胺聚糖。该复合物例如通过在水中将粘接性肽与糖胺聚糖混合而形成。

在不损害本发明的目的的范围内，糖胺聚糖的种类没有特别限定。作为糖胺聚糖的具体例子，可以列举肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质酸。这些糖胺聚糖中，从容易获得且廉价、与细胞生长因子的结合性优异方面出发，优选肝素。

若使第2方式涉及的复合物接触组织修复用支架的表面，则复合物通过复合物中的粘接性肽所具有的粘接性部位结合于支架的表面。表面结合有第2方式涉及的复合物的支架能够使细胞生长因子结合于复合物所含的糖胺聚糖。因此，若将这样的支架载置于修复对象的组织内，则能够使根据组织的种类的不同而存在于组织内的细胞生长因子集中于支架周围，从而促进组织的修复。

此外，优选支架的表面所承载的第2方式涉及的复合物中预先结合有细胞生长因子。然后，通过将支架载置于被修复的组织内，能够在支架周围缓释细胞生长因子，能够进一步提高促进组织修复的效果。

在不损害本发明的目的的范围内，糖胺聚糖的分子量没有特别限定。糖胺聚糖的分子量通常优选为3,000～1,000,000道尔顿，更优选为3,000～100,000道尔顿，特别优选为5,000～30,000道尔顿。当使用这样的范围的分子量的糖胺聚糖时，容易形成粘接性肽、糖胺聚糖以及细胞生长因子的复合物。

[第3方式]

本发明的第3方式是上述粘接性肽、糖胺聚糖以及细胞生长因子的复合物。该复合物中，粘接性肽的碱性部位结合有糖胺聚糖，结合于粘接性肽的糖胺聚糖结合有细胞生长因子。该复合物可以通过例如在水中将粘接性肽、糖胺聚糖以及细胞生长因子混合而形成。

若使第3方式涉及的复合物接触组织修复用支架的表面，则复合物通过复合物中的粘接性肽所具有的粘接性部位结合于支架的表面。若将表面结合有第3方式涉及的复合物的支架载置于修复对象的组织内，则在支架的表面缓释复合物所含的细胞生长因子，显著促进组织的修复。

细胞生长因子的种类没有特别限定，根据用支架修复的对象组织的种类适当选择。作为细胞生长因子的例子，可以列举表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板源性生长因子(PDGF)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形成蛋白(BMP)、白细胞介素1(IL-1),白细胞介素(IL-2)、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、神经鞘瘤源性生长因子(SDGF)和肝细胞生长因子(HGF)等。

[第4方式]

本发明的第4方式是上述粘接性肽通过粘接性肽所具有的粘接性部位结合于组织修复用支架的表面的组织修复用支架。结合于第4方式的组织修复用支架的表面的粘接性肽具有碱性部位，因此能够进一步结合糖胺聚糖、通过糖胺聚糖结合细胞生长因子。

构成支架的材料没有特别限定，从作为以往的组织修复用支架的材料而使用的材料中适当选择。作为支架的材料，可以列举：胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、海藻酸、纤维素和几丁质等天然高分子；聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚乙二醇(PEG)、聚亚甲基碳酸酯、聚二烷酮和它们的共聚物等合成高分子；氧化铝、氧化锆、磷灰石等陶瓷；不锈钢、钴合金、钛、钛合金等金属材料；碳酸钙、磷酸钙等无机材料。

支架的形态没有特别限定，根据所再生的组织的种类、所再生的部位的形状适当选择。作为支架的形态的例子，可以列举多孔质、片、网和粉末等。当支架为多孔质材料时，作为多孔质材料的具体形状，可以列举圆柱、棱柱、平板、球和椭圆球等。

[第5方式]

本发明的第5方式是一种组织修复用支架，其为表面具有糖胺聚糖的组织修复用支架，上述粘接性肽通过粘接性肽所具有的粘接性部位结合于支架的表面，糖胺聚糖结合于粘接性肽所具有的碱性部位。通过使用这样的支架，得到与关于第二方式说明的效果同样的效果。

[第6方式]

本发明的第6方式是一种组织修复用支架，其为表面具有细胞生长因子的组织修复用支架，上述粘接性肽通过粘接性肽所具有的粘接性部位结合于支架的表面，细胞生长因子与糖胺聚糖结合且通过糖胺聚糖与粘接性肽所具有的碱性部位结合。通过使用这样的支架，得到与关于第三方式说明的效果同样的效果。

