亚油酰乙醇胺在提高植物灰霉病和细菌性叶斑病抗性中的应用

摘要

本发明公开了亚油酰乙醇胺在提高植物灰霉病和细菌性叶斑病抗性中的应用以及在制备提高植物灰霉病和/或细菌性叶斑病抗性的制剂中的应用。本发明以亚油酰乙醇胺为主要有效成分制备的制剂，通过诱导植物体内的茉莉酸、水杨酸以及乙烯的信号路径，可显著增强植物对灰霉病和细菌性叶斑病的抗性，减少因灰霉病和细菌性病害给植株带来的经济损失。采用本发明制剂防治植物灰霉病和细菌性叶斑病简单易行，成本较低，可显著延迟和抑制灰葡萄孢、丁香假单胞菌单一或复合病原菌在叶片上的生长及病害的扩散，大大提高了植株对灰霉病和细菌性叶斑病的抗性。

说明书

技术领域

本发明涉及植物化学保护领域，尤其涉及亚油酰乙醇胺在提高植物灰霉病和细菌性叶斑 病抗性中的应用。

背景技术

在气候变化的大背景下，农业种植制度在发生改变，农作物病害的发生面积逐渐增加、 危害程度不断加剧，各种真菌性、细菌性以及病毒性病害更为猖獗，大大削弱了农业生产带 来的经济价值，威胁国家的农产品生产安全。

有研究表明，在园艺生产中，真菌病害为已知病害种类中种类最多的病害，可危害蔬菜、 果树及花卉等多种植物，约占病害种类的80％-90％，症状类型也最多，出现在植株的各个部 位。

目前，灰霉病为真菌病害中极为严重的一种，由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起，在其 低温高湿环境下极易发病，严重时还会导致作物绝产。在细菌性病害中，丁香假单胞菌 (Pseudomonassyringae)是引起植物病害发生的一类主要病原菌，其可在多数农作物上引起发 病，症状包括萎蔫、坏死、褪绿、肿瘤等，多称为细菌性叶斑病，给人类生产和生活造成了 很大的经济损失。

病害防治一直是农业生产中的重要问题，据调查，目前在蔬菜病虫害防治中,使用化学 农药防治的占80％以上。目前国内报道的防治灰霉病的药剂有苯并咪唑类，如多菌灵、苯菌 灵等。N-苯基氨基甲酸酯类，如乙霉威、霜霉威等，其杀菌作用机理与苯并咪唑类相同，都 是作用于病菌的微管蛋白，破坏其有丝分裂；二甲酰亚胺类，如异菌脲、腐霉利、乙烯菌核 利等杀菌剂的具体杀菌作用机理尚不明确。生产上防治细菌性叶斑病主要为农用抗生素，如 链霉素、角斑灵、井冈霉素等，其作用机制在于干扰病原物氨基酸代谢的酯醇系统从而影响 其蛋白质的合成。异氰尿酸类，如三氯异氰尿酸、氯溴异氰尿酸，其在作物表面能慢慢地释 放次溴酸和/或次氯酸，具有强烈的杀灭细菌的能力。上述杀菌剂可有效防止灰霉病菌、细菌 性叶斑病某些菌群的流行，减少灰霉病的发生。

但是，由于病原菌的生活周期短、病害传播快，加上长时间和普遍使用单一类型杀菌剂 和不合理的施药技术而导致病原菌已对某些常规杀菌剂普遍产生了抗药性，而且越发严重， 造成生产中防治困难。此外，生产上同时防治灰霉病和细菌性叶斑病，还需要多种药剂予以 组配，增加了化学农药的施用量，对农业生态系统的稳定和人类健康造成了一定的威胁。

相比较而言，植物诱导抗病性的研究和应用有着蓬勃的发展前景。植物诱导抗病性是指 植物在生物的、物理的或化学的诱导因子作用下产生能抵抗病原微生物的一种抗病能力，又 称获得性免疫。其具有广谱、系统和持久的特点，且不会污染环境，无残留，因而对保护那 些品质好但较感病的农作物品种具有特别重要的意义。

目前，已经研究发现的诱抗制剂有1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)、苯并噻二唑(BTH)、 油菜素内酯(BRs)等，有研究表明，BIT、BTH的施用能有效诱导水杨酸(SA)的合成， 且诱导植物系统抗性的发生，从而提高植物对细菌性、病毒性病害的抗性，而BRs经研究发 现为广谱性抗性制剂，在高温、低温等逆境胁迫中存在较好效果，但在真菌性病害中无明显 效果。目前，针对细菌性、真菌性病害兼具诱导抗病性制剂的研究和应用还相对空白。

