一种土壤抗生素污染对人体健康影响的评估方法

摘要

本发明公开了一种土壤抗生素污染对人体健康影响的评估方法，包括以下步骤：(1)将小白菜种子放置到抗生素污染的土壤中培养，培养至小白菜长出可食用部分；(2)利用体外消化法处理小白菜可食用部分得到消化产物；(3)将肝细胞接种到含有消化产物的培养基中培养，取上清液检测谷丙转氨酶的活性；(4)根据所述谷丙转氨酶的活性，评估土壤抗生素污染对人体健康影响。本发明采用体外消化法结合细胞毒性检测的方法，检测小白菜中残留的抗生素对肝细胞ALT活性的影响，进而评估土壤中抗生素污染对人体健康的影响，填补了在通过食物链研究抗生素对人体健康方面影响的空白。

说明书

技术领域

本发明涉及污染环境检测与健康评估领域，具体涉及一种土壤抗生素污染对人体健康影 响的评估方法。

背景技术

随着畜禽养殖业和饲料工业的规模化发展，抗生素被广泛使用。但是绝大部分抗生素不 能完全被机体吸收，以原形或者代谢物形式排入环境，经不同途径对水体和土壤造成污染， 进而通过食物链危害人类健康。四环素类抗生素是在世界范围内应用最为广泛的抗生素，四 环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括土霉素、金霉素、四环素及半合成衍 生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等，其结构均含有并四苯基本骨架。近年来土 霉素被广泛应用于畜禽的生长，导致其药物残留问题日趋严重，排放到环境中的药物及其潜 在的影响也引起越来越多的关注。

目前对抗生素的生态健康风险的研究较少，可利用的生态毒理效应数据也较少，对于进 入食物链中的抗生素对人体危害的风险还不是十分清楚。因此，控制和检测抗生素残留，研 究抗生素污染的生态毒理效应是非常必要的。

申请号为201410764095.4的专利文献公开了一种土壤抗生素污染的诊断方法，包括以下 步骤：(1)将肝细胞接种到一组抗生素浓度呈梯度分布的培养基中培养，培养一段时间后检测 培养基中肝细胞分泌的酶的活性；(2)建立培养基中抗生素浓度与所述酶的活性之间的关系曲 线；(3)将肝细胞接种到含待测土壤浸提液的培养基中培养，培养一段时间后检测相应酶的活 性，根据关系曲线计算得到待测土壤中抗生素的浓度；所述酶为乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶或 丙氨酸氨基转移酶。利用该方法不仅能检测土壤中抗生素的浓度，又能反映土壤中抗生素的 生物毒性。

目前，抗生素污染的诊断方法都是基于土壤安全阈值进行的，而对于评价作物可食用部 位的抗生素的检测方法相对较少。生物标志物法是诊断污染物污染程度和评估健康风险的一 种有效手段，由于快速、灵敏等优点，体外细胞通常用来研究污染物的生物有效性与毒性， 且与体内细胞有一定的相关性，从而明确污染物对健康的相对危害情况，因此体外细胞毒性 指标可以被用来评估土壤-作物可食用部的食物链系统抗生素污染带来的生态风险。目前利用 生物标志物法研究土壤-农作物系统抗生素污染方面还是空白。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种土壤抗生素污染对人体健康影响 的评估方法，通过检测谷丙转氨酶的活性评估土壤抗生素污染对人体健康影响。

一种土壤抗生素污染对人体健康影响的评估方法，包括以下步骤：

(1)将小白菜种子放置到抗生素污染的土壤中培养，培养至小白菜长出可食用部分；

(2)利用体外消化法处理小白菜可食用部分得到消化产物；

(3)将肝细胞接种到含有消化产物的培养基中培养，取上清液检测谷丙转氨酶的活性；

(4)根据所述谷丙转氨酶的活性，评估土壤抗生素污染对人体健康影响。

现有研究证明环境中抗生素污染通过食物链进入人体进而危害人体健康，蔬菜作为人们 日常饮食中必不可少的食物之一，本发明通过检测蔬菜中抗生素对人体的影响，进而评估土 壤抗生素污染对人体健康的影响。小白菜为蔬菜指示作物品种，是一类主要以鲜嫩的绿叶、 叶柄和嫩茎为产品的速生蔬菜，具有生长期短，采收灵活的特点，故本发明采用小白菜。