[第7方式]

本发明的第7方式是一种组织修复用支架的表面处理方法，其为使上述粘接性肽接触组织修复用支架的表面。通过使粘接性肽接触组织修复用支架的表面，粘接性肽通过粘接性部位结合于组织修复用支架的表面。通过这样做，能够使糖胺聚糖结合于支架的表面所承载的粘接性肽所具有的碱性部位。结合于碱性部位的糖胺聚糖能够进一步与各种细胞生长因子结合。因此，若通过粘接性肽使糖胺聚糖结合于支架的表面并将这样的支架载置于被修复的组织内，则能够使根据组织的种类的不同而存在于组织内的细胞生长因子集中于支架周围，从而促进组织的修复。

此外，优选结合于支架的表面所承载的粘接性肽的糖胺聚糖预先结合有细胞生长因子。然后，通过将支架载置于被修复的组织内，能够使细胞生长因子在支架周围缓释，能够进一步提高促进组织修复的效果。

出于以上的理由，对支架的表面实施以下的(1)和(2)的处理、或者实施(1)、(2)和(3)的处理。

(1)使粘接性肽接触支架的表面的处理。

(2)使糖胺聚糖结合于支架的表面所承载的粘接性肽所具有的碱性部位的处理。

(3)使细胞生长因子结合于支架的表面所承载的粘接性肽所结合的糖胺聚糖的处理。

此外，也可以在进行上述(1)的处理后，代替(2)和(3)的处理，实施以下的(4)的处理。当进行(4)的处理时，糖胺聚糖和细胞生长因子的复合物中的糖胺聚糖与粘接性肽所具有的碱性部位结合。

(4)使糖胺聚糖和细胞生长因子的复合物结合于支架的表面所承载的粘接性肽所具有的碱性部位的处理。

通过对组织修复用支架实施(1)和(2)的处理，能够形成第5方式涉及的支架。此外，通过对组织修复用支架实施(1)、(2)和(3)的处理或者实施(1)和(4)的处理，能够形成第6方式涉及的支架。以下，依次对上述工序(1)～(4)进行说明。

〔工序(1)〕

使组织修复用支架的表面与粘接性肽接触的方法没有特别限定。从使组织修复用支架的表面与粘接性肽接触时组织修复用支架的表面与粘接性肽容易均匀接触方面出发，粘接性肽通常以溶液的形态使用。作为使粘接性肽溶液接触支架的表面的方法，可以列举涂布、喷雾和浸渍那样的方法。这些方法之中，优选浸渍。这是由于，在支架由多孔质材料形成的情况下，能够使粘接性肽接触多孔质材料所具有的细孔的内部表面。

通过浸渍使粘接性肽接触支架的表面时的温度、时间只要粘接性肽对支架的表面的结合良好地进行，就没有特别限定。典型而言，浸渍在5～90℃进行，优选在20～70℃进行。此外，浸渍时间优选为0.1～48小时，更优选为1～24小时。

相对于支架的表面积，使粘接性肽接触支架的表面时的粘接性肽的使用量优选为0.1～50mg/m²，更优选为1.0～10mg/m²。

表面处理时所用的粘接性肽溶液的浓度没有特别限定。典型而言，粘接性肽溶液的浓度优选为0.1～10mg/mL，更优选为0.5～5mg/mL。

在使支架与粘接性肽溶液接触后，可以直接进行工序(2)或(4)，也可以在使支架干燥后进行工序(2)或(4)。

〔工序(2)〕

在工序(2)中，使糖胺聚糖结合于支架的表面所承载的粘接性肽所具有的碱性部位。为了使糖胺聚糖结合于支架的表面所承载的粘接性肽所具有的碱性部位，通常使表面承载粘接性肽的支架与糖胺聚糖溶液接触。糖胺聚糖具有作为酸性官能团的磺酸基、羧酸基，这些酸性基团可以在糖胺聚糖溶液中形成钠盐、钾盐那样的盐。

