通过质量响应变化鉴定所需的T淋巴细胞

摘要

在某些实施方案中，提供了鉴定响应于特异性靶细胞抗原的T细胞受体的方法，其中所述方法包括：提供具有多个靶细胞(例如，哺乳动物细胞)的基底；使所述基底上的所述靶细胞与CD8+T细胞接触；并且使用无标记光学成像来鉴定T-细胞的质量增加和/或靶细胞的质量减小，其中T细胞的质量增加和/或靶细胞的质量减小为所述T细胞具有由呈现于所述靶细胞上的抗原活化的T细胞受体的指示。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年5月24日提交的USSN61/827,378的权益 和优先权，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文。

政府资助声明

这项工作在美国国立卫生研究院的资助号：T32CA009120和 K25CA157940的资助下进行。政府享有本发明中的某些权利。

背景

CD8+T淋巴细胞介导的细胞毒性是针对病毒和癌症的适应性免 疫应答的重要组成部分，并且还参与自身免疫(Kalinski等(2006) ImmunolRes.,36:137-146；Tuma和Pamer(2002)Curr.Opin.Immunol. 14:348-353)。T细胞介导的细胞毒性通常通过靶细胞死亡或具有效应 子细胞细胞毒性能力的替代标志物来测量。规范的测定是⁵¹Cr释放测 定和ELISPOT，所述的两种测定提供了全淋巴细胞群或亚群响应的 批量测量(Hobeika等(2005)J.Immunother.28:63-72；Malyguine等 (2007)Adv.Exp.Med.Biol.601:273-284)。肽-MHC四聚体和微流体平 台的引入允许通过分析T细胞抗原特异性和细胞因子分泌来替代测 量细胞毒性(Hobeika等(2005)J.Immunother.28:63-72；Kwong等 (2009)J.Am.Chem.Soc.131:9695-9703；Ma等(2011)Nat.Med.17: 738-743)。在单个细胞水平上直接示踪T淋巴细胞介导的细胞毒性有 利于分析混合群内的细胞毒性T细胞(CTL)，这在评价针对癌细胞的 T细胞识别方面具有特定相关性。活CTL可以潜在地被培养和进一 步扩增，或针对免疫原性肽具有最佳特异性的对应T细胞受体(TCR) 可以被分子克隆用于在临床环境下使用(Rosenberg等(2008)Nat.Rev. Cancer,8:299-308)。

光学显微术允许在靶细胞识别和杀死的完全背景下直接鉴定和 示踪CTL。已经探索了光学成像方法如落射荧光共聚焦显微术、全内 反射荧光和双光子激光扫描显微术用于研究淋巴细胞活化，但通常需 要抗体或缀合蛋白标记以示踪和定量细胞(Balagopalan等(2011)Nat. Rev.Immunol.11:21-33；Delon等(2002)Immunol.Rev.189:51-63)。这 限制了对T淋巴细胞研究的适用性，其原因是与多种多样表型相关的 转导效率低以及针对体外培养过程中的衰竭或衰老产生渐进性分化， 因为这需要典型的荧光标记技术(Sauce等(2002)J.Hematother.Stem CellRes.11:929-940；Tran等(2008)J.Immunother.31:742-751)。

概述

提供了用于通过以下步骤鉴定响应于特异性靶细胞抗原的有用 T淋巴细胞的方法：1)通过细胞活化增加其质量；和/或2)通过活化增 加其质量积累速率；和/或3)通过杀死靶细胞减小靶细胞质量。使用 无标记光学成像技术(例如，LSI、横向剪切干涉测量术、数字全息显 微术等)来鉴定T细胞和/或靶细胞(具有靶抗原)的质量变化。

因此，在各种方面中，在本文中涵盖的方法可以包括但不需要限 于以下实施方案中的任何一个或多个：

实施方案1：一种鉴定响应于特异性靶细胞抗原的T细胞受体的 方法，所述方法包括：提供具有多个靶细胞的基底；使所述基底上的 所述靶细胞与CD8+T细胞接触；并且使用无标记光学成像来鉴定T- 细胞的质量增加和/或靶细胞的质量减小，其中T细胞的质量增加和/ 或靶细胞的质量减小是所述T细胞具有由呈现于所述靶细胞上的抗 原活化的T细胞受体的指示。

