一种检测复烤烟品种混杂的方法

摘要

本发明涉及一种检测复烤烟品种混杂的方法。其技术方案是包括以下步骤：（1）复烤烟DNA的提取：（2）引物合成：（3）简单重复序列间多态性-聚合酶链式反应：用ISSR引物826或者ISSR引物856在待检测的复烤烟中进行ISSR-PCR；（4）比对标准图谱：将待检测的复烤烟ISSR-PCR电泳后的成像照片与标准指纹图谱进行条带比对，如果条带能够吻合即为相应的品种之一，如果不能吻合即为混杂品种，检测完毕。有益效果是：为复烤烟的鉴定与检测提供了方法，在其它复烤烟的实验过程中可以直接参考本实验所筛选得到的引物和相应的退火温度直接进行ISSR-PCR反应，进而得到相应品种的指纹图谱作为后续比对的标准谱带。

说明书

技术领域

本发明涉及一种复烤烟的检测方法，特别涉及一种检测复烤烟品种混杂的方法。

背景技术

烤烟就是将植物进行第一次加工后的原材料，复烤烟就是把烟叶从农产品整理加工成工业原料的准备性过程，是烟叶调制后的又一次干燥所以称为复烤。在烟叶复烤加工的过程中要将霉变和不符合等级的烟叶剔除掉以保证复烤烟的质量。在加热干燥的同时能够将烟叶的害虫杀死，复烤过的烟叶水分的含量很低利于长期贮存醇化或者人工发酵。打叶复烤是为卷烟企业提供优质原料的关键环节。目前，烟厂向农户收购的是复烤烟。而复烤烟在一系列加工过程中，品种间的外观品质差异缩小，为了保证后续香烟的品质，亟待科学的检测方法。

例如：在云南地区，由于烤烟的大量调出及品种的单一、老化，造成云产卷烟品牌与省外品牌在产品风格上出现同质化，使得云产卷烟的原料优势正逐渐消失。红云红河集团原料差异化项目的实施，就是从新品种选育和国外品种引进两方面着手，一定程度上改善了这种状况，由于不同烟叶品种在卷烟配方中所起作用不同，因而需要对烟叶品种进行鉴别。到目前为止，对于烟叶品种间差异性的鉴定，仅依据烟叶外观质量进行评价，在烟叶生产、收购、复烤、仓储过程中，并未形成一套科学的跟踪监测体系，导致品种混杂、错标等现象，严重影响了云产卷烟产品质量和风格的稳定性，如：红花大金元、云87、NC297、NC102、K326等五种云产品牌卷烟主体烟叶原料复烤烟。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术存在的上述缺陷，提供一种检测复烤烟品种混杂的方法，本发明利用ISSR分子标记技术对几种复烤烟进行指纹图谱的构建，有利于区分出不同复烤烟，构建5个复烤烟品种的DNA指纹图谱数据库；为建立复烤烟纯度及真实性鉴定技术体系和技术规范奠定基础，为今后烟草业的研究及发展提供可靠的依据。

本发明提到的一种检测复烤烟品种混杂的方法，其技术方案是包括以下步骤：

（1）复烤烟DNA的提取：用DNeasykit试剂盒提取DNA后在1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，并用分光光度计检测DNA提取纯度及浓度；

（2）引物合成：合成ISSR引物826和ISSR引物856，其中，ISSR引物826的引物序列：ACACACACACACACACC；ISSR引物856的引物序列：ACACACACACACACACYA，合成后，用ddH2O将引物溶解；

