一种用于检测水貂星状病毒的RT-PCR引物及其检测方法

摘要

本发明公开了一种用于检测水貂星状病毒的RT-PCR引物及其检测方法，参照GenBank收录的水貂星状病毒ORF1b基因序列(序列号分别为GU985458.1、NC_004579.1、AY179509.1)保守区，分析设计一对特异性引物，根据设计的引物，探索最佳反应体系和反应条件，建立RT-PCR检测方法，并进行特异性试验、敏感性试验、重复性试验。结果表明建立的水貂星状病毒RT-PCR方法敏感性强，特异性高，能够快速的检测水貂星状病毒。本发明所建立的RT-PCR检测方法具有很好的应用性，能够用于水貂星状病毒的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学分子标记领域，具体地说涉及一种用于检测水貂星 状病毒的RT-PCR引物及其检测方法。

背景技术

水貂星状病毒(Minkastrovirus，MiAstV)是引起水貂腹泻症状的致病原 因之一，特别是断奶前后的水貂和幼年水貂，星状病毒的发病率更为突出。但 是，目前在我国，关于水貂星状病毒的研究还比较少，水貂星状病毒的相关文 献比较匮乏。2011年-2013年在我国某些水貂养殖地区，在1月-2月龄幼貂 中出现了一种中枢神经系统障碍疾病，经研究发现，该病与瑞典、丹麦等国家 发生的水貂震颤综合征(Shankingminksyndrome，SMS)症状相似，主要症状 为头部震颤、步态不稳、共济失调，后期发展为后肢麻痹，病貂因为头部震颤 过剧而无法进食，体温升高，病程一般一周左右，该病的发病率为3％，死亡 率为1％。

该水貂星状病毒的PCR检测技术，能够对水貂星状病毒做出准确的检测， 该技术具有省时、省力、减少成本减少产物污染等优点。该检测方法能够实现 对水貂星状病毒快速准确的检测，从而与引起水貂腹泻症状的冠状病毒和圆环 病毒等病毒进行区分，为水貂疾病的正确诊断打下良好的基础。

水貂星状病毒的ORF1b基因是高度保守序列，因此，针对MiAstV的ORF1b 基因的保守区设计引物建立RT-PCR方法，能够提高RT-PCR检测方法的特异性 和敏感性。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于检测水貂星状病毒的RT-PCR引物及其检测 方法。

为实现上述目的，本发明技术方案如下：

一种用于检测水貂星状病毒的RT-PCR引物，所述RT-PCR引物如下：

其中，所述RT-PCR引物是通过对比GenBank中登陆的水貂星状病毒ORF1b 基因的核苷酸序列(序列号分别为GU985458.1、NC_004579.1、AY179509.1)， 选定基因的相对保守区，利用Primer5.0软件设计所得。

为解决上述问题，本发明提供了一种用于检测水貂星状病毒的RT-PCR引 物的检测方法，包括如下步骤：

S1、将肠内容物样本加适量灭菌PBS稀释后，充分反复冻融3次，5000rpm 离心15min，去上清，得病毒悬液，-70℃保存备用；

采用TaKaRa公司的RNAisoPlus试剂提取样品中总RNA，主要步骤：

S2、取步骤S1所得的病毒悬液250ul至1.5mlEP管中，加入RNAisoPlus 750ul，颠倒混匀，室温静止5min，裂解细胞后，加 入200ul氯仿，剧烈震摇至溶液充分乳化，室温静止10min；

S3、将步骤S2所得溶液12000g4℃离心15min，吸取500ul上清液至另 一新的1.5mlEP管中，加入500ul异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃静置30min。

S4、将步骤S3所得溶液12000g4℃离心10min，弃去上清，加入1ml75％ 的乙醇，颠倒混匀后，12000g4℃离心5min，弃去乙醇，室温干燥沉淀2-5min， 得RNA；

S5、将步骤S4所得的RNA加入20ulDEPC水，溶解RNA沉淀，待沉淀完全 溶解后，通过反转录成cDNA：在PCR管中加入RNA模板5ul、10pmol/ulP1 引物0.5ul、10pmol/ulP2引物0.5ul、5xM-MLVBuffer4ul、2.5mMdNTP Mixture2ul、M-MLVRT0.5ul、RRI0.5ul、DEPC水7ul混合后瞬时离心， 置42℃水浴1h，70℃灭活10min，即得AstcDNA；

S6、以步骤S5所得的cDNA为模板，建立AstRT-PCR检测，PCR扩增体系： cDNA模板2ul、Mg²⁺plus10xPCRBuffer2.5ul、2.5mMdNTPMixture2ul、 rTaqDNApolymerase0.5ul、10pmol/ulP1引物0.5ul、10pmol/ulP2引 物0.5ul、灭菌ddH₂O17ul；

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸 90s，35个循环，72℃延伸10min；

S7、以步骤S6所得的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，在295bp处得到了清 晰可见的目的条带，表明检测到了水貂星状病毒。

本发明具有以下有益效果：

通过序列比对，分别选取了三株水貂星状病毒的ORF1b基因，根据其保守 区设计引物，这样既能保证鉴定病原的正确，又不会漏检不同株的病原；另外， 本发明的扩增产物长度适宜，同时引物二聚体和非特异性扩增产物很少。另外， 通过反应体系和反应条件的优化，得到了灵敏度高特异性强的检测方法。经最 终试验证实，本发明的RT-PCR方法由于引物设计和试验体系的选取，最低可 检测到1.35ng/ul的RNA模板量，且成本低廉，能够快速实现对水貂星状病毒 的特异性和敏感性检测。