实施方案2：根据实施方案1所述的方法，其中检测了T细胞的 质量增加并且指示所述T细胞具有由呈现于所述靶细胞上的抗原活 化的T细胞受体。

实施方案3：根据实施方案1-2中任一项所述的方法，其中靶细 胞质量减小指示所述接触的T细胞具有由呈现于所述靶细胞上的抗 原活化的T细胞受体。

实施方案4：根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中使用 光显微术来定性地监测靶细胞的死亡。

实施方案5：根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其还包括 选择和/或分离被活化的T细胞。

实施方案6：根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其还包括 选择和培养或存储被活化的T细胞。

实施方案7：根据实施方案5-6中任一项所述的方法，其中所述 方法包括使用显微操纵器来选择活化的T细胞。

实施方案8：根据实施方案5-7中任一项所述的方法，其还包括 从选择的T细胞中克隆T细胞受体。

实施方案9：根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述 靶细胞处于静态培养基中。

实施方案10：根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述 靶细胞被设置在微通道中。

实施方案11：根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述 靶细胞被设置在基底上的微孔中。

实施方案12：根据实施方案11所述的方法，其中所述基底包括 至少10个微孔。

实施方案13：根据实施方案11所述的方法，其中所述基底包括 至少100个微孔。

实施方案14：根据实施方案11所述的方法，其中所述基底包括 至少1000个微孔。

实施方案15：根据实施方案11-14中任一项所述的方法，其中所 述T细胞被引入到所述微孔中。

实施方案16：根据实施方案15所述的方法，其中所述微孔含有 平均每个微孔约1个T细胞。

实施方案17：根据实施方案11-16中任一项所述的方法，其中所 述微孔由聚合物制成。

实施方案18：根据实施方案17所述的方法，其中所述微孔由折 射率约等于水的折射率的聚合物(例如，MY133，来自MY聚合物的 紫外可固化的聚合物)制成。

实施方案19：根据实施方案17所述的方法，其中所述微孔由 PDMS制成。

实施方案20：根据实施方案11-16中任一项所述的方法，其中所 述微孔被蚀刻到硅基底中。

实施方案21：根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所 述基底为反射的。

实施方案22：根据实施方案1-21中任一项所述的方法，其中所 述使用无标记光学成像包括检测由T-细胞质量和/或靶细胞质量的所 述变化引起的穿过所述细胞的光的相移。

实施方案23：根据实施方案22所述的方法，其中所述无标记光 学成像包括定量的相位成像显微术。

实施方案24：根据实施方案23所述的方法，其中所述无标记光 学成像包括选自由以下组成的组的方法：活细胞干涉测量术(LCI)、 数字全息术和横向剪切干涉测量术。

实施方案25：根据实施方案24所述的方法，其中所述无标记光 学成像包括活细胞干涉测量术，所述活细胞干涉测量术包括：在干涉 显微镜的观察室中提供所述基底，所述干涉显微镜被适配成测量测试 光束与参考光束之间的分数相移；使所述细胞暴露于照明波长下的测 试光束中；测量传播穿过所述细胞的所述测试光束与所述参考光束之 间的分数相移；并且使用所述分数相移或从其衍生的参数作为所述T 细胞的质量增加和/或所述靶细胞的质量减小的度量。

实施方案26：根据实施方案25所述的方法，其中在其质量变化 正被确定的所述细胞的大致上整个投影区域上对所述分数相移积分。

实施方案27：根据实施方案25所述的方法，其中所述T细胞的 质量增加和/或所述靶细胞的质量减小的所述度量被计算为参数m： 其中为所述测量的分数相移，λ为所述照明波长，并且 在整个细胞区域A上进行积分。

实施方案28：根据实施方案25所述的方法，其中所述T细胞的 质量增加和/或所述靶细胞的质量减小的所述度量被计算为 m＝k∫φλdA，其中m为细胞干质量，φλ为所述测量的相移，k为取作 5.56pg/μm³的质量换算因子，并且A为投影区域。

