一组核苷酸序列及在沙门菌和志贺菌检测中的应用

摘要

本发明公开了一组用于MERT-LAMP扩增的引物序列，其中包括分别针对沙门菌和志贺菌的引物F3、B3、EFIP、BIP、LF和LB，在每个EFIP引物的5’端各标记有一个彼此不同的荧光基团，并在所述引物的其它位置标记有一荧光猝灭基团。本发明还公开了上述引物在沙门菌和志贺菌检测中的应用。该应用实现了一步法多重恒温检测，操作简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快。

说明书

技术领域

本发明涉及MERT-LAMP技术在细菌检测中的应用，特别是在沙门 菌和志贺菌鉴别诊断中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。

背景技术

志贺菌(Shigellaspp.)和沙门菌(Salmonellaspp.)是两种重要的食源 性疾病病原体，是广泛存在于环境中的革兰氏阴性菌。志贺菌和沙门菌 常分离自食品样本及临床标本，引起食源性的肠热症，临床症状表现为 发热、腹泻。据WHO数据统计，全球每年有180万病人死于腹泻，而 绝大多数腹泻病例是由志贺菌和沙门菌导致，从而受到世界各国的高度 关注，成为各国的重大公共卫生问题。在发展中国家，志贺菌是引起菌 痢的最主要的病原体。然而，无论是在发展中国家还是发达国家，沙门 菌是导致食源性疾病最重要的病原体。因此，为了给予临床病人准确快 速的治疗，开展食品监测以及志贺菌和沙门菌的流行病学调查，研发一 个省时、省力和特异性较高的检测方法，能够同时检测和鉴定志贺菌和 沙门菌成为必要。

目前对于志贺菌和沙门菌的检测主要依赖于传统的增菌培养和生化 鉴定。该方法耗时大约5到7天，包括增菌，选择培养及后续的生化鉴 定，其劣势是耗时耗力，生化结果的判读依赖于人的主观判断，导致结 果重复性差，易错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基 础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于志贺菌和沙门 菌的快速检测，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳 操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。对于一些落后的实验室 无法进行，限制了这些技术的运用。目前运用这些检测技术诊断志贺菌 和沙门菌的PCR方法和Real-timePCR方法，检测灵敏度差，检测过程 耗时较长，不利于快速检测和应急检测。

环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP) 是由Notomi等建立的一种新的核酸特异性扩增技术，具有特异性强、灵 敏高、操作简单、产物易检测等优点。该技术已被广泛用于分子诊断领 域。LAMP针对靶序列的6个特异部位设计4条核心引物，利用具有链 置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件(60～65℃)下催化新链合成，从而 使靶序列高效扩增。4条核心引物之中2条为内引物，即FIP(Forwardinner primer，FIP)和BIP(Backwardinnerprimer，BIP)。FIP包含Flc和F2(F2c 区域的互补序列)，即5′-Flc-F2；BIP包含B1c(B1区域的互补序列)和B2， 即5′-Blc-B2。其余两条核心引物为外引物为F3和B3。另外的两条环引 物(Loopprimes,LF和LB)被增加到反应体系中加速LAMP反应。LAMP 反应可以特异、高效、快速的扩增目的DNA，在1小时之内使产物的量 达到10⁹个拷贝。

LAMP扩增之后，其产物的检测可以通过琼脂糖电泳后染色观察。 较为简便的方法是直接在产物中加入SYBRGreenⅠ染色，呈现绿色为阳 性反应，橙红色为阴性反应。也可以通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊 度进行判断，液体浑浊，离心或有白色沉淀的为阳性反应，无此现象的 则为阴性反应。现在更为简单的方法是在反应混合物中加入可视染料， 阳性反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。 然而，这些方法都只能检测LAMP反应是否进行，不能识别针对某一靶 序列的特异性扩增，导致LAMP技术只能检测单一目的序列，限制了 LAMP技术的运用。

为了克服传统LAMP方法技术瓶颈，本发明人于2015年公开了一种 新的MERT-LAMP(MultipleEndonucleaseRestrictionReal-Time Loop-MediatedIsothermalAmplification)扩增技术(CN104962607A)， 即，多限制性内切酶实时环介导等温扩增技术。该专利文献公开的相关 技术内容作为引用技术文献被并入到本申请的说明书内容之中。

