草鱼多聚免疫球蛋白受体pIgR基因全长cDNA及其克隆方法与应用

摘要

本发明涉及一种草鱼多聚免疫球蛋白受体pIgR基因cDNA全长及其克隆方法与应用。本发明草鱼多聚免疫球蛋白受体pIgR基因cDNA全长，其特征在于：所述的基因Genbank登录号为：KP768418，它包含一个1011bp的开放阅读框，编码336个氨基酸，存在主要结合位点CWDC，在功能区存在独特且保守的结合位点KxWC和DxGxYxC及保守的半胱氨酸残基，5’UTR为68bp，3’UTR为561bp，其中包含一个终止密码子，多聚腺甘酸加尾信号。本发明pIgR基因cDNA克隆方便，生物材料易得，可以用来进行鱼类疾病的预防和疫苗使用效果的评价，对水产养殖具有重要理论和现实意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因及其克隆方法与应用，具体讲是草鱼(Ctenopharyngodonidellus)多聚免疫球蛋白受体(polymericimmunoglobulinreceptor，pIgR)基因全长cDNA及其克隆方法与应用，属于鱼类分子免疫学技术领域。

背景技术

覆盖在鱼体皮肤、鳃和胃肠道等表面的黏膜样淋巴组织及其分泌的黏液，构成了鱼类的黏膜免疫系统，是机体抵抗病原入侵的第一道防线。鱼类黏膜组织中分布有淋巴细胞、巨噬细胞和各类粒细胞，使其具有独立完成局部免疫应答的功能。黏液中除含有溶菌酶和补体等非特异性的免疫成分外，还含有特异性抗体，在免疫保护过程中起着极其重要的作用。

pIgR是由黏膜上皮细胞合成，是重要的免疫因子，能够与分泌型的免疫球蛋白(Ig)多聚体结合，介导其跨过上皮细胞进行转运和分泌，进而保证分泌型免疫球蛋白在黏膜防御屏障中发挥局部清除病原体及毒素的作用，因此，pIgR的有效分泌是保证分泌型免疫球蛋白发挥黏膜防御功能的必要条件。目前研究表明，pIgR基因已在人类、哺乳动物(牛、鼠等)、鸟类和两栖类中克隆较多，在硬骨鱼中仅有几种鱼类得到克隆。克隆草鱼pIgR基因，可通过基因工程方式构建原核或真核基因工程菌株，高效表达具生理活性的重组蛋白，分析pIgR与Ig的结合活性，进而为鱼类黏液Ig的转运提供直接证据。

发明内容

本发明的目的是提供草鱼pIgR基因全长cDNA及其编码蛋白；本发明的另一个目的是提供一种草鱼pIgR基因全长cDNA克隆方法。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：草鱼多聚免疫球蛋白受体pIgR基因cDNA全长，已提交Genbank，登录号：KP768418。草鱼pIgRcDNA全长1640bp，包含一个1011bp的开放阅读框(ORF)，编码336个氨基酸，存在主要结合位点CWDC，在功能区存在独特且保守的结合位点KxWC和DxGxYxC(x表示其他氨基酸)及保守的半胱氨酸残基，5’UTR(非编码区)为68bp，3’UTR为561bp，其中包含一个终止密码子，多聚腺甘酸加尾信号(PolyadenylationSignalSite)(AATAAA)。

一种所述草鱼pIgR基因cDNA全长克隆方法，包括如下步骤：

提取草鱼肝组织总RNA，合成cDNA第一链；设计简并引物对草鱼cDNA第一链进行扩增，得到草鱼pIgR核心序列；设计3’RACE特异性引物和5’RACE特异性引物，分别进行3’RACE扩增和5’RACE扩增，将扩增得到的目的片段进行分析、测序；用Bioedit软件将所得到的核心序列、3’端和5’端序列进行拼接，得到pIgR基因的cDNA全长序列，共1640bp。

所述的设计简并引物，是根据3个与草鱼亲缘关系较近的鱼类pIgR氨基酸(AA)序列，得到保守区后，从BlockMakerResults网页直接登录CODEHOP数据库在线进行引物的设计，并结合Primerpremier5.0和DNAMAN等生物软件进行简并引物的筛选，进而确定简并引物。

