一种适用于微生物的促进产沉香植物产生沉香的方法及应用

摘要

本发明提供了一种适用于微生物促进沉香属或拟沉香属植物产生沉香的方法及应用，该方法的步骤包括：在木质部表面先设置面状分布的凹沟或粗糙面，植入微生物促香剂后包覆木质部至结香或者直接在木质部植入微生物促香剂后包覆木质部至结香。本方法通过面式接菌的方法来提高菌株与树干的接触面，利用菌株本身的生物学浸染能力，使形成的沉香具有结香快，结香面宽，结香量大及味道接近自然香等特点。此外，本发明采用“面式”接菌的方法，无须开凿深入树干的孔洞，对白木部分的破坏较小，大大提高了白木的利用率。另外，本发明提供的结香方法剖香容易，如不需要把整棵树砍下则把结香部位的沉香剖下即可。

说明书

技术领域

本发明涉及生物农业技术领域，具体涉及一种适用于微生物的促进产沉香植物产生沉香的方法及应用。

背景技术

沉香为瑞香科(Thymelaeaceae)产沉香(Aquilaria)植物含有树脂的木材，沉香的形成非常特殊，健康的白木香不能产生沉香类物质，只有受到物理伤害、化学伤害及真菌侵染等外界的伤害后才诱导结香。质量高的沉香需要几年甚至几十年方能形成。由于天然沉香形成的特殊性及结香周期长，所以结香技术成为研究的热点。

由于微生物促进沉香有结香距离短及产量低等缺陷，因此寻找一种适用于促香微生物的结香方法，对沉香的形成及产业化有着重要的意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种适用于微生物的促进产沉香植物产生沉香的方法及应用。本发明提供的技术方案处理简单，能充分利用产沉香植物的木质部(如白木)、并利用菌株天然的侵染能力穿透树体，具有结香面大、结香时间短、结香产量高的优势，尤其适用于微生物促进结香。本发明提供的结香方法只需把结香部位剖下即可，不需要把整棵树砍下，剖香容易，有利于资源可持续利用。

第一方面，本发明提供了一种适用于微生物的促进产沉香植物产生沉香的方法，包括如下步骤A或B的至少一种:

步骤A：

A-1)揭开产沉香植物的树皮，露出木质部；

A-2)在木质部上接种微生物促香剂；或者在木质部上设置面状分布的凹沟和/或粗糙面，然后在面状分布的凹沟和/或粗糙面的表面接种微生物促香剂；

A-3)包覆所述处理过的木质部，至获得沉香；

步骤B：

B-1)在产沉香植物的次生木质部上开设面状分布的凹沟和/或粗糙面；

B-2)在面状分布的凹沟和/或粗糙面的表面接种微生物促香剂；

B-3)包覆或不包覆所述处理过的木质部，至获得沉香。

如本发明所述的“产沉香植物”包括但不限于沉香属(Aquilaria)、拟沉香属(Gyrinops)或其他诱导型植物，优选为沉香属植物。

进一步优选地，所述沉香属植物包括但不限于马来沉香(Aquilariamalaccensis)、越南沉香(Aquilariacrassna)或白木香(Aquilariasinensis)。

更进一步优选地，所述白木香(Aquilariasinensis)的树龄优选为5或6年以上的白木香。

在本发明一实施例中，所述步骤(A-1)中，揭开树皮的位置为产沉香植物的树干(即茎)、树干分枝及树根中的至少一种。

如本发明所述的，所述的“树皮”为常规剥皮操作中，剥下的那一层树皮；可能的会包括表皮、皮层还有韧皮部；常规的，剥皮之后即露出次生木质部。

优选地，所述步骤(A-1)中，揭开树皮后，露出次生木质部。

可以理解的是，本发明步骤(A-1)中，树皮揭开的位置任意分布在树体表面(优选为设置为拨开树干外围的3/4或4/5，进一步优选为树干两侧对称设置，揭开树皮的位置以维持树体存活为前提，保留不处理的树皮的量最少为维持树体存活的量；本领域技术人员可以根据具体需要任意设置揭开树皮的位置以及刮皮的方式。

本领域技术人员可以理解的是，根据具体树的树龄、树干粗细以及生长状态，本发明所述的“维持树体存活的量”会有所不同。剥皮的时候，优选的方式为：保留整个树干有完整的有机物运输网络(比如，设置剥皮的方式，使得保留的树皮成蜂窝状树皮)，确保树的活力。

本发明所述的“树干”，若无特别说明，是指树的茎。

在本发明一实施例中，所述步骤(A-1)中，揭开树皮后，裸露的次生木质部外围表面积总和不超过树干表面积的90％(优选为80％、75％、50％或者20％)。

值得注意的是，由于筛管由上而下运输有机物，结合实际生产中操作的简便性，在本发明提供的技术方案中，设置剥皮的方式时，优选使保留的树皮为至少一条沿树干平行方向的、连续的树皮。

如本发明所述的，“沿树干平行方向”即沿着树干从树根向树顶的方向(即主树干生长方向)，或者为树干分支的生长方向。

在本发明一实施例中，所述步骤(A-1)中，揭开树皮时，沿树干平行方向保留1条以上完整延续的树皮。

在本发明一实施例中，所述步骤(A-1)中，揭开树皮时，沿树干平行方向保留至少一圈完整延续的环形树皮。

在本发明一实施例中，在所述步骤(A-1)中，设置至少一条沿树干平行方向的、连续的树皮的方案中，完整延续树皮的宽度总和优选不少于树干周长的1/5-1/10，进一步优选为不少于1/4-1/2。

在本发明一实施例中，在所述步骤(A-1)中，设置至少一条沿树干平行方向的、连续的树皮的方案中，完整延续树皮的宽度总和优选为1/5或1/4。

优选地，所述步骤(A-1)中，揭开的树皮可以完全割离树干主体，也可以保留一部分树皮与树干主体相连，优选为保留上边线与树干相连。

值得注意的是，对于本发明所述的“保留上边线与树干相连”的树皮来说，树皮与树干相连的上边线可以为水平、或与水平呈一定角度(优选为非竖直)。

如本发明所述的，所述步骤(A-1)中，揭开的树皮可以为任意形状，包括但不限于三角形、方形、长方形、菱形、盾形、拱形、梯形、多边形、圆形、椭圆或葫芦形，优选为“∩”型。