MERT-LAMP扩增技术以LAMP反应为基础，结合限制性内切酶酶 切和荧光检测原理，通过在LAMP扩增中的FIP和/或BIP引物5’端增加 限制性酶切位点序列，并在其上标记荧光基团，以及在引物其它部分上 标记猝灭基团，扩增产物能够被反应体系中的限制性内切酶特异性的识 别、切割，该过程将荧光基团和猝灭基团分开，释放的荧光信号可以通 过荧光检测器检测。不同的荧光信号代表了不同的靶序列，从而可以一 次扩增完成单种或多种目的基因片段的检测。从而实现一步法多重恒温 检测。该方法操作简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快，因此在诊 断检测领域有广泛的应用前景。

本发明分别针对志贺菌的特异基因ipaH和沙门菌的特异基因invA 基因设计了两套MERT-LAMP扩增引物，旨在建立针对志贺菌和沙门菌 病原体的快速、敏感和特异的核酸检测体系。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一组用于MERT-LAMP扩增的引 物序列，其特征在于，所述序列包括：SEQIDNO：1所示的引物Sal-F3， SEQIDNO：2所示的引物Sal-B3，SEQIDNO：4所示的引物Sal-EFIP， SEQIDNO：5所示的引物Sal-BIP，SEQIDNO：6所示的引物Sal-LF， SEQIDNO：7所示的引物Sal-LB；和/或

SEQIDNO：8所示的引物Shi-F3，SEQIDNO：9所示的引物Shi-B3， SEQIDNO：11所示的引物Shi-EFIP，SEQIDNO：12所示的引物Shi-BIP， SEQIDNO：13所示的引物Shi-LF，SEQIDNO：14所示的引物Shi-LB，

其中，在引物Sal-EFIP和引物Shi-EFIP的5’端各标记有一个彼此不 同的荧光基团，并在所述引物的其它位置标记有一荧光猝灭基团。

优选地，所述序列还包括SEQIDNO：3所示的引物Sal-FIP，和/或 SEQIDNO：10所示的引物Shi-FIP，FIP的使用为了提供更多的EFIP结 合位点，从而形成更多的酶切末端。

在一个优选的技术方案中，引物Sal-EFIP标记的荧光基团为HEX， 所述Shi-EFIP标记的荧光基团为Cy5。

更为优选地，所述引物Sal-EFIP标记的荧光猝灭基团为BHQ-1，所 述Shi-EFIP标记的荧光猝灭基团为BHQ-2。

最为优选地，所述引物Sal-EFIP的荧光猝灭基团标记位置位于5’端 第16碱基，所述引物Shi--EFIP的荧光猝灭基团标记位置位于5’端第21 碱基。

本发明还提供了上述的序列在沙门菌和/或志贺菌检测中的应用，所 述检测采用MERT-LAMP扩增技术。

优选地，所述MERT-LAMP扩增的反应温度为62-65℃。

在一个优选的技术方案中，所述应用采用单一样本检测模式，所使 用的引物为：

SEQIDNO：1所示的引物Sal-F3，SEQIDNO：2所示的引物Sal-B3， SEQIDNO：4所示的引物Sal-EFIP，SEQIDNO：5所示的引物Sal-BIP， SEQIDNO：6所示的引物Sal-LF，SEQIDNO：7所示的引物Sal-LB； 或

SEQIDNO：8所示的引物Shi-F3，SEQIDNO：9所示的引物Shi-B3， SEQIDNO：11所示的引物Shi-EFIP，SEQIDNO：12所示的引物Shi-BIP， SEQIDNO：13所示的引物Shi-LF，SEQIDNO：14所示的引物Shi-LB。

优选地，所述序列还包括SEQIDNO：3所示的引物Sal-FIP，或SEQ IDNO：10所示的引物Shi-FIP。

在另一个优选的技术方案中，所述应用采用多重样本检测模式，所 使用的引物为：

SEQIDNO：1所示的引物Sal-F3，SEQIDNO：2所示的引物Sal-B3， SEQIDNO：4所示的引物Sal-EFIP，SEQIDNO：5所示的引物Sal-BIP， SEQIDNO：6所示的引物Sal-LF，SEQIDNO：7所示的引物Sal-LB； 和