实施方案29：根据实施方案25-28中任一项所述的方法，其中所 述方法使用活细胞干涉测量术系统来进行，所述活细胞干涉测量术系 统包括：可操作地耦合至显微镜的检测器；含有所述基底的样品室(灌 注成像室)，所述基底包括多个微孔；以及干涉仪，所述干涉仪包括 分束器、参考镜和补偿穿过所述样品室的光程长度的参考流体室。

实施方案30：根据实施方案29所述的方法，其中所述样品室包 括至少一个被适配成在所述室内使细胞培养基循环的灌注导管。

实施方案31：根据实施方案16所述的方法，其中所述活细胞干 涉测量术系统包括被适配成处理和存储细胞的一个或多个图像的处 理器元件和记忆存储元件。

实施方案32：根据实施方案24所述的方法，其中所述无标记光 学成像包括横向剪切干涉测量术，所述横向剪切干涉测量术使用了安 装在透射白光显微镜上的四波横向剪切干涉仪。

实施方案33：根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中多 次观察所述细胞的质量以便观察所述细胞的质量在一段时期内如何 变化。

实施方案34：根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中所 述方法用来定量多个细胞的质量。

实施方案35：根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中所 述方法用来定量至少1,000个不同细胞的质量。

实施方案36：根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中所 述方法用来定量至少10,000个不同细胞的质量。

实施方案37：根据实施方案1-36中任一项所述的方法，其中所 述靶细胞包括癌细胞。

实施方案38：根据实施方案37所述的方法，其中所述靶细胞包 括选自由以下组成的组的癌症的细胞：急性淋巴母细胞性白血病 (ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、AIDS相关的癌症 (例如，卡波西肉瘤、淋巴瘤)、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典 型畸胎样/杆状肿瘤、胆管癌、肝外癌、膀胱癌、骨癌(例如，尤因肉 瘤、骨肉瘤、恶性纤维性组织细胞瘤)、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤(例 如，星形细胞瘤、脑和脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、中枢神经系统非 典型畸胎样/杆状肿瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤、中枢神经系统生 殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、乳癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴 瘤、类癌瘤(例如，儿童、胃肠)、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索癌、慢性 淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性骨髓增 生性病症、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤t-细胞淋巴瘤、管 癌例如(胆、肝外)、原位导管癌(DCIS)、胚胎性肿瘤、子宫内膜癌、 室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生 殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌(例如，眼内黑色素瘤、视网膜母细 胞瘤)、骨恶性纤维性组织细胞瘤和骨肉瘤、胆囊癌、胃部(胃)癌、胃 肠类癌瘤、胃肠间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤(例如，卵巢癌、睾丸 癌、颅外癌、性腺外癌、中枢神经系统)、妊娠性滋养细胞肿瘤、脑 干癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞性(肝)癌、组织细胞 增多病、朗格汉斯细胞癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、 胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、卡波西肉瘤、肾癌(例如，肾 细胞、威尔姆斯氏肿瘤和其他肾肿瘤)、朗格汉斯细胞组织细胞增多 病、喉癌、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、 慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞 白血病、唇癌和口腔癌、肝癌(原发性)、原位小叶癌(LCIS)、肺癌(例 如，儿童、非小细胞、小细胞)、淋巴瘤(例如，AIDS相关、伯基特(例 如，非霍奇金淋巴瘤)、皮肤T-细胞(例如，蕈样真菌病、西泽里综合 征)、霍奇金、非霍奇金、原发性中枢神经系统(CNS))、巨球蛋白血 症(沃尔丹斯特伦)、男性乳癌、骨恶性纤维性组织细胞 瘤和骨肉瘤、黑色素瘤(例如，儿童、眼内(眼睛))、梅克尔细胞癌(merkel cellcarcinoma)、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线道癌、口癌、多发 性内分泌腺瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、蕈样真菌 病、骨髓增生异常综合征、慢性髓细胞性白血病(CML)、多发性骨髓 瘤、鼻腔癌和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、唇癌和口咽 癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞肿瘤)、 乳头瘤病、副神经节瘤、鼻窦癌和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽 癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、浆细胞赘生物、胸膜肺母细胞瘤、原发性 中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾 盂和输尿管移行细胞癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(例如，尤因、 卡波西、骨肉瘤、横纹肌肉瘤(rhadomyosarcoma)、软组织、子宫)、 西泽里综合征、皮肤癌(例如，黑色素瘤、梅克尔细胞癌、基底细胞 瘤、非黑色素瘤)、小肠癌、鳞状细胞癌、具有潜隐性原发性的鳞状 颈癌、胃(胃部)癌、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、 滋养细胞肿瘤、输尿管癌和肾盂癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜癌、 子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症以及威尔姆 斯氏肿瘤。