容易理解的，揭开树皮的位置会裸露木质部，从整个树干上看，保留下的树皮则会形成类似“蜂窝网状”的“外套”包裹在树干上；可以理解的是，这件“外套”是由任意形状重复或杂合而成的网状柱体，这些形状即揭开树皮的形状，包括但不限于三角形、方形、长方形、菱形、盾形、拱形、梯形、多边形、圆形、椭圆或葫芦形，优选为“∩”型。

在本发明一个实施例中，保留下来的树皮(即不做处理的树皮)呈规则或不规则蜂窝网状，网边线之间的竖直高度不大于50cm(优选为不大于30或20cm)。

如本发明所述的，“∩”表示揭开的树皮保留上边线与树干相连，只切开左边、右边以及下边线，然后从下至上拨开树皮，揭开的树皮形成倒“U”型。

在本发明一个实施例中，所述步骤(A-2)中，在裸露木质部上设置布满整个裸露木质部的面状分布的凹沟和/或粗糙面。

可以理解的是，传统沉香生产工艺中，为了促进结香，往往在沉香木质部开设较深的沟槽制造伤口、或者钻孔提供接菌的部位，这些方式对树体伤害较大，尤其是白木浪费严重。与传统工艺不同，本发明设置的面状分布的凹沟和/或粗糙面仅需要开设一定数量的、较浅接触面大的凹陷，甚至是小疙瘩，形成面状分布的凹沟和/或粗糙面，给微生物促香剂提供接菌部位；加上凹陷、疙瘩之间的液体连通效果，以及菌体本身的侵染能力，使得菌体能迅速渗透整个结香面。

可以理解的是，在面状分布的凹沟和/或粗糙面的表面接种微生物促香剂后，整个裸露木质部均为结香面。比如，当揭开的树皮为“∩”型时，则获得“∩”型结香面。

在本发明一个实施例中，整个植株树干揭开多个“∩”型树皮，此外，还满足下述条件中的至少一种：a)每上下临近的两个“∩”型结香面中，上下两个“∩”型结香面之间保留的树皮竖直间距不大于50cm(优选为不大于30或20cm)；b)两侧的“∩”型结香面对称设置或交替出现设置；c)同一水平线上，所有裸露木质部的“∩”弧形周长总和不超过树干外围的9/10，总和优选为1/4-9/10，总和进一步优选为4/5或3/4。

本发明的“∩”树皮设置，有利于保持树皮筛管的完整性，使得接菌的木质部能持续获得营养供应，从而有利于微生物的生长和扩散，这样可以利用树干本身的营养供应，而不需使用过多的营养液或固体培养基。

如本发明所述的，在步骤(A-2)中，在揭开树皮后的木质部上设置面状分布的凹沟和/或粗糙面，优选包括面状分布的凹沟、粗糙面、面状分布的凹沟和粗糙面同时出现，共三种情况；其中，所述的面状分布的凹沟可以是相互交叉的凹沟形成的网状凹沟、也可以是相互平行的凹沟形成的水平、倾斜阶梯状凹沟(切口的方向优选为斜向下30-45℃)、竖直的凹沟、S形凹沟的集合、还可以是其他任意结构的面状分布凹沟；所述的粗糙面可以是面状分布的、任意形状的、凹陷或凹疙瘩的集合；所述的面状分布的凹沟和粗糙面同时出现可为任一形式的面状分布的凹沟与粗糙面的结合。

值得注意的是，本发明所述的“凹沟”并不限定具体用哪种工具在树干上割、切或凿而形成的凹陷；可以理解的是，本发明所述的“凹沟”与凹陷、凹槽、切口、凹口、凹疙瘩等名词是可以相互转换的，视具体限定条件而定、一般与“凹”的深度、宽度和长度相关，如本发明无特别说明，则可视为任意设置，比如设置为不超过树的直径；从实际应用出发，造沟深度需兼顾树的抗风能力，优选为不超过树的半径，进一步优选为不超过5cm，再进一步优选为1mm-5cm、1mm-2cm或者2mm-5cm，更进一步优选为5mm-1cm或5mm-2cm)。

在本发明一个实施例中，在步骤(A-2)中，面状分布的凹沟、粗糙面均为任一规则和/或不规则方向的凹沟集合而成；凹沟的造沟深度不超过树的直径，优选为不超过树的半径，进一步优选为不超过5cm，再进一步优选为1mm-5cm、1mm-2cm或者2mm-5cm，更进一步优选为5mm-1cm或5mm-2cm)。

在本发明一个优选实施例中，在步骤(A-2)中，在木质部上设置的粗糙面中，形成粗糙面的凹陷深度均为1mm-5mm(优选为2mm-5mm)。

本发明一个优选实施方式中，在步骤(A-2)中，凹沟或凹陷的宽度不大于1cm，长度不大于1cm，以增大单位面积内的附着点。

如本发明所述的，“凹沟或凹陷的长度不大于1cm”是某段凹沟或凹陷没有出现其他分支、分叉时的长度；比如，在正方形方格组成的网格状凹沟集合中，虽然每个方格的边长不大于1cm，但是从整体上看，同一水平或竖直线上若干方格边长拼接而成的一条跨越整个结香面的线的长度就不止1cm；可以理解的是，本发明所述“凹沟或凹陷的长度不大于1cm”目的是描述凹沟分布的密度。

优选地，在揭开树皮后的木质部上设置的面状分布的凹沟和/或粗糙面中，设置的凹沟或凹陷内表面优选为糙面，以提高不平整度，从而提高附着力。

在步骤(A-2)中，由于造沟深度较浅，能充分利用植株的白木部分，最大程度的减少钻孔、砸槽等深入木质部的造香方式造成的白木损失；同时，由于整个粗糙面或网状凹沟中的凹陷、凹陷间的间隔面均可成为菌株浸染的对象，大大提高了结香面。

本发明一个实施方式中，在步骤(A-2)中，在每个裸露木质部的上下端设置深度大于裸露木质部其他部位的凹沟，凹沟深度优选设置为不大于树的半径，进一步优选设置为1cm-5cm。在该实施方式中，凹沟中设置有微生物促香剂，有助于菌体深入感染，进而获得较宽的“点状香和/或点线状香”。