（3）简单重复序列间多态性-聚合酶链式反应，英文缩写为ISSR-PCR：

用ISSR引物826或者ISSR引物856在待检测的复烤烟中进行ISSR-PCR；

（4）比对标准图谱：

将待检测的复烤烟ISSR-PCR电泳后的成像照片与标准指纹图谱进行条带比对，如果条带能够吻合即为相应的品种之一，如果不能吻合即为混杂品种，检测完毕。

其中，步骤（1）复烤烟DNA的提取的具体步骤如下：

（a）取复烤烟样品用剪刀剪碎后放在研钵里，加入10mL液氮研磨，期间再加一次10mL液氮，继续研磨直至粉末状，用离心管取100mg；

（b）在上述离心管中加入400μL缓冲液AP1和4μLRNaseA，漩涡并放置在65℃的水浴锅里水浴10min，水浴的期间漩涡2-3次；

（c）加入130μL缓冲液AP2，混匀，冰浴5min；

（d）将溶解产物于离心机离心20000g，按照14000rpm，5min；

（e）转移溶解产物到QIAshredder柱子上，并放在2mL收集管上，20000g离心2min；

（f）转移底液到新的离心管内，不要碰到底部的残留物，加1.5倍体积的缓冲液AP3/E并且混匀；

（g）转移650μL混合物到DNeasyMini柱子上，柱子放置在2mL收集管中，6000g，8000rpm，离心1min；

（h）把这个柱子放置在一个新的2mL的收集管上，加500μL缓冲液AW，6000g离心1min，丢弃底液；

（i）再加500μL缓冲液AW，20000g离心2min；转移柱子到一个新的1.5mL的离心管上；

（j）加100μL缓冲液AE洗脱，室温（15-25℃）放置5min，6000g离心1min。

上述的1.0%琼脂糖凝胶的制备方法是：称取琼脂糖0.4g，加40mL1×TAE缓冲液，微波炉加热2min至琼脂糖完全融化，稍微冷却，用移液枪取2.0%的核酸染料GoldView混匀，倾倒于含有胶梳的模具中，至琼脂糖胶完全凝固后取下胶梳备用；

其中，TAE缓冲液是指：1000mL中含242gTris碱，57.1mL冰乙酸和100mL的0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）pH8.0。

优选的，步骤（1）中用分光光度计检测DNA提取纯度及浓度的方法中：

OD260/OD280比值在1.6~1.8之间、OD260/OD230比值大于2即认为DNA纯度较高，可以用于后续实验，根据分光光度计显示浓度，将DNA稀释至50-100ng/μL待用。

优选的，步骤（3）中的简单重复序列间多态性-聚合酶链式反应包括以下：

PCR反应液体系为50μL，其中包含5μL10×PCRbuffer，5μLdNTPs，0.5μLISSR引物，0.5μLTaqDNA聚合酶，1μL总DNA，不足的体积用ddH₂O补足；反应液用矿物油覆盖，在PCR仪上进行扩增；

PCR程序为94℃预变性3min，然后进入下述PCR循环：94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸90s，40个循环；循环结束后72℃延伸10min；扩增产物在1×TAE缓冲系统下用2.0%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳分离，电泳电压100V电泳50min。电泳完毕后在UVP凝胶成像系统上照像并保存。

2.0%琼脂糖凝胶的制备方法是：

称取琼脂糖0.8g，加40mL1×TAE缓冲液，微波炉加热2min左右至琼脂糖完全融化，稍微冷却，用移液枪取2.0%的核酸染料GoldView混匀，倾倒于含有胶梳的模具中，至琼脂糖胶完全凝固后取下胶梳备用；

其中，TAE缓冲液是指1000mL中含242gTris碱，57.1mL冰乙酸和100mL的0.5mol/L乙二胺四乙酸。

本发明的有益效果是：不同卷烟品牌对烟叶的质量风格有不同要求，揭示特定烟区烟叶质量风格特色对实现品牌导向型烟叶生产具有十分重要的意义。烤烟在从工业化到商业化的过程中，品种间会出现混杂现象，本研究建立的红花大金元、云87、NC297、NC102、K326等云产品牌卷烟主体烟叶原料复烤烟品种的ISSR指纹图谱，避免了盲目选取ISSR标记构建复烤烟指纹图谱，提高了筛选效率；