所述的3’RACE扩增和5’RACE扩增是根据所得到的草鱼pIgR基因的核心序列，利用PrimerPremier5.0设计基因特异性引物。在第一链cDNA3’端加上CDS接头引物，5’端以末端转移酶(TdT)为cDNA加尾，以此作为模板，利用RACE技术对目的基因的3’和5’末端进行PCR扩增。

所述的将扩增得到的目的片段进行分析是将PCR产物在含1％的琼脂糖凝胶上进行检测，经检测含有目的片段后利用DNA回收试剂盒进行回收；回收的特异性目的片段连接入pMD18-TVector，转化进大肠杆菌DH5α内，在氨苄青霉素平板上涂布，挑取平板上的单菌落以载体通用引物(PrimerRV-M和PrimerM13-47)进行PCR检测，经检测正确后，摇菌并测序。

本发明的制备技术路线设计新颖，其通过CODEHOP法结合Primerpremier5.0及DNAMAN设计的简并引物降低了引物简并度，提高了引物退火温度，特异性强，实验成功率高；利用RACE技术扩增基因避免了进行大量的筛选克隆，所得到的目的片段再经切胶回收、连接转化、氨苄抗性筛选、菌落PCR筛选验证其准确性，这样的制备技术路线严密合理且可行，充分发挥了现有分子克隆方法的作用和效果。

草鱼pIgR基因cDNA全长的获得，填补了国内外研究草鱼pIgR的空白，为研究鱼类黏液Ig的转运提供直接证据；同时利用克隆获得的pIgR基因，分析抗原分子诱导后草鱼pIgR的应答表达变化与抗原的对应关系，本发明pIgR基因cDNA克隆方便，生物材料易得，可以用来进行鱼类疾病的预防和疫苗使用效果的评价，对水产养殖具有重要理论和现实意义。

附图说明

图1为本发明的草鱼肝组织总RNA电泳结果图。

图2为本发明的草鱼pIgR基因cDNA全长扩增中的琼脂糖电泳结果图。

图3为本发明的草鱼pIgR基因cDNA及推导的氨基酸序列图。

图4为本发明的草鱼pIgR蛋白结构示意图。

图5为草鱼pIgR与其他脊椎动物pIgR的多序列比对。

图6为本发明的草鱼不同组织内pIgR和Actin基因RT-PCR扩增产物电泳分析图。

图7为本发明的草鱼各组织内pIgR在免疫刺激后的时空表达分析图。

参见图1-图6：

图1所示：M是DL2000DNAMarker；1表示草鱼肝组织总RNA提取结果。

图2所示：A为pIgR中间保守区扩增结果；B为pIgR的3’RACE产物；C为pIgR的5’RACE产物。其中M为DL2000DNAMarker；1为PCR扩增产物。

图3所示3’-UTR多聚腺苷酸信号，下划线表示2个ILDs，阴影表示跨膜区。

图4所示：深黑色：跨膜区；Ig：Ig-like区域。

图5所示：“*”代表相同的氨基酸；“:”代表相似的氨基酸；阴影表示结合位点；粗斜字体表示哺乳类、鸟类及两栖类的CDRs(CDR1、CDR2、CDR3)，斜字体表示保守的Cys残基。

图6所示：1为皮肤；2为肌肉；3为肠；4为肝；5为胃；6为头肾；7为鳃；8为脾。

图7所示：A为皮肤；B为鳃；C为肠；D为肝；E为胃；F为脾；G为头肾。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例进一步说明本发明。

实施例1：草鱼多聚免疫球蛋白受体pIgR基因cDNA全长的克隆。

解剖取草鱼肝30mg，使用Trizol法提取总RNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，紫外分光光度计测定浓度和纯度(结果如图1所示)。取2μL总RNA(1μg/μL)与2μLOligodT(0.5μg/μL)混合，经RT-PCR合成cDNA第一链。

首先从NCBI数据库上搜索并从中找出3个与草鱼亲缘关系较近的鱼类pIgR氨基酸(AA)序列，分别为鲤鱼Cyprinuscarpio(GenBank登录号：ADB97624)、斑马鱼Daniorerio(GenBank登录号：ABQ10652)、大西洋鲑(GenBank登录号：ACX44838)，将上述3种鱼类pIgR氨基酸序列保存为FASTA格式，并提交至BlockMaker网站，得到保守区后，从BlockMakerResults网页直接登录CODEHOP数据库在线进行引物的设计。设计引物的主要参数设置为：Degeneracy：128；Temperature：60.0℃；Geneticcode：standard；Codonusagetable：Daniorerio。引物密码表中没有草鱼选项，因此选择进化地位较近的模式生物D.rerio。