本发明一个实施方式中，在步骤(A)或(B)中，所得沉香包括面状沉香，还包括点状香和/或点线状香。

本领域技术人员可以理解的是，典型的“面状沉香”是树干、分枝、树根横截面呈现线状分布和纵切面呈面状分布的结香。

如本发明所述的，所述“点状沉香”和“点线状沉香”是同一种香不同切面的不同形态；比如，树干横截面呈现点状分布的“点状香”，而树干纵切面呈线状分布的“线状香”；若车成珠子，则呈现“点线状沉香”。“点状香”或“点线状香”区别于树干横截面出现的结香面(即面状沉香)，为沉香和白木的镶嵌物。

本领域技术人员可以理解的是，典型的“点状和/或点线状沉香”是树干、分枝、树根横截面呈现点状分布和纵切面呈线状分布的结香。

本发明一个优选实施方式中，所述点状和/或点线状沉香的香线填充在导管上、木射线上和/或木间韧皮部。

本发明一个优选实施方式中，所述点状和/或点线状沉香位于接菌处(优选为网状面接菌处)上端和/或下端10-50cm(优选为端口10-30cm、端口10-20cm或端口10cm)处。

如本发明所述的，在步骤(A-2)中，在面状分布的凹沟和/或粗糙面的表面刷上接种微生物促香剂的方式不限，比如：1)可先喷、刷或涂相应菌株的微生物培养液(培养基)或其他常规培养液(培养基)后，喷、刷或涂菌液；或者贴菌丝粉剂或菌丝膏剂；2)也可直接喷、刷或涂菌液；或者直接贴菌丝粉剂或菌丝膏剂。

如本发明所述的，所述微生物促香剂包括为微生物菌株、菌丝、菌株发酵液、菌株发酵液浓缩制剂中的至少一种。为便于运输、存储和产业化应用，在所述的微生物菌株、菌丝、菌株发酵液、菌株发酵液浓缩制剂和/或微生物发酵液过滤菌体后的滤液中，加入药学上可接受的赋形剂或载体，可制备成各种剂型，比如溶液剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、膏剂中的至少一种。可以理解的是，在具体应用时，各种剂型的微生物促香剂可以加水溶解制备成膏状或溶液，便于输液、刷涂、喷涂；比如，采用输液法时，将各剂型加水制备成溶液即可。

本发明一个实施方式中，所述步骤(A)或(B)中，所述的微生物促香剂的剂型为微生物和/或微生物发酵液过滤菌体后的滤液的溶液剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、膏剂中的至少一种，进一步优选为菌丝胶囊剂或颗粒剂，或菌液的溶液剂或注射剂。

如本发明所述的，本发明采用的“微生物促香剂”还可以包含行业内其他常用的沉香促香剂中的一种或多种。

如本发明所述的，本发明采用的“微生物促香剂”中，所述的“微生物”包括但不限于行业内已发现、未发现的或经改造的：1)可用于感染产沉香植物的微生物(优选为真菌)；2)可用于刺激产沉香植物的产生沉香的微生物(优选为真菌)。

在本发明一个实施例中，所述步骤(A)或(B)中，所述微生物促香剂中，所述微生物包括但不限于硬孔菌属(优选为硬孔菌R.vinctus)，拟层孔菌属(优选为拟层孔菌)，可可毛色二孢属(优选为可可毛色二孢)，镰刀菌属(优选为镰刀菌)，拟盘多毛孢属(优选为拟盘多毛孢菌)、头孢菌属(优选为头孢菌)、霉属(优选为木霉菌)、腐木菌属(优选为腐木菌)或小球壳菌属(优选为小球壳菌)的一种或多种。

优选地，所述拟层孔菌(Fomitopsissp.)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为:CGMCCNO.7802。

优选地，所述可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为:CGMCCNO.9591。

优选地，所述硬孔菌(Rigidoporusvinctus)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为:CGMCCNO.9594。

进一步优选地，所述拟盘多毛孢(Pestalotiopsisvirgatula)，来自促进沉香形成真菌ASAF05的分离、筛选和鉴定文献中所述(促进沉香形成真菌ASAF05的分离、筛选和鉴定，《中国药学杂志》，2014,Vol.49，陈旭玉等)。

进一步优选地，所述木霉菌(Trichodermaerinaceum)，为中国医学科学院药用植物研究所海南分所生物技术研究室分离。

本发明利用菌种本身对树体的感染能力和渗透能力，结合面式接菌的方式，结香距离长，结香面宽，且对白木损耗很少。

在本发明一个实施例中，所述步骤(A-3)中，包覆处理过的木质部的方式为：将揭开后的树皮复位，包覆处理过的木质部；或者采用尼龙膜、塑料膜等行业常规封皮材料包裹裸露的木质部。

在本发明一个实施例中，所述步骤(A-3)中，包覆处理过的木质部后，每隔10d-150d(优选30d-150d)，重新进行接种微生物促香剂，至获得沉香。

如本发明所述的，和步骤(A)相比，所述步骤(B)中，除了没有进行步骤(A-1)揭开树皮的操作外，其他操作均可与步骤(A)相同。

在本发明一个实施例中，在步骤(B)中，面状分布的凹沟、粗糙面均为任一规则和/或不规则方向的凹沟集合而成；凹沟的造沟深度不超过树的直径，优选为不超过树的半径，进一步优选为不超过5cm，再进一步优选为1mm-5cm、1mm-2cm或者2mm-5cm，更进一步优选为5mm-1cm或5mm-2cm)。

优选地，在步骤(B-1)中，在产沉香植物的木质部上开设面状分布的凹沟和/或粗糙面的步骤具体为：采用竖切的方式设置细沟，优选为围绕树干竖切至少一圈细沟，每圈细沟集合为面状分布的凹沟和/或粗糙面：其中，每圈细沟中，每隔L的水平距离竖切一细沟(L优选为1mm-5cm或5mm-20mm)。