SEQIDNO：8所示的引物Shi-F3，SEQIDNO：9所示的引物Shi-B3， SEQIDNO：11所示的引物Shi-EFIP，SEQIDNO：12所示的引物Shi-BIP， SEQIDNO：13所示的引物Shi-LF，SEQIDNO：14所示的引物Shi-LB。

优选地，所述序列还包括SEQIDNO：3所示的引物Sal-FIP，和SEQ IDNO：10所示的引物Shi-FIP。

本发明应用上述引物通过MERT-LAMP能单独分别检测志贺菌或沙 门菌，而且也能一步同时准确的检测和鉴别志贺菌和沙门菌，具有操作 简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快的优点。诊断志贺菌的检测下 限为62.5fgDNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为12分钟，检测 最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约28分钟。诊断沙门菌的检测下 限为125fgDNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为12分钟，检测 最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约28分钟。本发明应用上述引物 通过MERT-LAMP能同时准确的检测和鉴别志贺菌和沙门菌，对19株志 贺菌和14株沙门菌的检测均为阳性，20株非志贺菌，非沙门菌不出现阳 性结果，显示了良好的特异性。

附图说明

图1.引物设计位置和方向示意图

图2.MERT-LAMP扩增荧光目视检测和电泳检测结果判定图谱；

图3.MERT-LAMP技术的最佳反应温度检测图谱；

图4.MERT-LAMP检测单一样本的灵敏度检测图谱；

图5.LAMP检测单一样本的灵敏度检测图谱；

图6.MERT-LAMP检测多重样本的灵敏度检测图谱；

图7.MERT-LAMP技术的特异性检测图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将 会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的 保护范围构成任何限制。

根据志贺菌属(Shigellaspp.)的特异性基因ipaH(Genbankaccession no.M32063)和沙门菌属(Salmonellaspp.)的特异基因invA(Genbank accessionno.NC.003197)设计MERT-LAMP扩增引物，ipaH基因存在于 所有的志贺菌中，其特异性好，可以将志贺菌与其他亲缘关系较近的菌 种和菌属区分开。invA基因存在于所有的沙门菌中，其特异性好，可以 将沙门菌与其他亲缘关系较近的菌种和菌属区分开。利用多序列比对软 件ClustalX1.83和引物设计软件PrimerPremier5.0设计交叉反应引物， 并将获得的特异性引物在NCBI数据库中进行序列比对分析，以排除引 物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的两套 MERT-LAMP扩增引物。引物设计的位置和方向见图1，序列见表1。

表1引物信息

Sal,Salmonella，沙门菌；

Shi,Shigella，志贺菌；

F,forward，正向；

B,backward，反向；

FIP,forwardinnerprimer，正向内引物；

EFIP,thenovelforwardinnerprimer，酶标的正向内引物；

BIP,backwardinnerprimer，反向内引物；

LF,loopforwardprimer，正向环引物；

LB,loopbackwardprimer，反向环引物；

Probe，探针。

其中，Sal-EFIP标记有荧光基团HEX(六氯-6-甲基荧光素)和淬灭 基团BHQ-1(Blackholequencher1，荧光淬灭剂1)，具体标记位置为：

5'-HEX-TGCAATG-GCGCGGCAT(BHQ-1)CCGCATCAATAGGTAT GCCCGGTAAACAGAT-3'；

Shi-EFIP标记有荧光基团Cy5(Cy5荧光素)和淬灭基团BHQ-2 (Blackholequencher2，荧光淬灭剂2)，具体标记位置为：

5'-Cy5-TGCAATG-TCCGCAGAGGCACT(BHQ-2)GAGTTTTTCACG CAATACCTCCGGATTC-3'；

Sal-Probe标记有荧光基团FAM(6-羧基荧光素)和淬灭基团BHQ-1， 具体标记位置为：

5'-FAM-TGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCT-BHQ1-3’；

Shi-Probe标记有荧光基团Cy5和淬灭基团BHQ-2，具体标记位置为：

5'-Cy5-CGCCTTTCCGATACCGTCTCTGCA-BHQ-2-3'。

本发明中所使用和涉及的试剂：

LoopampKit(EikenChemicalCo.Ltd.,Tokyo,Japan)购于日本荣研公 司。DNA提取试剂盒(QIAampDNAminikits；Qiagen,Hilden,Germany)购 于德国Qiagen公司。qPCR反应体系混合物Premix(TakaraBio,Inc.,Otsu, Japan，dNTP和缓冲液)购于北京Takara生物科技有限公司。PCR反应 体系混合物MIX(TaqDNA聚合酶，dNTP和缓冲液)购于北京康为世 纪生物科技有限公司。DL50DNAMarker和DL50DNAMarker购于宝生 物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分析纯产品。