首先根据简并引物设计的普遍原则和引物退火温度值，先筛选出分值较高的引物，尽量选择分数大于75分的引物。再根据简并引物在氨基酸序列保守区内的位置，筛选出简并度较低的引物，再在3种鱼中选出其中一条鱼(与要克隆的物种亲缘关系尽量相近)，采用DNAMAN查看筛选出的简并引物在其mRNA模板中的位置，并分析简并引物与模板mRNA的匹配程度，选取匹配程度较高的引物，最后再利用Primerpremier5.0进行简并引物自身的检测：(1)分析两条上下游简并引物自身是否存在发夹结构；(2)上游简并引物与下游简并引物之间是否存在二聚体；(3)两条简并引物的Tm值不要相差太大，尽量不要超过5℃。

选取草鱼肝组织进行总RNA提取。RNA提取步骤按照Trizol试剂盒说明书进行，操作过程中注意RNA酶污染。反转录过程按照cDNA第一链合成试剂盒说明书进行，再用已经筛选好的简并引物进行RT-PCR的扩增。筛选出的简并引物：上游引物5’-CTCAGTACATCTCCTACGTGaartaytggtg-3’；下游引物5’-TCCGGATCGGCACcanykyttytc-3’。PCR反应体系为：10×Taqbuffer2.5μl、dNTP(2.5mM)2μl、cDNA模板0.5μl、上下游引物各1μl、TaqDNAPolymerase0.5μl，加H₂O17.5μl至25μl。PCR程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，64～55℃退火30s(间隔1℃递减，之后为55℃)，72℃延伸90s，进行30个循环后，72℃延伸10min。PCR产物保存于4℃用于后续实验。

反转录PCR产物在含Gengreen的琼脂糖凝胶(1％)上进行检测，经检测含有目的片段后利用Omega琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收；回收的特异性目的片段采用TAKARA公司克隆载体试剂盒连接入pMD18-TVector，转化进大肠杆菌DH5α内，在氨苄青霉素平板上涂布，挑取平板上的单菌落以载体通用引物(PrimerRV-M和PrimerM13-47)进行PCR检测后，经检测正确后，摇菌并测序。

根据所得到的草鱼pIgR基因的核心序列，利用PrimerPremier5.0设计基因特异性引物用于扩增pIgR基因cDNA全长。

表1草鱼pIgR基因RACE引物

(1)cDNA第一链合成

①在0.2mlRNasefree离心管中配置下列反应液：

表2RACE扩增cDNA第一链合成反应体系

②混匀后短暂离心，将成分收集管底。

70℃温预5min，然后冰上放置5min。

③添加以下成分到上述的0.2mlRNasefree离心管中，得到20μl混合液。

④移液器轻轻吹打，短暂离心。

⑤热盖PCR仪中42℃孵育60min。

注意：使用水浴或者普通PCR仪会因蒸发造成合成反应效率降低。

⑥95℃热激溶液10min，4℃保存。

⑦样品标记模板cDNA，保存-20℃最多3个月。

(2)5’RACEcDNA加尾

①用PCR产物纯化试剂盒(TaKaRa)纯化5’RACE用cDNA第一链；

②以末端转移酶(TdT，TaKaRa)为cDNA加尾，操作如下：

表35’RACEcDNA加尾反应体系

94℃热变性5min，立即冰浴2min，稍离心；

加入TdT酶1μL，混匀，37℃保温12h，65℃保温10min，灭活TdT，置-20℃保存；

(3)RACEPCR扩增

按以下组成在PCR管中混合试剂，震荡混匀后稍离心。

表45’RACEPCR扩增反应体系

将以上体系进行PCR反应，采用TouchdownPCR，反应条件为：95℃预变性5min；然后94℃变性30s，65～55℃退火30s(间隔2℃递减，之后为55℃)，72℃延伸90s，进行30个循环后，72℃延伸10min。