表面承载有粘接性肽的支架与糖胺聚糖溶液的接触通过与工序(1)中的支架与粘接性肽溶液的接触同样的方法进行。当将表面承载有粘接性肽的支架在糖胺聚糖溶液中浸渍而进行处理时，浸渍时的温度、时间只要糖胺聚糖对粘接性肽的结合良好地进行，就没有特别限定。典型而言，浸渍在5～90℃进行，优选在20～70℃进行。此外，浸渍时间优选为0.1～48小时，更优选为1～24小时。

表面处理时所用的糖胺聚糖溶液的浓度没有特别限定。典型而言，糖胺聚糖溶液的浓度优选为0.1～10mg/mL(当为肝素时，效价为20～2000单位/mL)，更优选为0.5～5mg/mL(当为肝素时，效价为100～1000单位/mL)。

表面处理时的糖胺聚糖的使用量没有特别限定，以充分量的糖胺聚糖能够结合于粘接性肽的方式适当选择。

〔工序(3)〕

在工序(3)中，使细胞生长因子结合于与支架的表面所承载的粘接性肽所具有的碱性部位结合的糖胺聚糖。为了使细胞生长因子结合于与支架的表面所承载的粘接性肽所具有的碱性部位结合的糖胺聚糖，通常使表面承载有碱性部位结合有糖胺聚糖的粘接性肽的支架与糖胺聚糖溶液接触。表面承载有碱性部位结合有糖胺聚糖的粘接性肽的支架与糖胺聚糖溶液的接触通过与工序(1)中的支架与粘接性肽溶液的接触同样的方法进行。

当将表面承载有碱性部位结合有糖胺聚糖的粘接性肽的支架在细胞生长因子溶液中浸渍而进行处理时，浸渍时的温度、时间只要细胞生长因子对糖胺聚糖的结合良好地进行，就没有特别限定。典型而言，浸渍在5～70℃进行，优选在5～30℃进行。此外，浸渍时间优选为0.1～48小时，更优选为1～24小时。

表面处理时所用的细胞生长因子溶液的浓度没有特别限定。典型而言，细胞生长因子溶液的浓度优选为1～1,000μg/mL，更优选为10～500μg/mL。

表面处理时的细胞生长因子的使用量没有特别限定，以充分量的细胞生长因子能够结合于糖胺聚糖的方式适当选择，所述糖胺聚糖结合于粘接性肽。

〔工序(4)〕

在工序(4)中，继工序(1)之后，使表面承载有粘接性肽的支架与糖胺聚糖和细胞生长因子的复合物接触，使糖胺聚糖和细胞生长因子的复合物结合于支架的表面所承载的粘接性肽所具有的碱性部位。糖胺聚糖和细胞生长因子的复合物可以通过将糖胺聚糖和细胞生长因子在水那样的溶剂中混合而形成。

表面承载有粘接性肽的支架与糖胺聚糖和细胞生长因子的复合物的接触优选将表面承载有粘接性肽的支架在糖胺聚糖和细胞生长因子的复合物的溶液中浸渍而进行。该浸渍与工序(3)同样地进行。

[第8方式]

本发明的第8方式是一种组织修复用支架的表面处理方法，其为使第2方式涉及的包含粘接性肽和糖胺聚糖的复合物与组织修复用支架接触。第2方式涉及的复合物与支架的接触是使用第2方式涉及的复合物的溶液，与关于第7方式涉及的表面处理方法说明的工序(1)同样地进行。

在第2方式涉及的复合物与支架接触后，可以根据需要使表面承载有第2方式涉及的复合物的支架与细胞生长因子接触。通过这样做，细胞生长因子结合于支架的表面所承载的第2方式涉及的复合物中的糖胺聚糖。

[第9方式]

本发明的第9方式是一种组织修复用支架的表面处理方法，其为使第3方式涉及的包含粘接性肽、糖胺聚糖以及细胞生长因子的复合物与组织修复用支架接触。第3方式涉及的复合物与支架的接触是使用第3方式涉及的复合物的溶液、与关于第7方式涉及的表面处理方法说明的工序(3)同样地进行。

[第10方式]

本发明的第10方式是含有上述粘接性肽的组织修复用支架的表面处理液。关于第10方式涉及的表面处理液所含的溶剂的种类，只要能够使粘接性肽溶解，在不损害本发明的目的的范围内就没有特别限定。从粘接性肽的溶解性、对使用支架修复的组织没有不良影响等方面出发，通常使用水作为表面处理液所含的溶剂。