本发明实验中使用和涉及的主要仪器：Loopamp实时浊度仪 LA-320C(EikenChemicalCo.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司。实时荧光 检测仪为Rotor-GeneQReal-TimeSystem(Qiagen),德国Qiagen产品；电 泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；PCR仪为Sensoquest Labcycler,德国Sensoquest产品；凝胶成像系统为Bio-RadGelDoxXR, 美国Bio-Rad产品。

志贺菌，沙门菌及其他种类菌的基因组DNA的提取。

基因组提取：细菌基因组的提取使用Qiagen公司的DNA提取试剂 盒(QIAampDNAminikits；Qiagen,Hilden,Germany)，按照说明书进行操 作。利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，志贺菌和沙门 菌基因组DNA用GE缓冲液连续稀释(从2.5ng，250pg,25pg,2.5pg,250fg, 125fg，62.5fg到31.25fg)。各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。

实施例1.MERT-LAMP标准反应体系，

LAMP的反应体系如下：引物EFIP和FIP的浓度各为20pmol，引 物BIP的浓度为40pmol(为了获得更好的技术效果，也可以引入引物 EBIP，即增加限制性酶切位点序列的引物BIP，这时，引物BIP、EBIP 的浓度各为20pmol)，引物F3和B3的浓度为5pmol，引物LF和BF 的浓度为20pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO₄，1mM的dNTP， 2.5μL的10×BstDNA聚合酶缓冲液，8U的链置换DNA聚合酶，15U的 DNA限制性内切酶，1μL的模板，补加去离子水至25μL。整个反应在荧 光检测仪(Rotor-GeneQRealTimeSystem,Qiagen)中进行中进行，等温 扩增63-65℃1h，80℃5min终止反应。

实施例2.MERT-LAMP多重反应体系，

MERT-LAMP的反应体系如下：引物Shi-EFIP和FIP的浓度各为10 pmol，引物Shi-BIP的浓度为20pmol,引物Shi-LF和shi-LB的浓度为10 pmol，引物Shi-F3和Shi-B3的浓度为10pmol；引物Sal-EFIP、Shi-FIP 的浓度各为15pmol，引物Sal-BIP的浓度为30pmol，引物Sal-LF和Sal-LB 的浓度为15pmol，引物Sal-F3和Sal-B3的浓度为10pmol；10mM的 Betain，6mM的MgSO₄，1mM的dNTP，12.5μL的10×BstDNA聚合酶 缓冲液，8U的链置换DNA聚合酶，15U的DNA限制性内切酶，1μL 的模板，补加去离子水至25μL。整个反应在荧光检测仪(Rotor-GeneQ RealTimeSystem,Qiagen)中进行，等温扩增63-65℃1h，80℃5min终止 反应。

实施例3.LAMP标准反应体系，

LAMP的反应体系如下：引物FIP的浓度各为40pmol，引物BIP的 浓度为40pmol，引物F3和B3的浓度为5pmol，引物LF和BF的浓度 为20pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO₄，1mM的dNTP，2.5μL 的10×BstDNA聚合酶缓冲液，8U的链置换DNA聚合酶，15U的DNA 限制性内切酶，1μL的模板，补加去离子水至25μL。整个反应在荧光检 测仪(Rotor-GeneQRealTimeSystem,Qiagen)中进行，等温扩增 63-65℃1h，80℃5min终止反应。

实施例4.Real-timeRCR方法反应体系

其中，沙门菌的qPCR体系的上游引物序列为Sal-FSEQIDNO:15， 下游引物序列为Sal-RSEQIDNO:16，探针序列为Sal-ProbeSEQID NO:17。

志贺菌的上游引物序列为Shi-FSEQIDNO:18，下游引物序列为Shi-R SEQIDNO:19，探针序列为Shi-ProbeSEQIDNO:20。

在实时荧光定量PCR仪上扩增并测定结果：

在荧光检测仪(Rotor-GeneQRealTimeSystem,Qiagen)中进行 Real-time反应，扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据， 确定该反应的Ct(cyclethreshold)值。