实施方案39：根据实施方案37所述的方法，其中所述靶细胞包 括选自由以下组成的组的癌症的细胞：乳癌、中枢神经系统癌、宫颈 癌、结肠直肠癌、睾丸癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、软 组织肉瘤、睾丸癌和甲状腺癌。

实施方案40：根据实施方案37所述的方法，其中所述靶细胞包 括癌症干细胞。

实施方案41：根据实施方案37所述的方法，其中所述靶细胞包 括转移性细胞。

实施方案42：根据实施方案1-36中任一项所述的方法，其中所 述靶细胞包括被病原体感染的细胞。

实施方案43：根据实施方案42所述的方法，其中所述靶细胞包 括被选自由以下组成的组的病原体感染的细胞：细菌、真菌和病毒。

实施方案44：根据实施方案1-36中任一项所述的方法，其中所 述靶细胞包括被表达异源蛋白质或肽的构建体转染的重组细胞。

附图简述

图1示意性地示出了活细胞干涉仪(LCI)的一个实施方案。在这 个说明性、但非限制性的实施方案中，LCI包括米切尔森型 (Michelson-type)干涉显微镜，所述米切尔森型干涉显微镜比较了参考 细胞的光学厚度与放置于观察室中的样品的光学厚度。悬浮在观察室 中的是反射的基底，从而允许LCI对可穿透细胞上的光学厚度做出测 量。显微镜物镜和观察室的相对位置可以通过计算机来控制并且可以 在三维上可平移，从而允许快速、自动化的图像获取。活细胞干涉仪 能够测量粘附细胞和非粘附细胞的质量。

图2A和图2B示出了LCI测量T细胞和靶细胞的质量。图2A： 用于T细胞质量测量实验的工作流程。供体外周血单核细胞(PBMC) 被MART1特异性F5TCR转导并且富集了CD8+T细胞。通过流式 细胞术来分析这些T细胞的亚组以便确认转导效率大于50％。剩余 细胞用表达MART1、HLA匹配(或错配对照)的M202靶细胞在LCI 上成像。图2B：显示活化的F5-转导的CD8+T细胞、数个未响应的 T细胞和干燥靶细胞中的相移和质量分布的样品LCI数据。

图3，图A-E示出了CD8+富集的PBMC的转导。(A)显示供体 PBMC的通常转导效率的转导的T细胞的流式细胞术数据。(图B)显 示CD8+T-细胞富集效率的富含CD8+类群的流式细胞术。(图C)证实 在表达与HLA匹配的MART1的M202细胞共培养之后F5转导的富 含CD8+的T细胞活化的IFNg释放测定。阴性对照M207细胞表达 MART1，但为HLA错配的。(图D)展现出在干涉仪载台上靶细胞成 活力的示于(图E)中的健康M202细胞的质量对比时间。

图4，图A-M示出了在T细胞介导的细胞毒性过程中对靶细胞 死亡的LCI示踪。图A-H：在成像开始之后立即发生的单个细胞毒性 事件的图像(t＝0为将CTL放置在靶细胞上之后约30min)。图A-D： 在展现出CTL介导的靶细胞杀死的成像t＝0h和t＝5h的强度图像。 图A和图C中的方框指示图B和图D图像中的亚区。图B和图D 中的箭头指示由在(图E-I)中质量图谱表征(massprofiling)示踪的靶细 胞。图E：在成像开始时，在与靶细胞持久接触启动之后的所选择的 靶细胞的LCI质量图谱。图F-H：干燥靶细胞的LCI质量图谱。图I： 示于图E-H中的靶细胞的测量的总质量对比时间。图J：随时间推移 杀死的靶细胞对比健康靶细胞的归一化质量。归一化质量为质量除以 初始质量。健康细胞显示经过4h，归一化质量粗略增加15％(蓝线指 示n＝311个健康M202细胞的平均值，灰色区指示+/-SD)。杀死的 靶细胞(红线)显示经过1-4h，质量减小20％至60％。图K：在成像 18h之后示于图A和图C中的载台位置的强度图像，显示靶细胞接 近完全死亡。图L：在涂有未转导的(F5-)CD8+T细胞的M202细胞 成像18h之后载台的强度图像，显示涂有非特异性T细胞的靶细胞 成活力。图M：用未转导的对照CTL处理的n＝2058个健康M202 细胞的归一化质量对比时间，显示经过4h质量粗略增加15％。