经过试验验证，在上述竖切的方式设置细沟的方案中，如果竖切细沟之间的水平距离很短(优选为2mm-10mm，如，两竖之间距离是2mm)，表面会先腐烂，然后往里才到结香面；如果两竖之间距离大于4cm-5cm深度很深话，面上不烂就可结香。

进一步优选地，每一圈竖高大于5cm，优选为在5cm-100cm或5cm-200cm，本领域技术人员可根据具体树干的高度进行设置，设置原则为：竖切细沟最高不高于主树干高度。

进一步优选地，步骤(B-1)中，每圈细沟之间的竖直间隔(即完整的环形树皮)不大于50cm，优选不大于30或20cm。

进一步优选地，步骤(B-1)中，细沟深度优选为深入木质部1mm-5cm(进一步优选为1mm-2cm、2mm-2cm或1cm-2cm)。

如本发明第一方面所述的，在所述步骤(A-1)或(B)中，除了设置面状分布的凹沟或粗糙面之外，还包括但不限于同时联合使用行业内其他常规的对产沉香植物进行处理，以促进结香；比如，同时采用输菌液法、通体香结香的输液法和钻孔接菌的方法中的一种对产沉香植物进行处理，以获得深入白木的结香区域；比如同时采用《沉香结香方法的历史记载、现代研究及通体结香技术》中提到的任一一种或多种结香方法(黄俊卿等，中国中药杂志，第38卷第3期，2013,2)。

本发明提供的第一方面的方法，有利于在树干表层周围结香(可选地，当设置的面状凹沟深入树干中间，也可获得深入树干中间的结香)，当结合传统的对中间白木部分进行处理的输液法或钻孔接菌法(这些方法一般深入树干木质部，比如设置深入树干的孔洞，即可在孔洞范围内结香)；可获得树干表层延伸至中间的结香，即整个木质部都能获得结香，而不是仅仅利用树干的区域。

优选地，输菌液法、通体结香技术的输液法输入植物激素类沉香诱导剂、生物沉香诱导剂(比如真菌)的一种或多种。

如本发明所述的，所述的“输菌液法”为行业内常规输菌液操作，本领域技术人员可以理解的，所述的“输菌液法”为将液态的微生物促香剂通过钻孔、切口、凿槽等方式输入产沉香植物，优选为“通体香结香的输液法”；如本发明所述的“通体香结香的输液法”包括但不限于专利申请号201010104119.5中提到的输液法或《沉香结香方法的历史记载、现代研究及通体结香技术》中提到的“通体香结香法”，区别在于本发明的“输菌液法”将现有的“通体香结香的输液法”采用的沉香促香剂(比如植物激素、铁盐或钠盐等化学试剂)替换为本发明的微生物促香剂(溶液形式)。

本发明一个实施方式中，所述输菌液法为：在产沉香植物树干和/或分枝上钻孔、切口或凿槽，采用输液装置连通装有菌液的容器和设置好的孔洞、切口或凹槽，将菌液输入产沉香植物。

如本发明第一方面所述的，输液装置可含或不含压力推送部件。不含压力推送部件时，本发明技术方案可利用植物蒸腾作用将菌液疏导至植物茎干、枝条、根等各器官。含有压力推送部件时，本发明技术方案在利用植物蒸腾作用的基础上，可加快推送菌液疏导速度。

优选地，所述的在产沉香植物树干和/或分枝上钻孔的方式为：在树干和/或分枝上分多段打孔，每隔40cm-200cm打1个或多个孔，打孔方向为垂直或倾斜打孔，打孔的数量根据树的高度和直径设置。造孔深度优选设置为不大于树的半径或直径的2/3，比如设置为2cm-8cm深。孔径优选为0.5-1cm。

更优选地，所述每隔40cm-200cm打多个孔的方式为：在树干和/或分枝的同一高度绕树干同时打多个孔，优选2-6个输液孔，更优选在树干同一高度绕树干打4-6个孔，分枝则在同一位高度绕树干打1-2个孔。

如本发明所述的，所述的“钻孔接菌”为行业内常规操作，具体的，为在树干上钻孔，将菌种接种在孔洞中，或将菌株、菌丝、菌株发酵液、菌株发酵液浓缩制剂和/或微生物发酵液过滤菌体后的滤液喷、刷、涂或填充在孔洞中。打孔方式优选为：分多段打孔，每段打孔方式为：在树干和/或分枝的同一高度绕树干同时打孔1个或多个，优选2-6个孔，更优选在树干同一高度绕树干打孔4-6个，分枝同一位高度绕树干打孔1-2个。造孔深度优选设置为不大于树的半径或直径的2/3，比如设置为2cm-8cm深。孔径优选为0.5-1cm。

第二方面，本发明提供了一种沉香，为采用如第一方面所述的适用于微生物的促进产沉香植物产生沉香的方法获得。

优选地，所得沉香包括面状沉香，还包括点状香和/或点线状香。

第三方面，本发明提供了如第一方面所述的适用于微生物的促进产沉香植物产生沉香的方法获得的沉香木在制备工艺品中的应用。

优选地，如第一方面所述的适用于微生物的促进产沉香植物产生沉香的方法获得的点状沉香在制备工艺品中的应用。

如本发明所述的，所述工艺品包括但不限于笔筒、串珠、烟灰缸、木头雕刻摆件等行业常规工艺品。

本发明提供的技术方案的有益效果：

本发明采用“面式”接菌的方法，无须开砸一个深入树干半径的孔洞来提高菌种与树干的接触面，而是利用面状分布的粗糙面和/或凹沟(优选为网状凹沟或阶梯状凹槽)设置，结合菌株本身的生物学浸染能力感染整个揭开树皮的木质部，并穿透树干，极大地扩大沉香的结香距离。