该方法是用分子生物学手段进行的科学检测，所用仪器主要有PCR仪器、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统等分子生物学常规仪器，所用药品为DNA提取试剂盒、PCR相关药品及琼脂糖等分子生物学常规药品，方法简便易行，具有可以操作性；

此外，本实验还为其它复烤烟的鉴定与检测提供了方法，在其它复烤烟的实验过程中可以直接参考本实验所筛选得到的引物和相应的退火温度直接进行ISSR-PCR反应，进而得到相应品种的指纹图谱作为后续比对的标准谱带。

附图说明

附图1是5个复烤烟样品的DNA电泳检测示意图；

图1中：泳道M为分子量标准DL2000，从上至下的条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1-5：红花大金元、云87、NC297、NC102、K326的DNA。

附图2是引物826的标准指纹图谱照片；

附图3是引物826的标准指纹图谱手绘图；

图2和3中：泳道M为分子量标准DL2000，从上至下的条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1-5分别为红花大金元、云87、NC297、NC102、K326。

附图4是引物856的标准指纹图谱照片；

附图5是引物856的标准指纹图谱手绘图；

图4和5中：泳道M为分子量标准DL2000，从上至下的条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1-5分别为红花大金元、云87、NC297、NC102、K326。

具体实施方式

本发明提到的一种检测复烤烟品种混杂的方法，包括以下步骤：

（1）复烤烟DNA的提取：用DNeasykit试剂盒提取DNA后在1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，并用分光光度计检测DNA提取纯度及浓度；其中，DNeasykit试剂盒是产自德国的QIAGEN公司的市售产品；

（2）引物合成：合成ISSR引物826和ISSR引物856，其中，ISSR引物826的引物序列：ACACACACACACACACC；ISSR引物856的引物序列：ACACACACACACACACYA，合成后，用ddH2O将引物溶解；

（3）简单重复序列间多态性-聚合酶链式反应，英文缩写为ISSR-PCR：

用ISSR引物826或者ISSR引物856在待检测的复烤烟中进行ISSR-PCR；

（4）比对标准图谱：

将待检测的复烤烟ISSR-PCR电泳后的成像照片与标准指纹图谱进行条带比对，如果条带能够吻合即为相应的品种之一，如果不能吻合即为混杂品种，检测完毕。

其中，步骤（1）复烤烟DNA的提取的具体步骤如下：

（a）取复烤烟样品用剪刀剪碎后放在研钵里，加入10mL液氮研磨，期间再加一次10mL液氮，继续研磨直至粉末状，用离心管取100mg；

（b）在上述离心管中加入400μL缓冲液AP1和4μLRNaseA，漩涡并放置在65℃的水浴锅里水浴10min，水浴的期间漩涡2-3次；

（c）加入130μL缓冲液AP2，混匀，冰浴5min；

（d）将溶解产物于离心机离心20000g，按照14000rpm，5min；

（e）转移溶解产物到QIAshredder柱子上，并放在2mL收集管上，20000g离心2min；

（f）转移底液到新的离心管内，不要碰到底部的残留物，加1.5倍体积的缓冲液AP3/E并且混匀；

（g）转移650μL混合物到DNeasyMini柱子上，柱子放置在2mL收集管中，6000g，8000rpm，离心1min；

（h）把这个柱子放置在一个新的2mL的收集管上，加500μL缓冲液AW，6000g离心1min，丢弃底液；

（i）再加500μL缓冲液AW，20000g离心2min；转移柱子到一个新的1.5mL的离心管上；

（j）加100μL缓冲液AE洗脱，室温（15-25℃）放置5min，6000g离心1min；

注：上述缓冲液AP1、AP2、缓冲液AP3/E、缓冲液AW、缓冲液AE、RNaseA、QIAshredder柱子、DNeasyMini柱子等均为购买的DNeasykit（德国，QIAGEN公司）试剂盒中的现有市售药品名称。