亚油酰乙醇胺(英文名称：N-linoleoylethanolamine简称：NAE(18:2))，分子质量为 323.5g/mol，分子式为C₂₀H₃₇NO₂。其化学式为：

该物质是N-酰基乙醇胺(NAEs)中的一种植物组织中的微量脂质成分(Blancaflor等 “N-Acylethanolamines:lipidmetaboliteswithfunctionsinplantgrowthanddevelopment.”The PlantJournal201479：568–583)。目前研究已知，NAEs参与了植物细胞防卫系统的信号转导 事件，认为是对种子萌发等生命活动具有调节功能的生理活性小分子物质。

发明内容

本发明发现亚油酰乙醇胺具有诱导植物的水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)以及乙烯(ETH) 信号路径的作用，从而提高植物对真菌和细菌病害的抗性，降低灰霉病和细菌性叶斑病的发 生。

基于以上发现，本发明提供了亚油酰乙醇胺(简称NAE(18:2))在提高植物灰霉病中的 应用以及在提高植物细菌性叶斑病抗性中的应用。

本发明还提供了亚油酰乙醇胺在制备提高植物灰霉病和/或细菌性叶斑病抗性的制剂中 的应用。

所述的植物具体可以为番茄。

本发明还提供了一种制剂，所述制剂的有效成分为亚油酰乙醇胺；该制剂能够提高植物 灰霉病和细菌性叶斑病抗性。

亚油酰乙醇胺NAE(18:2)(N-linoleoylethanolamine)为N-酰基乙醇胺(NAEs)中的一种， 可诱导促进植物中水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ETH)的合成以及信号转导基因NPR1、 PR1、Coi1、PI1、PI2、ERF1、Ein2等的表达，从而提高植物对真菌性及细菌性病害的抗性。

作为优选，所述的制剂，以1L计，包括：亚油酰乙醇胺12～35g；表面活性剂0.1～0.15 L；有机溶剂0.15～0.7L；水0.15～0.75L。

所述有机溶剂的作用在于溶解亚油酰乙醇胺，使亚油酰乙醇胺更易与其他组分混合，本 发明中的有机溶剂可采用乙醇或乙腈，更优选为乙醇。

所述的表面活性剂可使制剂在植物表面的湿润、分散、展着和渗透性能显著增强，有效 减少制剂喷洒后随风漂移，提高制剂的抗雨水冲刷能力和药效、减少制剂的用量、延长制剂 的有效期。

本发明中的表面活性剂可采用有机硅、吐温60和Silwet-L77中的一种，优选为有机硅， 有机硅表面活性剂价格更为低廉，且在提高本发明制剂的延展性、降低制剂表面张力上效果 更为显著，使制剂更易被植株吸收。

更优选，所述的制剂，以1L计，包括：亚油酰乙醇胺12.94g；表面活性剂0.125L；有 机溶剂0.259L；水0.616L。在上述各组分配比下制得的制剂在植物表面的分散性、展着性 以及渗透性效果最佳。

所述的制剂通过如下方法进行制备：

(1)将亚油酰乙醇胺溶解于有机溶剂后，加水，得到混合溶液；

(2)向混合溶液中加入表面活性剂，获得所述制剂。

在实际制剂配制中，亚油酰乙醇胺通常已溶解于有机溶剂中，作为原料直接使用。

本发明还提供了一种提高植物灰霉病和/或细菌性叶斑病抗性的方法，包括以下步骤：将 所述的制剂用水稀释后喷施于植物叶片表面或滴灌在植株根部附近。

本发明制剂可在高湿、寡照等易发灰霉病和细菌性叶斑病的环境下或已出现轻微病害症 状的时期进行使用。制剂的使用浓度、次数，尤其是制剂中亚油酰乙醇胺NAE(18:2)的浓度 可根据植物的苗龄、具体生长情况以及植物生长环境情况、病害程度来确定。

作为优选，所述的制剂稀释后，喷施于植物叶片表面的亚油酰乙醇胺的浓度为16.2～64.7 mg/L。

本发明的优点在于：

(1)本发明对于已知化合物亚油酰乙醇胺NAE(18:2)发掘了新的提高植物灰霉病和细菌 性叶斑病抗性的用途，开拓了一个新的应用领域。

(2)本发明制剂中的亚油酰乙醇胺NAE(18:2)在植物体内可以通过磷脂酶D把NAPE水 解成NAE，同时NAE又可以通过脂肪酸氨基水解酶FAAH水解成游离脂肪酸和乙醇胺；所 以，亚油酰乙醇胺的代谢过程是植株体内自然存在的代谢，即使长期使用亚油酰乙醇胺也不 会危害环境，然而却可以有效地防治灰霉病和细菌性叶斑病的发生。