肝脏是人体最大的解毒器官，90％的抗生素需要肝脏代谢解毒，然后排出体外。当抗生 素浓度超过肝脏的解毒能力时，就会出现肝损害，主要临床表现为转氨酶升高。发明人在研 究中发现四环素和青霉素浓度的增加导致体外细胞培养上清液中LDH、AKP和ALT的活性 增加，其中ALT的活性对于抗生素浓度变化反应更为敏感(申请号为201410764095.4的专利 文献)。

谷丙转氨酶活性测定常用方法为赖氏(R-F)法和速率法，本发明选用赖氏比色法检测，对 于人体肝细胞而言，ALT位于肝细胞浆中，较轻的损伤肝细胞膜，使其通透性增加，ALT都 能从肝细胞中渗出，它的增加说明了肝细胞产生了一定的损伤，肝细胞出现异常，进而说明 可以对人体健康造成一定的危害。

因此，本发明采用检测肝细胞分泌的谷丙转氨酶活性来评估抗生素污染对人体健康的影 响，检测得到的谷丙转氨酶活性数值越高表明土壤中抗生素污染对人体健康影响越严重。

所述小白菜的品种为早熟8号。该品种具有抗病性强，结球性好，商品性好，品质佳， 产量高的优点。由于该小白菜性质稳定，能够准确反应土壤中抗生素进入食物链的情况，而 且因为它生长周期短，可以节省人工成本。

所述抗生素为四环素类抗生素。四环素类抗生素是在世界范围内应用最为广泛的抗生素， 在土壤污染中具备代表性。发明人在研究中发现四环素类抗生素浓度与肝细胞分泌的酶活性 指标有显著的正相关性和线性回归关系。更为优选的，所述抗生素为土霉素。

步骤(1)中，小白菜种子放入土壤培养之前进行消毒处理。小白菜种子种入土壤之前先进 行消毒，有效提高后期小白菜的成活率，保证本发明评估结果的一致性。优选的，所述消毒 处理为小白菜种子用浓度为0.1～0.3％高锰酸钾溶液浸泡0.5～1h。高锰酸钾作为强氧化剂，有 杀灭细菌作用，其杀菌力极强，而且高锰酸钾溶液配制简单，方便操作，需随配随用。

步骤(1)中，小白菜的培养时间不少于15天。将预处理后的小白菜种子均匀放入铺有待检 土壤的培养皿中，放入20～25℃培养箱，避光培养，期间添加去离子水保持土壤湿润。培养 3～5d后，转入人工气候室培养15天以上收获，期间每天添加去离子水，人工气候室培养条 件为：白天温度22～25℃，夜间温度20～23℃，光照/黑暗时间14h/10h。

所述肝细胞为人体肝细胞HL-7702。采用人体肝细胞HL-7702的酶的活性作为检测抗生 素的指标，可以评估抗生素对人体的毒性。

所述培养基为无血清的DEME培养基。本发明检测的是谷丙转氨酶的活性，为了避免培 养基对检测的影响，选择无血清的DEME培养基。

肝细胞的接种密度约为4×10⁵～6×10⁵个/mL。细胞培养最好保证单层，细胞数目过多或 过少会造成较大的误差。更为优选的，肝细胞的接种密度约为4×10⁵个/mL。

步骤(3)中，培养基中消化产物的含量为10％～20％。单纯的消化液会导致细胞培养环境改 变而死亡，用DMEM培养基稀释是为了保持与之前的培养环境一致，避免细胞因环境改变过 大而死亡。更为优选的，培养基中消化产物的含量为10％。

步骤(3)中，细胞培养的时间不少于2小时。

与现有技术相比，本发明具备的有益效果：本发明采用体外消化法结合细胞毒性检测的 方法，检测小白菜中残留的抗生素对肝细胞ALT活性的影响，进而评估土壤中抗生素污染对 人体健康的影响，填补了在通过食物链研究抗生素对人体健康方面影响的空白。