附图说明

图1-图3为本发明的揭开树皮的方式示意图；

图4为本发明在裸露的木质部设置面状分布的凹沟和/或粗糙面的示意图；

图5为本发明方案B中围绕树干竖切一圈细沟的示意图；

图6-9为本发明实施例1提供的揭开树皮，设置面式接菌木质部的效果图；

图10为本发明实施例1提供的面式接菌方式所得点状香的效果图；

图11为本发明实施例1提供的揭开树皮，设置面式接菌木质部的效果图；

图12为本发明效果实施例1提供的面式接菌(硬孔菌)6个月后，结香的白木香结香效果；

图13为本发明效果实施例1-3提供的面式接菌(硬孔菌、拟层孔菌、可可毛色二孢)6个月后，白木香结香的薄层鉴定结果；

图14为本发明效果实施例2提供的面式接菌(拟层孔菌)6个月后，白木香的的结香效果；

图15为本发明效果实施例3提供的面式接菌(可可毛色二孢)6个月后，白木香的结香效果；

图16-17为本发明效果实施例4提供的面式接菌(拟盘多毛孢菌株、木霉菌株)6个月后，白木香的结香效果；

图18为本发明效果实施例4提供的面式接菌(拟盘多毛孢菌株、木霉菌株)6个月后，白木香结香的薄层鉴定结果；

图19为本发明效果实施例5提供的面式接菌(硬孔菌)6个月后，马来沉香和越南沉香的结香效果。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

如图1-图4所示，本发明提供了一种适用于微生物的促进产沉香植物产生沉香的方法，包括以下步骤:

1)揭开产沉香植物树干01的部分树皮，露出木质部(优选为次生木质部)02；

2)在裸露的木质部(优选为次生木质部)02上接种微生物促香剂；或者在裸露的次生木质部02上设置面状分布的凹沟03和/或粗糙面04，然后在面状分布的凹沟03和/或粗糙面04的表面接种微生物促香剂；

3)包覆所述处理过的木质部02，获得沉香。

在本发明实施例中，所述步骤(1)中，所述产沉香植物包括但不限于沉香属(Aquilaria)、拟沉香属(Gyrinops)或其他沉香植物。优选为沉香属植物。所述沉香属植物包括但不限于马来沉香(Aquilariamalaccensis)，越南沉香(Aquilariacrassna)或白木香(Aquilariasinensis)。所述白木香(Aquilariasinensis)的树龄优选为6年以上的白木香。

在步骤(1)中，揭开树皮的方式包括但不限于如下方案：

在第一种实施方案中，如图1-a所示。揭开沉香植物树干01的部分树皮05后，未处理的树皮06为竖直方向完整的、延续的一条树皮；整个裸露的木质部02为结香面：

在该方案中，树干任意位置的横截面如图1-b所示(不显示树皮05)，其中，树皮05的长度L优选为不小于1/10树干周长，进一步优选为树干周长1/4-4/5。

在该方案中，揭开的树皮可以是侧开(如图1-c所示)、可以“∩”型揭开(如图1-d所示)、也可以完全剥离树体(如图1-e所示)；在树皮侧开和“∩”型揭开的方式中，采用树皮复位的方式将木质部进行包覆；在树皮完全剥离树体的方式中，采用尼龙膜或塑料等行业常规包封材料包覆木质部。

所述“∩”表示揭开的树皮保留上边线与树干相连，只切开左边、右边以及下边线，然后从下至上拨开树皮的面，形成倒“U”型。

在本发明提供的各方案中，任选地，揭开树皮的方式可以为：树皮与树干没有完全剥离或树皮完全剥离树体；在后续具体方案描述中，不再赘述，在相应的图示中也不再显示。

可以理解的是，在本发明提供的各方案中，若树皮与树干没有完全剥离，则优选采用树皮复位的方式将木质部进行包覆，若在树皮完全剥离树体的方式中，采用尼龙膜或塑料等行业常规包封材料包覆木质部。

在实际生产过程中，至少保留一条竖直方向完整的、延续的树皮可以维持树体的存活，在该前提下，对剩余树皮的揭开方式不限，可以多种多样，比如，将第一个方案进行变化，获得包括但不限于如下的揭皮方式：

将树皮05与树皮06对应的位置保留下来，如图2-a所示，即，未处理的树皮06包括两条竖直方向完整的、延续的树皮061和062；优选地，如图2-b所示，树皮061的长度L1和树皮061的长度L2之和为不小于1/10树干周长，进一步优选为1/10-1/5树干周长。

可以理解的是，在其他方案中，也可以保留三条或三条以上的竖直方向完整的、延续的树皮，在同一水平线上各保留的树皮长度之和优选为不小于1/10树干周长，进一步优选为1/10-1/5树干周长。

作为优选方案，在上述的“保留至少一条竖直方向完整的、延续的树皮”的方案的基础上，进一步保留至少1圈完整的、环形树皮07，如图3-a和图3-b所示，图3中只显示1、2圈环形树皮07。

作为进一步优选方案，环形树皮07的高度H不大于50cm，进一步优选为不大于20cm。

作为其他替代方案，在上述的“保留至少一条竖直方向完整的、延续的树皮”的方案的前提下，揭开树皮的形状可以为任意形状，包括但不限于“∩”型、三角形、方形、长方形、菱形、盾形、拱形、梯形、多边形、圆形、椭圆或葫芦形或者其他雕刻形状中的一种或多种；在树干设置单个形状或多个形状分布在主树干的任意位置，其中，裸露的次生木质部表面积总和不超过树干表面积的90％(优选为60％、40％或者30％)。

在步骤(2)中，可用钢刷或其他常用工具设置步骤(2)所述的粗糙面，可用行业内常用方式，比如刮，锯，切，凿等设置网状凹沟，操作时，凹陷的方向不限定，比如横竖交错的网状凹陷，斜交的网状凹陷，或混合性网状凹陷。

如图4所示，揭开树皮后，在裸露的木质部02设置面状分布的凹沟03或粗糙面04，整个裸露的木质部02即为结香面；面状分布的凹沟03或粗糙面04优选布满整个裸露的木质部02。

在步骤(2)中，在本发明裸露的木质部02表面设置面状分布的凹沟03或粗糙面04的步骤中，包括但不限于如下方案：

在第一种方案中，如图4-a所示，所述的面状分布的凹沟03为在每个揭开树皮后的裸露木质部上设置深度为不超过树的半径、1mm-5cm、1mm-2cm或者2-5cm(更进一步优选为5mm-1cm或5mm-2cm)的规则或不规则网状凹沟(优选为相互交错的网状凹沟)，各凹沟的宽度不大于1cm，长度不大于1cm，以增大单位面积内的附着点。