(3)本发明以亚油酰乙醇胺NAE(18:2)为主要有效成分制备的制剂，通过诱导植物体 内的茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)以及乙烯(ETH)的信号路径，可显著增强植物对灰霉病 和细菌性叶斑病的抗性，减少因灰霉病和细菌性病害给植株带来的经济损失。

(4)采用本发明制剂防治植物灰霉病和细菌性叶斑病简单易行，成本较低，可显著延迟 和抑制灰葡萄孢、丁香假单胞菌单一或复合病原菌在叶片上的生长及病害的扩散，大大提高 了植株对灰霉病和细菌性叶斑病的抗性。

附图说明

图1为实施例1中喷施本发明制剂与喷施清水对照间的番茄叶片抗性信号转导基因表达 及病害发生情况的比较；

A为制剂喷施2天后，叶片水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)及乙烯(ETH)信号路径相关 基因的相对表达量；B为灰霉病原菌喷施接种3天后叶片内病原菌Actin基因表达量；C为细 菌性叶斑病喷施接种3天后叶片内病原菌菌落数的对数值；空心柱代表对照植株，斜纹柱代 表处理植株；小写字母a、b代表不同处理间在5％水平上的差异显著。

图2为实施例2中喷施本发明制剂或喷施清水对照的植株进行灰霉病和细菌性叶斑病喷 施单一接种处理后，番茄叶片病害发生情况的比较；

A灰霉病发生率；B细菌性叶斑病发生率；空心柱代表对照植株，斜纹柱代表处理植株。

图3为实施例3中喷施本发明制剂或喷清水对照的植株进行灰霉病和细菌性叶斑病喷施 复合接种处理后，番茄叶片病害发生情况的比较；

A为灰霉病原菌喷施接种3天后叶片内病原菌Actin基因表达量；B为细菌性叶斑病喷施 接种3天后叶片内病原菌菌落数的对数值；空心柱代表对照植株，斜纹柱代表处理植株；小 写字母a、b代表不同处理间在5％水平上的差异显著。

图4为实施例4中本发明制剂的田间效应，喷施过本发明制剂与喷清水对照的番茄病害 发生率与发生严重情况的比较；

A番茄灰霉病或细菌性叶斑病发生率；B喷施与未喷施本发明制剂后健康与发病番茄叶 片的光系统II电子传递量子效率(YII)；空心柱代表对照植株，斜纹柱代表处理植株；小写 字母a、b、c代表不同处理间在5％水平上的差异显著。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。

实施例1

量取50mg/mL的亚油酰乙醇胺NAE(18:2)的乙醇溶液51.8mL(药品购自SIGMA公司)； 再缓慢加入123.2mL的水，并将混合溶液混合均匀，最后向混合溶液中加入25mL的有机硅 溶液，搅拌均匀后获得制剂。

取本发明制剂20毫升，加清水10升混合均匀后，在傍晚均匀喷施于苗龄为四叶一心的 番茄叶片表面，直至叶片湿润为止，持续喷施2天，以喷清水的番茄植株作为对照。

随机取喷施制剂及对照的番茄叶片样品，利用美国Invitrogen公司生产的Trizol、 SuperscriptII试剂盒进行RNA提取、纯化及cDNA的反转录，后利用美国AppliedBiosystems 公司生产的StepONEPlusReal-TimePCRSystem仪器及该公司的SYBRRT-PCRKit荧光染料 试剂盒对抗性相关基因表达进行荧光定量PCR检测，发现经制剂处理过的植株叶片中SA (NPR1、PR1)、JA(Coi1、PI1、PI2)及ETH(ERF1、Ein2)相关信号路径中的基因表达 较对照植株均显著大幅提高，提高幅度在6.9-46.8倍之间(图1A)。

对经过本发明制剂处理及对照植株进行单一灰霉病或细菌性叶斑病病原菌喷施接种处 理，使病菌悬浮液均匀分布在叶片上。灰霉病病原菌接种浓度为2×10⁵孢子/毫升，细菌性 叶斑病的接种浓度为1×10⁷菌落单位/毫升。将上述处理的所有植株置于25℃、95％湿度、 12h光照/12h黑暗、光强为200μmolm^-2s^-1的环境下放置3天后观察植株发病情况。

同时，随机取叶片样品，针对灰霉病原菌接种过的植株利用上述荧光定量PCR的方法对 灰霉病原菌的Actin基因表达情况进行检测；对细菌性叶斑病接种过的植株利用培养基培养 的方法对假单胞菌的菌落数进行检测。

结果如图1B和C所示：接种第3天后，本发明制剂处理的植株比对照的植株具有明显 较强的灰霉病及细菌性叶斑病抗性，叶片灰霉病原菌的Actin平均表达量下降47.1％，细菌性 叶斑病病原菌菌落数的对数值平均下降了2.5。