实施例5.普通RCR反应体系：

PCR反应条件：

其中，沙门菌的上游引物序列为Sal-FSEQIDNO:15，下游引物序列 为Sal-RSEQIDNO:16。

志贺菌的上游引物序列为Shi-FSEQIDNO:18，下游引物序列为 Shi-RSEQIDNO:19。

反应结束后，取10μlPCR产物在2.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳， 并在凝胶成像系统上观察分析结果。

实施例6.MERT-LAMP的可行性验证

标准体系用于验证MERT-LAMP引物的可行性，在标准体系条件下， 加入一套对应的MERT-LAMP引物和对应的DNA模板，通过可视颜色 变化法、电泳检测法和荧光检测方法证实MERT-LAMP技术可行。

可视颜色变化法：MERT-LAMP在合成DNA的同时还产生大量的焦 磷酸根离子，该离子能够夺取与钙黄绿素结合的锰离子，使钙黄绿素恢 复游离状态而发荧光。该发光混合物能够与反应中产生的镁离子结合， 使荧光得到增强。可以通过荧光目视检测颜色变化判读结果，阳性反应 管从浅灰色变为绿色，阴性反应保持浅灰色不变，见图2A(志贺菌)和 2B(沙门菌)。

电泳检测法：由于MERT-LAMP反应与LAMP反应相似，其产物也 是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA 片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小片段区带组成的阶梯式图谱， 可以根据片段大小进行判定，见图2C(志贺菌)和2D(沙门菌)。

实时荧光检测法：标准体系条件下，在反应管中加入一套引物和对 应的模板，酶切后产生的荧光通过荧光检测器接收，得到稳定的荧光曲 线。

实施例7.测定MERT-LAMP技术的最佳反应温度

在标准体系条件下，加入志贺菌、沙门菌的MERT-LAMP引物和志 贺菌及沙门菌的DNA模板，其模板浓度为25pg/ul。反应在恒温条件下 进行(60-67℃)，结果运用实时荧光仪进行检测，在不同的温度下得到两 组不同的动态曲线图，见图3A和3B。62-65℃被推荐作为MERT-LAMP 技术的最佳反应温度。

实施例8.MERT-LAMP检测单一样本的灵敏度

在标准体系条件下，倍比稀释模板DNA(2.5ng,250pg,25pg,2.5pg, 250fg,125fg，62.5fg和31.25fg/微升)，1微升各浓度模板加入反应体系中， 通过实时荧光检测，得到稳定的荧光检测图形，见图4。MERT-LAMP检 测单一靶序列，诊断志贺菌的检测下限为62.5fgDNA/反应管，且消耗的 最短检测时间大约为12分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗 大约28分钟。当反应体系中基因组模板量降低至62.5fg以下时， MERT-LAMP反应不出现阳性扩增,见图4A。当产物进行电泳检测时， 其检测下限也为62.5fgDNA/反应管，见图4B。

MERT-LAMP检测单一靶序列，诊断沙门菌的检测下限为125fg DNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为12分钟，检测最低检测限 水平的DNA也仅仅消耗大约28分钟。当反应体系中基因组模板量降低 至125fg以下时，MERT-LAMP反应不出现阳性扩增，见图4C。当产物 进行电泳检测时，其检测下限也为125fgDNA/反应管,见图4D。

实施例9.比较MERT-LAMP，LAMP，qPCR及PCR检测单一样本 的灵敏度

在标准LAMP体系条件下，倍比稀释模板DNA(2.5ng,250pg,25pg, 2.5pg,250fg,125fg，62.5fg和31.25fg/微升)，1微升各浓度模板加入反应 体系中，通过实时浊度检测，得到稳定的实时浊度检测图形，见图5。 LAMP检测单一靶序列，诊断志贺菌的检测下限为62.5fgDNA/反应管， 消耗的最短检测时间大约为16分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅 仅消耗大约28分钟。当反应体系中基因组模板量降低至62.5fg以下时， LAMP反应不出现阳性扩增,见图5A。当产物进行电泳检测时，其检测 下限也为62.5fgDNA/反应管，见图5B。(图5A中，实时浊度曲线从左 到右依次对应的DNA浓度为2.5ng,250pg,25pg,2.5pg,250fg,125fg和 62.5fg/微升)；