此外，可以额外在网状凹沟面的上端和下端设个1cm-5cm的深度，以获得点线状香。

如本发明所述的，“凹沟或凹陷的长度不大于1cm”是某段凹沟或凹陷没有出现其他分支、分叉时的长度；比如，在正方形方格组成的网格状凹沟集合中，虽然每个方格的边长不大于1cm，但是从整体上看，同一水平或竖直线上若干方格边长拼接而成的一条跨越整个结香面的线的长度就不止1cm(比如，可以为1m)。

在第二种方案中，如图4-b所示，所述的粗糙面04为在每个揭开树皮后的裸露木质部上设置凹陷(凹陷深度为1-5mm，优选为2-5mm)形成粗糙面04，所述粗糙面04中凹陷的总面积(凹陷为多个)优选为该部位对应的裸露木质部面积的10％～50％。

第三种方案为第一和第二种方案的结合；优选地，在本发明第三种方案中，如图4-c所示，设置粗糙面04后，再在粗糙面的基础上设置深度为1mm-5cm、1mm-2cm或者2-5cm(更进一步优选为5mm-1cm或5mm-2cm)的规则或不规则网状凹沟(优选为相互交错的网状凹沟)，获得面状分布的凹沟03。

设置的大量的、相互交错的网状凹沟有利于存活下来的菌种沿凹沟增殖，并相互连通整个面。

在第四种方案中，如图4-d所示，所述的面状分布的凹沟04为在每个揭开树皮后的裸露木质部上设置倾斜阶梯状切口(深度优选为2-5cm)，切口为多个，切口距离优选为为20-100cm，进一步优选为20-50cm,，可以单面或双面错开切口。

本方案中，设置2-5cm深度的切口有利于装下微生物营养液使微生物繁殖更加旺盛增强微生物菌株的穿透能力代谢产物的渗透力；本发明设置的斜向下的阶梯状凹槽则有利于存活下来的菌种沿凹槽蔓延生长。

在步骤(3)中，在粗糙面03上，网状凹沟04的沟中、和/或沟间隔面上，或倾斜阶梯状切口中接种或涂抹的溶液剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、膏剂的至少一种；

在本发明实施例中，所述步骤(3)中，所述微生物促香剂中，所述微生物包括但不限于硬孔菌属(优选为硬孔菌R.vinctus)，拟层孔菌属(优选为拟层孔菌)，可可毛色二孢属(优选为可可毛色二孢)，镰刀菌属(优选为镰刀菌)，拟盘多毛孢属(优选为拟盘多毛孢菌)、头孢菌属(优选为头孢菌)、霉属(优选为木霉菌)、腐木菌属(优选为腐木菌)或小球壳菌属(优选为小球壳菌)中的一种或多种。

在步骤(4)中，复位揭开后的树皮01或用尼龙等材料包覆木质部02，每10d-150d，优选为15d-150d重复步骤3)一次，至获得沉香。

结合图5，本发明提供了一种适用于微生物的促进产沉香植物产生沉香的方法，包括以下步骤:

B-1)在产沉香植物的木质部上开设面状分布的凹沟和/或粗糙面；

B-2)在面状分布的凹沟和/或粗糙面的表面接种微生物促香剂；

B-3)包覆所述处理过的木质部，至获得沉香。

与上述如图1-图4所示的方案A不同的是，本方案B不揭开树皮，直接对树干进行处理，在带有树皮的树干木质部上开设面状分布的凹沟和/或粗糙面的方式和方案A中在裸露木质部上设置面状分布的凹沟和/或粗糙面一样。

优选地，在方案B中，如图5所示，可以围绕树干竖切一圈细沟：每隔L(L优选为1mm-5cm)的水平距离竖切一细沟021，每一竖高H1大于5cm，优选为在5cm-100cm或5cm-200cm；每圈之间的间隔H2优选不大于50cm，优选为不大于20cm；细沟深度优选为深入木质部1mm-5cm(进一步优选为1mm-2cm、2mm-2cm或1cm-2cm)。

值得注意是，上述方案A和方案B均已树主干为例，可以理解的是，本发明技术人员可根据需要在树体根部、或树体主干分枝上做相同或相似处理，同样应属于本发明保护范围。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述。

实施例1

一种微生物促进白木香形成沉香的方法，包括以下步骤：选取6龄以上白木香(Aquilariasinensis)植株，首先在距离地面20cm-60cm处将树干上的树皮按形状“Ц”刮下，揭开“∩”树皮，获得“∩”型结香面，然后从下至上拨开3/4的面，树皮拨开后，按步骤1)-3)任一操作：

1)在裸露的木质部上，用钢刷刷深为1mm-5mm的粗糙面(图6所示，a为示意图，b为实物图)；

2)用圆锯将裸露的木质部锯成深1-2cm的网状结构(图7所示，a图显示木质部处理后的结果、以b图显示结香6个月后的木质部结果)；

3)在裸露的木质部上刮下1mm-2mm次生木质部呈粗糙面后用圆锯将树干锯成网状结构(图8所示)；

4)在裸露的木质部上呈30-45℃切入深1-5cm的切口，每个切口之间间隔30-50cm，切割呈阶梯状，切口的方向优选为斜向下30-45℃(a角)(图9所示)；

在树干的粗糙面或者网状结构处或网沟处浇上营养液再接种微生物的溶液剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、膏剂的至少一种，最后封上树皮；

其中，上述揭开“∩”树皮的方式为：每隔20cm从下至上分别刮成长为30cm-100cm，宽为树的直径的“∩”面，每棵树的一个侧面至少形成2-5个“∩”型结香面。为了更加充分利用白木，本发明还在树的两侧方向进行刮皮至少形成2-5个长为30cm-100cm的“∩”型结香面。

结果显示，上述实施例1的各种接种方式均可结香，且裸露木质部形成结香面(效果基本和后续效果实施例相似，比如图12-a)。

此外，上述图6-8均只显示1个处理部位，实际实验的时候，每棵树的左右两侧均设置多个处理部位，比如图9和图11。结果显示，在图6-9的处理方式中，上下两个裸露木质部处理面(图6-8)或沟(图9)之间间隔的约20cm之间均可见点线状香分布(如图10所示，取自图7所示方案，即步骤(2)的结果)；