表面处理液的调制方法没有特别限定。当粘接性肽为溶液状态时，通过将含有粘接性肽的溶液以粘接性肽的浓度成为期望的浓度的方式进行稀释或浓缩而得到表面处理液。当粘接性肽通过冷冻干燥等方法进行了粉末化时，通过将粘接性肽粉末与水等溶剂按规定的比率混合使粘接性肽溶解于溶剂而得到表面处理液。

表面处理液中粘接性肽的浓度没有特别限定。表面处理液中粘接性肽的优选浓度与关于第7方式涉及的表面处理方法说明的工序(1)中使用的粘接性肽溶液同样。

在不损害本发明的目的的范围内，第10方式涉及的表面处理液可以含有各种不会结合于粘接性肽所具有的粘接性部位和碱性部位的添加剂。作为配合于表面处理液的添加剂，可以列举pH调节剂、渗透压调节剂、表面活性剂、粘度调节剂、稳定剂、着色剂、香料、抗氧化剂、防腐剂、防霉剂和紫外线吸收剂等。这些添加剂通常按照这些添加剂对于各种药液而配合的量添加于表面处理液。

[第11方式]

本发明的第11方式是一种组织修复用支架的表面处理用的处理液组，其包括第10方式涉及的含有粘接性肽的表面处理液和含有糖胺聚糖的表面处理液。关于含有糖胺聚糖的表面处理液所含的溶剂的种类，只要能够使糖胺聚糖溶解，在不损害本发明的目的的范围内就没有特别限定。从糖胺聚糖的溶解性、对使用支架修复的组织没有不良影响等方面出发，通常使用水作为含有糖胺聚糖的表面处理液所含的溶剂。

含有糖胺聚糖的表面处理液中糖胺聚糖的浓度没有特别限定。表面处理液中糖胺聚糖的优选浓度与关于第7方式涉及的表面处理方法说明的工序(2)中使用的糖胺聚糖溶液同样。含有糖胺聚糖的表面处理液与含有粘接性肽的表面处理液同样地可以含有各种添加剂。

第11方式涉及的组织修复用支架的表面处理用的处理液组可以进一步包括含有细胞生长因子的表面处理液。表面处理液中细胞生长因子的优选浓度与关于第7方式涉及的表面处理方法说明的工序(3)中使用的细胞生长因子溶液同样。含有细胞生长因子的表面处理液与含有粘接性肽的表面处理液同样地可以含有各种添加剂。

[第12方式]

本发明的第12方式是含有第2方式涉及的粘接性肽与糖胺聚糖的复合物的表面处理液。关于第12方式涉及的表面处理液所含的溶剂的种类，只要能够使复合物溶解，在不损害本发明的目的的范围内就没有特别限定。从复合物的溶解性、对使用支架修复的组织没有不良影响等方面出发，通常使用水作为表面处理液所含的溶剂。

含有第2方式涉及的复合物的表面处理液的调制方法与第10方式涉及的表面处理液的调制方法同样。表面处理液中复合物的浓度没有特别限定。关于表面处理液中复合物的浓度，表面处理液中复合物所含的粘接性肽的浓度优选与关于第7方式涉及的表面处理方法说明的工序(1)中使用的粘接性肽溶液的合适的浓度同样。含有粘接性肽与糖胺聚糖的复合物的表面处理液与第10方式涉及的表面处理液同样地可以含有各种添加剂。

[第13方式]

本发明的第13方式是一种组织修复用支架的表面处理用的处理液组，其包括第12方式涉及的含有粘接性肽和糖胺聚糖的复合物的表面处理液和含有细胞生长因子的表面处理液。含有细胞生长因子的表面处理液与关于第11方式说明的表面处理液同样。

[第14方式]

本发明的第14方式是含有第3方式涉及的粘接性肽、糖胺聚糖以及细胞生长因子的复合物的表面处理液。关于第14方式涉及的表面处理液所含的溶剂的种类，只要能够使复合物溶解，在不损害本发明的目的的范围内就没有特别限定。从复合物的溶解性、对使用支架修复的组织没有不良影响等方面出发，通常使用水作为表面处理液所含的溶剂。