LAMP检测单一靶序列，诊断沙门菌的检测下限为125fgDNA/反应 管，消耗的最短检测时间大约为18分钟，检测最低检测限水平的DNA 也仅仅消耗大约26分钟。当反应体系中基因组模板量降低至125fg以下 时，LAMP反应不出现阳性扩增见图5C。当产物进行电泳检测时，其 检测下限也为125fgDNA/反应管,见图5D。(图5C中，实时浊度曲线从 左到右依次对应的DNA浓度为2.5ng,250pg,25pg,2.5pg,250fg和125fg/ 微升)；

在标准的qPCR反应条件下，倍比稀释模板DNA(2.5ng,250pg,25pg, 2.5pg,250fg,125fg，62.5fg和31.25fg/微升)，1微升各浓度模板加入反 qPCR应体系中，通过实时荧光检测，得到稳定的实时荧光检测图形，见 表2。qPCR检测单一靶序列，诊断志贺菌的检测下限为2.5pgDNA/反应 管，当反应体系中基因组模板量降低至2.5pg以下时，qPCR反应不出现 阳性扩增,见表2。qPCR检测单一靶序列，诊断沙门菌的检测下限为2.5 pgDNA/反应管，当反应体系中基因组模板量降低至2.5pg以下时，qPCR 反应不出现阳性扩增,见表2。

在标准的PCR反应条件下，倍比稀释模板DNA(2.5ng,250pg,25pg, 2.5pg,250fg,125fg，62.5fg和31.25fg/微升)，1微升各浓度模板加入反 qPCR应体系中，PCR检测单一靶序列，诊断志贺菌的检测下限为25pg DNA/反应管，当反应体系中基因组模板量降低至25pg以下时，PCR反 应不出现阳性扩增,见表2。PCR检测单一靶序列，诊断沙门菌的检测下 限为25pgDNA/反应管，当反应体系中基因组模板量降低至25pg以下 时，PCR反应不出现阳性扩增,见表2。

表2.MERT-LAMP，LAMP，qPCR及PCR检测单一样本的灵敏度比较

实施例10.验证MERT-LAMP的多重检测能力及灵敏度

为了得到稳定的多重荧光检测图形，对标准体系进行优化适应多重检 测，建立多重检测体系。我们在多重反应混合物中同时加入两套引物及 对应的模板(倍比稀释模板DNA至2.5ng,250pg,25pg,2.5pg,250fg, 125fg，62.5fg和31.25fg/微升，1微升各浓度模板加入多重MERT-LAMP 反应体系中)。通过荧光检测器检测，得到稳定的多重荧光检测图，见图 6。MERT-LAMP反应体系能够同时进行两个靶序列的检测，证明了 MERT-LAMP技术的多重检测能力，应用MERT-LAMP检测多个靶序列 时，其检测时间和检测灵敏度与单序列检测没有质的变化，最短的检测 时间为12分钟左右。

多重MERT-LAMP同时检测多个靶序列时，诊断志贺菌的检测下限 为62.5fgDNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为12分钟，检测最 低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约28分钟。当反应体系中基因组模 板量降低至62.5fg以下时，MERT-LAMP反应不出现阳性扩增,见图6A。 诊断沙门菌的检测下限为125fgDNA/反应管，且消耗的最短检测时间大 约为12分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约28分钟。当 反应体系中基因组模板量降低至125fg以下时，MERT-LAMP反应不出 现阳性扩增,见图6B。

实施例11.检测特异性评价

以常见的致病菌及条件致病菌DNA(志贺菌，沙门菌，霍乱弧菌， 副溶血弧菌，创伤弧菌，单增李斯特菌，伊氏李斯特菌，蜡样芽胞杆菌， 肠致病性大肠杆菌，肠产毒性大肠杆菌，肠侵袭性大肠杆菌等)为模板 评价MERT-LAMP反应体系的特异性，菌株信息见表3。MERT-LAMP 扩增技术能同时准确的检测和鉴别志贺菌和沙门菌，非志贺菌，非沙门 菌不出现阳性结果，说明MERT-LAMP方法的特异性良好，见图7。

表3.菌株信息

注:U，未鉴定菌株；ATCC,美国菌种保藏中心；ICDC,中国疾病预防控制中 心传染病预防控制所。