PCR产物作为下面巢式PCR扩增的模板，具体巢式PCR体系如下：

表55’RACE巢式PCR扩增反应体系

将以上体系进行PCR反应，采用TouchdownPCR，反应条件同上，4℃保存。

(4)PCR产物分析

PCR产物在含1％的琼脂糖凝胶上进行检测，经检测含有目的片段后利用Omega琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收；回收的特异性目的片段采用克隆载体试剂盒连接入pMD18-TVector，转化进大肠杆菌DH5α内，在氨苄青霉素平板上涂布，挑取平板上的单菌落以载体通用引物(PrimerRV-M和PrimerM13-47)进行PCR检测后，经检测正确后，摇菌并测序。

(5)序列拼接

将5’RACE和3’RACE扩增得到的产物(结果如图2所示)序列进行拼接，为进一步验证拼接结果的正确性，对拼接结果进行Blast比对。

克隆获得草鱼pIgR基因序列经Bioedit软件分析表明，完整的cDNA全长1640bp(Genbank登录号：KP768418)，包含一个1011bp的开放阅读框(ORF)，编码336个氨基酸，5’UTR(非编码区)为68bp，3’UTR为561bp，其中包含一个终止密码子，多聚腺甘酸加尾信号(PolyadenylationSignalSite)(AATAAA)如图3所示。

采用蛋白质组学软件(SMART软件，SignalIP程序，ProtParamtool，ProteinMolWt&AACompositionCalculator程序)对草鱼pIgR进行等电点等分析，结果表明草鱼pIgR的理论等电点(pI)为6.74，理论分子量为37.27kDa。采用分子生物学软件(ClustalW软件，clustalx1.8程序)进行序列比对、同源分析，结果表明草鱼pIgR氨基酸序列与鲤鱼(Cyprinuscarpio)、斑马鱼(Daniorerio)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的序列相似性较高，分别是77％、77％和52％；草鱼pIgR氨基酸序列包含2个免疫球蛋白样功能域(immunoglobulinlikedomains，ILD)(如图4所示)，分别对应哺乳类的ILD1和ILD5区域，存在主要结合位点CWDC(如图5箭头标注)，在ILD1区域存在独特且保守的结合位点KxWC和DxGxYxC，在ILD5区域中存在存在结合位点KxWC和DxGWYWC(x表示其他氨基酸)。序列在ILD1和ILD5中有4个保守的半胱氨酸残基，且数目和位置相同(如图5所示)。

本研究克隆了草鱼pIgR基因，将得到的pIgR基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行同源性比对分析，证明得到的序列是pIgR的同源序列。多序列比对分析发现10种硬骨鱼的pIgR氨基酸序列都只含有2个ILD，即ILD1和ILD2，分别对应哺乳动物的ILD1和ILD5，且均存在独特且保守的结合位点KxWC和DxGxYxC(x表示其他氨基酸)。在哺乳动物中，ILD1和ILD5能够结合分泌型Ig，从而介导其运输并参与分泌型Ig的组成，可以推断硬骨鱼的ILD1和ILD2与哺乳动物的ILD1、ILD5相似也能够结合分泌型Ig并介导其运输。

实施例2：本发明草鱼pIgR基因在健康草鱼组织中的差异表达分析

取3尾健康草鱼的皮肤、鳃、肠、肌肉、肝、脾、胃和头肾组织，分别混合各内脏组织，提取总RNA，反转录合成cDNA链，测定cDNA浓度，将其调到一致。根据得到的pIgR序列设计特异性引物CF、CR，据草鱼β-actin的保守序列设计内参引物C-ActinF和C-ActinR(表6)，半定量RT-PCR反应体系25μl：ddH₂O16μl，10×Taqbuffer2.5μl，2.5mMdNTP2μl，正向和反向引物各1μl(10μM)，TaqDNA聚合酶0.5μl，cDNA模板2μl。扩增条件为：94℃5min；94℃50s，55℃50s，72℃50s，30个循环；72℃10min；PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

表6半定量RT-PCR实验所用引物

结果如图6所示：pIgR在健康草鱼各组织中均有表达，但表达水平不同，其中在皮肤、鳃、肠、肝等黏膜相关淋巴组织中表达最强，其次是胃、脾脏、头肾，肌肉中表达最弱。该结果证实pIgR基因在黏膜相关组织如肠、鳃、皮肤及肝等组织有较高的表达水平，进一步表明pIgR蛋白与黏液多聚免疫球蛋白的转运相关。