含有第3方式涉及的复合物的表面处理液的调制方法与第10方式涉及的表面处理液的调制方法同样。表面处理液中复合物的浓度没有特别限定。关于表面处理液中复合物的浓度，表面处理液中复合物所含的粘接性肽的浓度优选与关于第7方式涉及的表面处理方法说明的工序(1)中使用的粘接性肽溶液的合适的浓度同样。含有粘接性肽、糖胺聚糖以及细胞生长因子的复合物的表面处理液与第10方式涉及的表面处理液同样地可以含有各种添加剂。

实施例

以下通过实施例对本发明进行说明，但本发明的范围不限于这些实施例。

[实施例1]

通过Fmoc固相合成方法，合成从C末端开始的9个残基的序列是下述序列号(1)的氨基酸序列的、包含下述序列号(2)的氨基酸序列的粘接性肽。

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Xaa-Lys···(1)

Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Gly-Gly-Gly-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Xaa-Lys···(2)

(序列号(1)和(2)中，Xaa是L-多巴残基。)

利用反相HPLC对得到的粗制粘接性肽进行精制后，利用MALDI-TOF/MS测定精制的粘接性肽的分子量。利用MALDI-TOF/MS测定的肽的分子量为2011.7，与包含序列号(3)的氨基酸序列的粘接性肽的计算分子量2011.3大体一致。

[实施例2]

将实施例1中得到的粘接性肽溶解于蒸馏水中，调制浓度1.0mg/mL的粘接性肽水溶液。在50℃，将由α-TCP(α型磷酸三钙)多孔体(细孔的体积占多孔体的体积的约70％)形成的直径5mm、高度2mm的圆柱形组织修复用支架的基体在0.1mL粘接性肽水溶液中浸渍24小时，使粘接性肽结合于基体的表面。然后，将基体从粘接性肽水溶液取出，将基体用20mL蒸馏水洗涤后干燥。通过X射线光电子能谱法(XPS)对干燥后的基体的表面进行分析，结果，确认到来自肽所含的氮原子的N1s的峰。

[实施例3]

将粘接性肽水溶液的浓度由1.0mg/mL变更为2.0mg/mL，除此以外，与实施例2同样地操作，用粘接性肽水溶液对组织修复用支架的基体进行处理。对于处理后的组织修复用支架的基体的表面，与实施例2同样地操作，利用XPS进行分析，结果，确认到来自肽所含的氮原子的N1s的峰。

[实施例4]

室温下，将实施例2中得到的、用粘接性肽处理过的组织修复用支架的基体在Novo-Heparin(1万单位/10mL、持田制药株式会社制)中浸渍8小时，使肝素结合于支架的基体所承载的粘接性肽的碱性部位。然后，将基体从Novo-Heparin取出，将基体用20mL蒸馏水洗涤后干燥。

[实施例5]

将实施例2中得到的、用粘接性肽处理过的组织修复用支架的基体变更为实施例3中得到的基体，除此以外，与实施例4同样地操作，用Novo-Heparin对组织修复用支架的基体进行处理。

[实施例6]

使用附属于Fiblast(注册商标)喷雾250(科研制药株式会社制)的、含有人重组FGF冷冻干燥品作为细胞生长因子的玻璃瓶和溶解液调制细胞生长因子水溶液。具体而言，在玻璃瓶中加入溶解液使人重组FGF冷冻干燥品溶解成溶解液，调制浓度100μg/mL的细胞生长因子水溶液。将实施例4中得到的、经肝素和粘接性肽处理的组织修复用支架的基体在0.5mL所调制的细胞生长因子水溶液中浸渍，使细胞生长因子结合于在基体的表面结合于粘接性肽的肝素。然后，将基体从细胞生长因子水溶液取出，将基体用20mL蒸馏水洗涤后干燥。利用XPS对使用细胞生长因子处理前的基体的表面和处理后的基体的表面进行分析，结果确认到，通过使用细胞生长因子进行的处理，C2s的峰的强度显著增强。认为这是因为，由于细胞生长因子结合于与基体表面的粘接性肽结合的肝素而基体表面的碳原子数增加。

[实施例7]