在图10中，横切面是点状香，该木段的竖切剖面也有线状香分布。

效果实施例1

硬孔菌(R.vinctus)ASAF02(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为(CGMCCNO.9594)促进结香效果验证

将硬孔菌(R.vinctus)ASAF02菌株培养3-15d,得到菌株菌丝(菌剂或膏剂)、发酵液，除菌滤液，根据树的大小按不同的剂量刮皮接种、或者钻孔接种将含菌体的发酵液，发酵液除去菌体的滤液接种白木香促进结香，具体接种方法如下：

1、接种材料的获得：硬孔菌(R.vinctus)ASAF02菌株用液体培养基培养获得的菌丝，即为接种菌丝1。菌丝接种至PDA液体培养基中，在30℃200转/分摇培3-15d，得到培养液，即为菌液2。菌丝真空粉碎干燥为真菌粉剂，即菌粉3。真菌粉剂添加附加成分(如淀粉)呈膏状，为膏剂4。

2、接种：以白木香(A.sinensis(Lour.)Gilg)为接种对象进行接种，接种方法如下：对照组：1)钻孔接种：在6年以上树龄白木香的自根部到地上40-60cm处部位钻孔，孔深至3-5cm，孔径1cm，将上述接种菌丝1或菌液2分别注入洞中；或者2)“∩”面式接菌：首先在距离地面50cm处树干上的树皮按这形状“Ц”刮下，然后从下至上拨开1/2的面，树皮拨开后，在树干上用圆锯将树干锯成深1-2cm的网状结构状(图11所示)，每隔40cm在树干从下至上分别刮成长为1m，宽为树的直径的面，每棵树的一个方向至少形成5个长为50cm，宽为树的直径的面(根据树的高矮进行)。在树干的网状结构处或网沟处中接种菌丝1、菌液2以及菌粉3、膏剂4中的至少一种微生物结香剂，浇上营养液，最后封上树皮。

结果表明，上述接种方式均可以使白木香结香。

其中，钻孔法只在孔口的周围及上下距离较近处有结香，获得的结香量少，与“∩”面式接菌跟钻孔法接种相比，“∩”面式接菌具有结香速度快、结香面大及结香距离长的特点；“∩”面式接菌均可使白木香在2个月内结香，只是随着时间的延长，结香效果更好，图12为6个月的结香结果。

上述“∩”面式接菌操作6个月，将结香的白木香砍下，拍照，结果如图12所示，图12-a为“∩”型裸露木质部部分的树干(图12-a中的“下段”部位)和该裸露木质部的上部10-30cm的截段(图12-a中的“上段”部位)，可见“下段”木有结香面和结香线，“上段”树干有点状香分布(上段树干竖切剖面也有线状香分布，横切成点状)；点状香是只有野生结香才能看到的现象，充分说明本发明提供的面式结香方式的优势。

此外，该裸露木质部(图12-a中的“下段”部位)的下部10-30cm的截段和“上段”有类似点状香分布，该裸露木质部的下部10-30cm截段的竖切剖面也具有线状香，说明在该处本发明提供的技术方案中，成功利用了微生物天然的渗透和感染能力，不仅可以保存树体的存活需要，还意想不到的在裸露木质部的上下10-30cm处获得了点线状结香。

图12-b为图12-a中的“下段”部位剖开结香面，具有面大，色黑，味道接近天然香等特点；图12-c显示图12-a中的“上段”部位的点状香(图12-a中的点状香宽度按约1-1.5cm宽；此外，可根据需要加宽菌液诱导剂初始涂覆的面积，比如，在裸露木质部的上下边缘处各设置3-5cm左右深入木质部的凹槽，并接种菌液，则获得形成3-5cm左右宽的点状香)。图12-d为裸露木质部的上部或下部10-30cm的截段的点状香，制备的沉香珠子，沉香珠子具有点线状沉香，且沉香线填充在导管上；其中，1号为白木对照，2-5号分别为菌丝1、菌液2、菌粉3、膏剂4实验组。

上述“∩”面式接菌操作6个月，将结香的白木香砍下，剖香，然后进行薄层鉴定。具体方法为：取上述方法获得的ASAF02菌株(菌液2组，其他微生物结香剂的结香效果类似)接种6个月获得的沉香样品粉末1g置于具塞三角瓶中，加甲醇25ml，超声处理60min，过滤，滤液定容至25ml，作为供试品溶液。取6,7-二甲氧基-2(2-苯乙基)色酮加甲醇配制成每毫升含0.05mg6,7-二甲氧基-2(2-苯乙基)色酮的色酮对照品溶液。吸取供试品溶液、对照药材溶液和色酮对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-乙醚(v﹕v＝10﹕1)为展开剂，展开两次，取出晾干，置紫外光灯(254nm和365nm)下检视，拍照。图13中的BM为未结香的健康白木香，ST为色酮对照(6,7-二甲氧基-2(2-苯乙基)色酮加甲醇)，ST是检测是否含有沉香成分的标志。CK为钻孔法的结香结果，RV为ASAF02菌株“∩”面式接种6个月获得的沉香薄层鉴定后获得与ST相似的斑点；FS和LT分别为效果实施例2和效果实施例3的实验数据。说明硬孔菌(R.vinctus)ASAF02菌株接种6个月后可促进沉香的形成，并且相对于钻孔法，“∩”面式接菌的方法结香效果最佳(见图12-a、12-b和图13)。此外，每个“∩”裸露木质部的上、下部10-30cm的截段均有点状香分布，如果结香时间延长，点状香分布的距离会更长。

效果实施例2

拟层孔菌(Fomitopsissp.)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为:CGMCCNO.7802。

将拟层孔菌(Fomitopsissp.)菌株培养3-15d,得到菌丝1、菌液2以及菌粉3、膏剂4中的至少一种作为微生物结香剂，参照实施例1的方法，设置刮“∩”皮接种组和钻孔接种对照，并根据树的大小按不同的剂量刮“∩”皮接种，每个“∩”裸露木质部上下间隔30cm的环形树皮不处理，具体接种方法和薄层鉴定方法同实施例1；