实施例2

量取50mg/mL的亚油酰乙醇胺NAE(18:2)的乙醇溶液129.4mL(药品购自SIGMA公 司)；再缓慢加入40.6mL的水，并将混合溶液混合均匀，最后向混合溶液中加入30mL的有 机硅溶液，搅拌均匀后获得制剂。

取本发明制剂15毫升，加清水10升混合均匀后，在傍晚均匀喷施于苗龄为五叶一心的 番茄叶片表面，直至叶片湿润为止，持续喷施2天，以喷清水的番茄植株作为对照。

对经过制剂处理及对照植株进行单一灰霉病或细菌性叶斑病病原菌喷施接种处理，使病 菌悬浮液均匀分布在叶片上。灰霉病病原菌接种浓度为2×10⁵孢子/毫升，细菌性叶斑病的 接种浓度为1×10⁷菌落单位/毫升。将上述处理的所有植株置于25℃、95％湿度、12h光照 /12h黑暗、光强为200μmolm^-2s^-1的环境下放置3天后观察植株发病情况。

如图2所示，本发明制剂处理的植株比对照的植株具有明显较强的灰霉病及细菌性叶斑 病抗性，在对照植株中，人工接种后灰霉病及细菌性叶斑病的发病率均为100％，而该制剂处 理后的植株灰霉病和细菌性叶斑病的发病率则分别下降为37.5％和33.3％。

实施例3

量取50mg/mL的亚油酰乙醇胺NAE(18:2)的乙醇溶液32.4mL(药品购自SIGMA公 司)；再缓慢加入147.6mL的水，并将混合溶液混合均匀，最后向混合溶液中加入20mL的 有机硅溶液，搅拌均匀后获得制剂。

取本发明制剂10毫升，加清水10升混合均匀后，在傍晚均匀喷施于苗龄为三叶一心的 番茄叶片表面，直至叶片湿润为止，持续喷施2天，以喷清水的番茄植株作为对照。

对经过制剂处理及对照植株同时进行灰霉病和细菌性叶斑病病原菌喷施接种处理，使病 菌悬浮液均匀分布在叶片上。灰霉病病原菌接种浓度为2×10⁵孢子/毫升，细菌性叶斑病的 接种浓度为1×10⁷菌落单位/毫升。将上述处理的所有植株置于25℃、95％湿度、12h光照 /12h黑暗、光强为200μmolm^-2s^-1的环境下放置3天后观察植株发病情况。

同时，随机取叶片样品，利用美国AppliedBiosystems公司生产的StepONEPlus Real-TimePCRSystem仪器及该公司的SYBRRT-PCRKit荧光染料试剂盒对叶片内灰霉病原 菌的Actin基因表达情况进行检测；利用培养基培养的方法对叶片内假单胞菌的菌落数进行 检测。

结果如图3A和B所示：接种第3天后，本发明制剂处理的植株比对照的植株同时具有 明显较强的灰霉病及细菌性叶斑病抗性，叶片灰霉病原菌的Actin平均表达量下降49.6％，细 菌性叶斑病病原菌菌落数的平均对数值下降了2.0。

实施例4

量取50mg/mL的亚油酰乙醇胺NAE(18:2)的乙醇溶液110mL(药品购自SIGMA公 司)；再缓慢加入60mL的水，并将混合溶液混合均匀，最后向混合溶液中加入30mL的有 机硅溶液，搅拌均匀后获得制剂。

选取栽培技术及管理完全一致的两个相邻的塑料大棚，在春末梅雨季节，对处理棚使用 本发明制剂，取本发明制剂60毫升，加清水30升混合均匀后，在清晨和傍晚分两次均匀喷 施于苗龄为七叶一心的番茄叶片表面至叶片湿润为止，持续喷施2天。而对照棚仅喷施相同 体积的水。10天后随机统计处理棚与对照棚中各80株番茄的发病率，并通过叶绿素荧光参 数比较处理棚与对照棚发病植株的发病程度。叶绿素荧光采用德国Heinz-Walz公司生产的 Imaging-PAM调制荧光成像系统测定。

结果如图4所示：在灰霉病及细菌性叶斑病高发阶段处理本发明制剂10天后，明显增强 了番茄植株对灰霉病及细菌性叶斑病的抗性，本发明制剂处理的植株比对照植株的病株率下 降61.5％。处理植株较对照植株中未发病健康植株的光系统II电子传递量子效率(YII)略高， 但无显著性差异。本发明制剂处理后仍然发病的植株也比对照条件下发病植株的光系统II电 子传递量子效率(YII)平均高60.5％。