附图说明

图1为谷丙转氨酶活性的检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

1、白菜育苗

供试土壤类型为青紫泥(属于水稻土土类)。青紫泥分别采自浙江省嘉兴农科院试验田的 表层土壤(0～30cm)。有效磷为23.7mg·kg^-1，有效钾为265mg·kg^-1，碱解氮146.0mg·kg^-1， pH为6.21。土样在试验前经风干、混匀、过5mm土筛。供试白菜品种早熟8号(浙江省农科 院蔬菜研究所)。试验前种子用0.3％高锰酸钾消毒30min，然后用去离子冲洗3次待用。

土壤试验方法采用保湿培养进行试验，在洁净烘干的直径9cm培养皿中平铺一层滤纸， 加入约0.5cm厚、过5mm土筛的土壤(每皿约60g)，加入16mL含一定含量抗生素的去离 子水，使土壤抗生素浓度分别为0，12，18，24mg·kg^-1。平衡2h后，用镊子将预处理后的 种子均匀放入培养皿，保持种子胚根末端与生长方向呈垂直，每皿放置25颗种子。盖好培养 皿，将其放置在25℃培养箱，避光培养，期间必要时添加去离子水，保持土壤湿润。培养3d 后，转入人工气候室培养至15d收获，期间每天添加去离子水，人工气候室培养条件为：白 天/夜间温度25℃/23℃，光照/黑暗时间14h/10h。

2、小白菜中土霉素污染对人肝细胞(HL-7702)毒性检测方法建立

2.1体外消化法建立

具体步骤如下：将处理15d的白菜洗净，称取鲜重为1g，弱光下冰浴研磨后用15mL 混合溶液(包含140mMNaCl和5mMKCl)冲洗加入到50ml离心管中，混匀后用6MHCl调 整pH＝2.0，对于模拟胃消化，加入0.5mL胃蛋白酶(0.2g胃蛋白酶加入5ml0.1MHCl)后37℃ 水浴并震荡32.5h；对于模拟肠消化，将模拟胃消化好的消化液用1MNaHCO₃调至pH＝5， 然后加入2.5mL的胰酶-胆汁液后37℃水浴并震荡2h；然后冰浴10min终止肠消化。用0.5 MNaOH调整pH＝7.2，为了抑制蛋白酶则需要肠消化液100℃水浴4min，然后消化液用冰冷 却，于4℃3500g离心1h，取上清液过0.22μm的滤膜后用于细胞试验。

2.2体外消化液对人肝细胞(HL-7702)毒性检测

1)细胞计数

取洁净干燥的血球计数板，用移液枪吸取10μL稀释好的细胞(人肝细胞(HL-7702))悬液， 滴加在计数区上，然后盖上盖玻片(勿使产生气泡)。静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不 再随液体漂移。显微镜下观察，统计所有计数区的细胞总数。对于沉降在格线上的细胞的统 计按照数上线不数下线，数左线不数右线的原则技术，以减少误差，然后按照下述公式计算 细胞密度：细胞密度(个/mL)＝细胞总数/4×10⁴×稀释倍数。

2)谷丙转氨酶活性的检测

取对数生长期的HL-7702细胞，用0.25％胰酶消化，制成4×10⁵个/mL单细胞悬液，用 含胎牛血清的DMEM培养基培养，每孔1mL，接种于6孔板，置37℃，5％CO₂培养箱过 夜培养24h，待细胞贴壁后弃去培养上清液，设对照组和土霉素组，每孔加入稀释10倍的消 化液(1:9＝消化液：DMEM)，培养箱中培养2h后，取上清培养液，采用南京建成试剂盒测定 谷丙转氨酶(ALT)的活性。

试验结果：经白菜体外消化液处理人正常肝细胞HL-7702后，由图1可以看出，当土壤 土霉素浓度在0-24mg·kg^-1范围时，随着其浓度的增加，对应的消化液处理HL-7702细胞后 培养液中ALT的活性也呈现逐渐增加的趋势。说明肝功能指标ALT对白菜中土霉素的污染 的作用较为敏感，且ALT是药物肝损伤的敏感指标，当土壤土霉素浓度≥12mg·kg^-1时，白菜 中的土霉素污染对人肝细胞产生一定的损伤作用。因此可以利用体外人肝细胞诊断土壤-白菜 系统中抗生素污染的情况，来预测评估土霉素对人体健康的风险情况。