附图说明

图1为本发明实施例中不同水貂星状病毒毒株的ORF1b序列比对结果；

图2为本发明实施例中MiAstV上下游引物P₁P₂序列选择区；

图3为本发明实施例中MiAstV重复性试验，M泳道：DL500DNAMarker。 1-5泳道：水貂星状病毒，6泳道：ddH₂O；

图4为本发明实施例中MiAstV特异性试验，M泳道：DL500DNAMarker， 1泳道：水貂星状病毒。2泳道：水貂犬瘟热病毒，3泳道：水貂冠状病毒，4 泳道：水貂细小病毒，5泳道：ddH₂O；

图5为本发明实施例中MiAstV敏感性试验，M泳道：DL500DNAMarker， 1泳道：水貂星状病毒，2泳道：ddH₂O，3-7泳道10^-1-10^-5倍稀释的RNA。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行 进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于限定本发明。

实施例

本发明实施例中所采用的水貂星状病毒阳性病料；水貂细小病毒；水貂犬 瘟热病毒；猪流行性腹泻病毒均由青岛农业大学预防兽医重点实验室保存。

步骤1、引物的设计与合成：通过DNAStar软件中的MegLign比对GenBank 中登录的水貂星状病毒(MiAstV)的ORF1b基因的核苷酸序列(图1)，选定 基因的相对保守区。利用Primeer5.0软件，以水貂星状病毒(NC_004579.1) ORF1b基因序列为参照，设计检测水貂星状病毒的特异性引物(图2，表1)。 引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，用DEPC水稀释到10pmol/ul，-20 摄氏度保存备用。

表1引物序列

注：在Minkastrovirus株(NC_004579.1)全基因组中的位置

步骤二：采用TaKaRa公司的RNAisoPlus试剂提取样品中总RNA：

S21、将肠内容物样本加适量灭菌PBS稀释后，充分反复冻融3次，5000rpm 离心15min，去上清(病毒悬液)，-70℃保存备用。

S22、取步骤S21所得的病毒悬液250ul至1.5mlEP管中，加入RNAiso Plus750ul，颠倒混匀，室温静止5min，裂解细胞， 向上述EP管中加入200ul氯仿，剧烈震摇至溶液充分乳化，室温静止10min；

S23、将步骤S222所得12000g4℃离心15min，吸取500ul上清液至另一 新的1.5mlEP管中，加入500ul异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃静置30min； 12000g4℃离心10min，弃去上清，加入1ml75％的乙醇，颠倒混匀；

S24、将步骤S23所得溶液12000g4℃离心5min，弃去乙醇，室温干燥沉 淀2-5min，加入20ulDEPC水，溶解RNA沉淀，待沉淀完全溶解后，-70保存 核酸或立即进行反转录。

步骤三、RT-PCR方法的建立

采用20ul的体系进行AstcDNA合成。在200ul的PCR反应管中按表2 反转录体系加入溶液及试剂，混合后瞬时离心，置42℃水浴1h，之后70℃ 10min灭活反转录酶，-20℃保存备用。采取25ul的反应体系进行PCR扩增， 分别对引物浓度、退火温度、dNTP浓度、rTaqDNA聚合酶浓度进行优化，确 定病毒的PCR最佳反应条件。

表2反转录反应体系(20ul)

按照上述的试验方法分别提取水貂犬瘟热阳性病料的RNA，水貂细小病毒 阳性病料的DNA，猪流行性腹泻阳性病料的RNA，利用建立的反转录(RT)和PCR 扩增方法分别对RNA和DNA进行目的基因的扩增，验证引物的特异性。

用紫外分光光度计测定提取的水貂的核酸浓度。进行10^-1-10^-8系列稀释， 按建立的RT-PCR方法进行扩增，电泳观察结果，确定反应的敏感性。

按已经优化的RT-PCR反应的最佳条件对MiAstV进行RT-PCR扩增，重复 4次，已验证结果的可靠性。

步骤四、利用建立的RT-PCR方法对120份水貂腹泻临床样本进行了检测。

通过反复多次对反转录及PCR反应过程中的退火温度、延伸时间、循环次 数等条件的优化，确定了AstPCR最佳反应体系(见表3，)最佳扩增条件：95℃ 预变性5min，94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸90s，共35个循环， 72℃终延伸10min。PCR产物送北京六和华大基因科技股份有限公司测序， 结果与GenBank发表的MiAstV基因序列的同源性在100％。

表3MiAstVPCR反应体系：(25ul)

MiAstVRT-PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验结果

采用优化的RT-PCR反应的最佳条件进行PCR扩增MiAstV，重复4次，结 果在295bp处，均得到了清晰可见的目的条带(见图3)。对提取的水貂星状 病毒，水貂细小病毒，水貂犬瘟热病毒，猪流行性腹泻病毒的RNA进行反转 录(RT)和PCR扩增。结果与试验设计相符的295bp的特异性目的片段，未见 非特异性扩增，而从水貂细小病毒，水貂犬瘟热病毒，猪流行性腹泻病毒中均 未扩增出条带(见图4)。在上述优化条件下，该RT-PCR检测方法最低能检测 到经10^-5稀释的水貂星状病毒的RNA，其灵敏度为1.35ng/ul(图5)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。