将实施例4中得到的、经肝素和粘接性肽处理的组织修复用支架的基体变更为实施例5中得到的基体，除此以外，与实施例6同样地操作，用细胞生长因子水溶液对组织修复用支架的基体进行处理。利用XPS对用细胞生长因子处理前的基体的表面和处理后的基体的表面进行分析，结果确认到，通过使用细胞生长因子进行的处理，C2s的峰的强度显著增强。

[实施例8、实施例9和比较例1]

将结合于基体表面的粘接性肽的肝素结合有细胞生长因子的组织修复用支架、或未进行表面处理的组织修复用支架埋入6周龄的雄性ICR小鼠的皮下后，观察埋入后第7天的支架周围的组织。实施例8中使用实施例6中得到的组织修复用支架。实施例9中使用实施例7中得到的组织修复用支架。比较例1中使用未进行表面处理的组织修复用支架。将实施例8、实施例9和比较例1的埋入支架后第7天的ICR小鼠的皮下组织的照片示为图1(实施例8)、图2(实施例9)和图3(比较例1)。

根据图1和图2可知，当使用结合于基体表面的粘接性肽的肝素结合有细胞生长因子的组织修复用支架时，ICR小鼠的皮下组织中的血管新生良好地进行。另一方面，根据图3可知，当使用未进行表面处理的组织修复用支架时，血管新生的速度慢。

[参考例1～4]

使用基体表面结合有粘接性肽的组织修复用支架或基体表面的粘接性肽结合有肝素的组织修复用支架，除此以外，与实施例8同样地操作，观察埋入支架后第7天的ICR小鼠的皮下组织。参考例1中使用实施例2中得到的组织修复用支架。参考例2中使用实施例3中得到的组织修复用支架。参考例3中使用实施例4中得到的组织修复用支架。参考例4中使用实施例5中得到的组织修复用支架。将参考例1～4的埋入支架后第7天的ICR小鼠的皮下组织的照片示为图4(参考例1)、图5(参考例2)、图6(参考例3)和图7(参考例4)。

根据图4和图5可知，当使用仅用粘接性肽进行表面处理的组织修复用支架时，ICR小鼠的皮下组织中血管新生的速度慢。根据图5和图6可知，当使用经粘接性肽和肝素进行表面处理的组织修复用支架时，ICR小鼠的皮下组织中血管新生的速度也慢。

[实施例10]

继实施例8之后，对埋入实施例6中得到的支架后第28天的ICR小鼠的皮下组织进行组织学评价。组织学评价通过HE染色和抗CD31抗体免疫染色进行。将HE染色和抗CD31抗体免疫染色后的皮下组织的截面的图像示于图8。在图8所示的图像中，确认到大量浸润细胞和血管结构。即，通过使用经粘接性肽、肝素以及细胞生长因子表面处理的支架，ICR小鼠的皮下组织的修复良好地进行。

[实施例11和比较例2]

(小鼠头盖骨的骨再生试验)

将α-TCP(α型磷酸三钙)粉末用实施例1中得到的粘接性肽和肝素进行表面处理。具体而言，在50℃、遮光下将28.7mg的α-TCP(α型磷酸三钙)粉末在0.1mL浓度1.0mg/mL的实施例1中得到的粘接性肽水溶液中浸渍24小时后，在培养箱内风干一晚。常温下将得到的肽修饰α-TCP粉末在0.1mL的Novo-Heparin(1万单位/10mL、持田制药株式会社制)中浸渍8小时，经培养箱内的风干，得到经表面处理的α-TCP粉末。实施例11中使用得到的经表面处理的α-TCP粉末作为支架。比较例2中使用未处理的α-TCP粉末作为支架。

使用环锯棒(Trephinebar)在小鼠的头盖骨中形成直径4mm、深度0.3mm的骨缺损部。在形成的骨缺损部填充粉末状的支架。填充支架后，用ePTFE膜被覆骨缺损部位。填充支架后第4周，利用X射线CT对骨缺损部进行拍照。将实施例11的X射线CT图像示于图9，将比较例2的X射线CT图像示于图10。根据图9与图10的比较可知，图9中，在图像上，骨缺损部内的白化进行得更多。即，实施例11中，骨再生比比较例2进行得更多。认为当使用经粘接性肽和肝素表面处理的支架时，存在于小鼠头部内的细胞生长因子被捕捉在支架的表面，促进了骨再生。