上述的1.0%琼脂糖凝胶的制备方法是：称取琼脂糖0.4g，加40mL1×TAE缓冲液，微波炉加热2min至琼脂糖完全融化，稍微冷却，用移液枪取2.0%的核酸染料GoldView混匀，倾倒于含有胶梳的模具中，至琼脂糖胶完全凝固后取下胶梳备用；

其中，TAE缓冲液是指：1000mL中含242gTris碱，57.1mL冰乙酸和100mL的0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）pH8.0。

其中，步骤（1）中用分光光度计检测DNA提取纯度及浓度的方法中：

OD260/OD280比值在1.6~1.8之间、OD260/OD230比值大于2即认为DNA纯度较高，可以用于后续实验，根据分光光度计显示浓度，将DNA稀释至50-100ng/μL待用。

步骤（3）中的简单重复序列间多态性-聚合酶链式反应包括以下：

PCR反应液体系为50μL，其中包含5μL10×PCRbuffer，5μLdNTPs，0.5μLISSR引物，0.5μLTaqDNA聚合酶，1μL总DNA，不足的体积用ddH₂O补足；反应液用矿物油覆盖，在PCR仪上进行扩增；其中，反应液用适量矿物油（SIGEMA，美国公司）覆盖，在PCR仪（德国，Eppendorf）上进行扩增。10×PCRbuffer、dNTPs、TaqDNA聚合酶等PCR试剂购自生物公司，为市售产品。

PCR程序为94℃预变性3min，然后进入下述PCR循环：94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸90s，40个循环；循环结束后72℃延伸10min；扩增产物在1×TAE缓冲系统下用2.0%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳分离，电泳电压100V电泳50min。电泳完毕后在UVP凝胶成像系统上照像并保存。

其中，2.0%琼脂糖凝胶的制备方法是：

称取琼脂糖（BIOWEST，西班牙）0.8g，加40mL1×TAE（1000mL中含242gTris碱，57.1mL冰乙酸和100mL的0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）pH8.0）缓冲液，微波炉加热2min左右至琼脂糖完全融化，稍微冷却，用移液枪取2.0%的核酸染料GoldView混匀，倾倒于含有胶梳的模具中，至琼脂糖胶完全凝固后取下胶梳备用。

参照图2和图3，其中，图3的手绘图是在图2的基础上1:1做出来的，目的是为了待考察材料进行比对方便的。

引物826在红花大金元、云87、NC297、NC102、K326中均有特征条带（图3和图4），能够区分5个供试品种，从而建立了相应的DNA指纹图谱。在250~1000bp，共读得6个水平的PCR条带，将6个水平的条带按照由大到小的顺序依次命名为M1~M6。其中，M1、M2、M4处分别只有NC102、NC297、云87有唯一条带，即M1、M2、M4可将NC102、NC297、云87从5个供试品种中区分出来；K326和红花大金元则可通过M5处的条带进行区分。若将有带读为1、无带读为0，红花大金元、云87、NC297、NC102、K326读带的数字代号分别001011、100001、011001、001110、001001。

引物856在红花大金元、云87、NC297、NC102、K326中均有特征条带（图4和图5），能够区分5个供试品种，从而建立了相应的DNA指纹图谱。在750~2000bp，共读得5个水平的PCR条带，将5个水平的条带按照由大到小的顺序依次命名为N1-N5。其中，N1、N2、N4处分别只有红花大金元、云87、NC297有唯一条带，因此N1、N2、N4可将红花大金元、云87、NC297从5个供试品种中区分出来；K326和NC102可以通过M5处的条带有无进行区分。若将有带读为1、无带读为0，红花大金元、云87、NC297、NC102、K326读带的数字代号分别为11000、00100、00011、00000、00001。

以上所述，仅是本发明的部分较佳实施例，任何熟悉本领域的技术人员均可能利用上述阐述的技术方案加以修改或将其修改为等同的技术方案。因此，依据本发明的技术方案所进行的任何简单修改或等同置换，尽属于本发明要求保护的范围。