结果表明，上述接种方式均可以使白木香结香。其中，以“∩”面式接菌跟钻孔法接种相比，“∩”面式接菌具有结香速度快、结香面大及结香距离长的特点；“∩”面式接菌可使白木香在2个月内结香，只是随着时间的延长，结香效果更好，图14为拟层孔菌“∩”面式接菌(菌液2)操作6个月，将结香的白木香砍下，拍照结果。

此外，每个“∩”裸露木质部的上、下部10-20cm的截段均有点状香分布。

“∩”面式接菌操作6个月，将结香的白木香砍下，剖香，然后进行薄层鉴定。FS为拟层孔菌(Fomitopsissp.)菌株网状接种6个月获得的沉香薄层鉴定看见与ST相似斑点(见图13的FS泳道)。可见拟层孔菌(Fomitopsissp.)菌株接种6个月后可促进沉香的形成并且“∩”面式接菌的方法结香效果最佳(见图13的FS泳道和图14，图14-a和图14-b为剖开的结香面，图14-c为裸露木质部的上、下部10-20cm的截段的点状香横截面)。

效果实施例3

可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为:CGMCCNO.9591。

将可可毛色二孢(L.theobromae)菌株培养3-15d,得到得到菌丝1、菌液2以及菌粉3、膏剂4中的至少一种作为微生物结香剂，参照实施例1的方法，设置刮“∩”皮接种组和钻孔接种对照，并根据树的大小按不同的剂量刮“∩”皮接种，每个“∩”裸露木质部上下间隔50cm的环形树皮不处理，

具体接种方法和薄层鉴定方法同实施例1；

结果表明，上述接种方式均可以使白木香结香。相比之下，对照组钻孔接种结香距离短。

其中，以“∩”面式接菌跟钻孔法接种相比，“∩”面式接菌具有结香速度快、结香面大及结香距离长的特点；“∩”面式接菌可使白木香在2个月内结香，只是随着时间的延长，结香效果更好，图15为可可毛色二孢菌“∩”面式接菌(菌液2)操作6个月，将结香的白木香砍下，拍照结果。图15-a和图15-b为剖开的结香面，图15-c为裸露木质部的上、下部10-20cm的截段的点状香横截面)。每个“∩”裸露木质部的上、下部10-20cm的截段均有点状香分布，如果结香时间延长，点状香分布的距离会更长。

“∩”面式接菌操作6个月，将结香的白木香砍下，剖香，然后进行薄层鉴定。LT为可可毛色二孢(L.theobromae)菌株网状接种6个月获得的沉香薄层鉴定看见与ST相似斑点(见图13的LT泳道)。从图13和图15可知，可可毛色二孢(L.theobromae)菌株接种6个月后可促进沉香的形成并且“∩”面式接菌的方法结香效果佳。

效果实施例4和5

将拟盘多毛孢菌株(本实验室分离的菌株，促进沉香形成真菌ASAF05的分离、筛选和鉴定，《中国药学杂志》，2014,Vol.49，陈旭玉等)和木霉菌株培养3-15d,得到得到菌丝1、菌液2以及菌粉3、膏剂4中的至少一种作为微生物结香剂，参照实施例1的方法，设置刮“∩”皮接种组和钻孔接种对照，并根据树的大小按不同的剂量刮“∩”皮接种，每个“∩”裸露木质部上下间隔50cm的环形树皮不处理，

具体接种方法和薄层鉴定方法同实施例1；

结果表明，上述接种方式均可以使白木香结香。其中，以“∩”面式接菌跟钻孔法接种相比，“∩”面式接菌具有结香速度快、结香面大及结香距离长的特点；“∩”面式接菌可使白木香在2个月内结香，只是随着时间的延长，结香效果更好。此外，每个“∩”裸露木质部的上、下部10-20cm的截段均有点状香分布。

图16和17分别为拟盘多毛孢菌和木霉菌“∩”面式接菌(菌液2)操作6个月，将结香的白木香砍下，拍照结果；其中，图a和b为剖开的结香面，c为裸露木质部的上、下部10-20cm的截段的点状香横截面)。

将拟盘多毛孢菌和木霉菌“∩”面式接菌操作6个月，将结香的白木香砍下，剖香，然后分别进行薄层鉴定。图18中的BM为未结香的健康白木香，ST为色酮对照(6,7-二甲氧基-2(2-苯乙基)色酮加甲醇)，ST是检测是否含有沉香成分的标志。CK为钻孔法的结香结果，NP为拟盘多毛孢菌“∩”面式接种6个月获得的沉香薄层鉴定后获得与ST相似的斑点；MM为木霉菌“∩”面式接种6个月获得的沉香薄层鉴定后获得与ST相似的斑点。说明拟盘多毛孢菌和木霉菌菌株接种6个月后可促进沉香的形成，并且相对于钻孔法，“∩”面式接菌的方法结香效果很好。

采用如下所述微生物促香剂：硬孔菌、拟层孔菌、可可毛色二孢菌、镰刀菌，拟盘多毛孢菌、头孢菌、霉菌、腐木菌、小球壳菌中的一种或任意两种或任意三种搭配，参照效果实施例1的方法，刮皮进行面式接菌(菌液)，与对照组钻孔接菌相比，本发明提供的面式接菌的方法结香效果最佳。

各组实验结果显示，与对照组钻孔接菌相比，面式接菌具有结香速度快、结香面大及结香距离长的特点；“面式接菌可使白木香在2个月内结香，并随着时间的延长，结香效果更好。此外，每个“∩”裸露木质部的上、下部有10-30cm的点状香分布。

效果实施例6

将实施例1的6龄以上白木香(Aquilariasinensis)分别替换为马来沉香(Aquilariamalaccensis)或越南沉香(Aquilariacrassna)，其他步骤同实施例1。

结果表明，上述实施例的面状接种方式均可结香，与对照组钻孔接菌相比，本发明提供的面式接菌的方法结香效果最佳。

各组实验结果显示，与对照组钻孔接菌相比，面式接菌具有结香速度快、结香面大及结香距离长的特点；面式接菌可使白木香在2个月内结香，并随着时间的延长，结香效果更好。此外，每个裸露面的上、下部10-20cm的截段均有点状香分布。

马来沉香和越南沉香的6个月的结香效果分别如图19-a和19-b所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。