实施例3：本发明草鱼pIgR基因在免疫刺激后的时空表达分析

1.抗原制备

柱状黄杆菌菌株(FlavobacteriumcolumnareG4)在25℃条件下于Shieh培养基(1L培养液中，含蛋白胨5g，酵母粉0.5g，0.01gCH₃COONa·3H₂O，0.01gBaCl₂·2H₂O，0.1gK₂HPO₄，0.05gKH₂PO₄，0.3gMgSO₄·7H₂O，0.0067gCaCl₂·2H₂O，0.001gFeSO₄·7H₂O，0.05gNaHCO₃，pH7.2)中振摇培养48h。

取25℃振荡培养48h后的100mL细菌培养液，11000r/min离心10min，沉淀用灭菌磷酸缓冲液(PBS，pH7.2)清洗三次，用含1.0％福尔马林的PBS重新悬浮，室温下放置24h。灭活后的细菌悬浮液再次以11000r/min离心10min，用灭菌PBS清洗两次以去除福尔马林，最后用灭菌PBS稀释到约1.0×10⁸cells/mL，制备好的FKG菌苗置于4℃冰箱备用。

2.免疫与取样

将健康的草鱼平均分为2组，暂养5d，水温28℃。实验组经灭活的FKG菌液浸泡30min，对照组于PBS中浸泡30min。分别于免疫刺激前及免疫后4h、8h、12h、24h、48h、72h从两组鱼中随机取3尾鱼，解剖取鳃、肌肉、皮肤、肠、肝、脾、胃和头肾，分别混合3尾鱼的各内脏组织，提取总RNA，反转录得到cDNA模板，测定cDNA浓度，并将其调到一致，保存备用。

3.实时荧光定量PCR检测

以β-actin基因作为内参，C-ActinF、C-ActinR为内参引物，CF、CR为特异性引物，每个样品做3个平行。根据测得的Ct值，利用2^-ΔΔCt法计算免疫刺激后不同时间点pIgR基因的相对表达量，采用SPSS16.0统计软件中的单因素方差(one-wayANOVA)分析基因表达量的差异，显著性水平为0.05。

结果如图7所示：草鱼各组织中pIgR的相对表达量在72h内均呈现先增加后减少的趋势，在48h内均有一个最高值出现。皮肤和鳃中pIgR基因的相对表达量在免疫后8h达到最高(P<0.05)，48h以后与对照组无显著差异；在肠中24h达到最高(P<0.05)，72h以后与对照组无显著差异；在胃中24h达到最高(P<0.05)，48h以后与对照组无显著差异；在肝中12h达到最高(P<0.05)，48h以后与对照组无显著差异；在脾中48h达到最高(P<0.05)，72h还没有减少到对照组水平(P<0.05)；在头肾中48h达到最高(P<0.05)，72h以后与对照组无显著差异。

实验结果表明当受到免疫刺激后，在48h内各组织pIgR的相对表达量均达到了最高值，且皮肤、鳃、肠、胃和肝等黏液相关组织相对于系统免疫组织做出最大免疫反应的时间更早，免疫应答反应更迅速，表明该基因参与了黏膜免疫应答反应，在机体抗感染初期发挥了重要作用。

序列分析结果表明草鱼pIgR氨基酸序列含有对应哺乳动物的ILD1和ILD5的功能结合区，且存在独特且保守的结合位点KxWC和DxGxYxC(x表示其他氨基酸)，为硬骨鱼类pIgR蛋白转运分泌型Ig在分子水平上提供直接证据，证实本发明克隆基因可用作研究构建原核或真核基因工程菌株、获得高效表达具生理活性的重组蛋白、分析pIgR与Ig的结合活性及在黏膜免疫应答中的功能的重要工具。另外，半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测结果表明pIgR基因参与了黏膜免疫应答反应，在机体抗感染初期发挥了重要作用，说明利用克隆获得的pIgR基因，分析抗原分子诱导后草鱼pIgR的应答表达变化与抗原的对应关系，可以进行草鱼疾病的早期诊断和疫苗使用效果的评价，对草鱼疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义，对其他养殖鱼类疾病的防治具有参考价值。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。