图5，图A-F示出了在T细胞介导的细胞毒性过程中对CTL质 量和质量积累速率的LCI测量。图A：活化的CTL和对应的靶细胞 的质量对比时间，t＝0h为细胞死亡开始时靶细胞从基底脱离的点。 CTL+靶细胞是指帧中的这两种细胞的总质量，在所述帧中它们不会 被分开测量。图B：10个CTL介导的细胞毒性事件的归一化质量对 比时间。相对于靶细胞形态变化时的质量归一化CTL质量，所述靶 细胞形态变化的时候被用作所有迹线的t＝0h点。灰线显示用于确 定质量积累速率的最佳拟合线。图C：在细胞毒性事件之前、在细胞 毒性事件的前100分钟中以及在细胞毒性事件的前100分钟之后的 CTL的平均质量积累速率，表明在细胞毒性事件的前100分钟中质量 积累增加约4倍。图D：9个未响应的T细胞和1个细胞毒性T细胞 的LCI图像，说明质量相差约3倍。白色箭头指示活化的T细胞， 如通过在与靶细胞持久接触之后示踪这种细胞和随后的靶细胞死亡 所确定。图E：116个活化的CTL的平均质量比未响应的对照的平均 质量大约2.8倍。图F：活化的CTL的平均面积仅比未活化的对照大 约1.4倍并且在95％置信水平上不显著，从而表明LCI质量测量用于 确定CTL活化的实用性。C中的误差棒显示95％的置信区间。E和F 中的误差棒显示+/-SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<10^-3。act＝ 活化的/细胞毒性的116个细胞，n＝3次实验，unact＝未活化的/未响 应的359个细胞，n＝3次实验。F5-＝未转导的F5阴性对照实验，530 个细胞，n＝2次实验。PC3＝PC3细胞，HLA错配的不相关抗原对 照，3015个细胞，n＝3次实验。

图6A-图6F显示来自四图影像的图像，这四个图影像显示了经 过由LCI观察的5小时过程中被细胞毒性T细胞(CD8+、F5TCR转 导的)杀死的靶M202细胞的强度图像、质量分布图像和质量对比时 间。图6A：时间0；图6B：时间1小时；图6C：时间2小时；图 6D：时间3小时；图6E：时间4小时；图6F：时间5小时。

图7，图A-D示出对于对照靶细胞生长条件的平均、归一化的质 量对比时间曲线图，从而显示在LCI载台上有力生长和T细胞介导 的细胞毒性的特异性。图A：在用F5TCR转导的CD8+T细胞处理 过程中的未受影响的M202细胞(n＝632)。图B：在用F5TCR转导 的CD8+T细胞处理之前的M202细胞(n＝117)。图C：在用F5TCR 阴性的CD8+T细胞处理的M202细胞(n＝2058)。图D：用F5TCR 转导的CD8+T细胞处理的抗原不相关的PC-3前列腺癌细胞(n＝ 1006)。线条显示平均、归一化的质量对比时间(相对于第一时间点处 的质量归一化)。阴影区显示平均值+/-SD。

图8，图A-C示出未响应的T细胞的平均、归一化的质量对比时 间，从而显示在LCI载台上平稳生长。图A：涂有M202靶细胞的未 响应的F5TCR转导的CD8+T细胞(n＝101)。图B：涂有M202靶细 胞的未转导的CD8+T细胞(n＝146)。图C：涂有抗原不相关的PC-3 前列腺癌靶细胞的F5TCR转导的CD8+T细胞(n＝950)。

图9，图A-H示出在成像18h之后在干涉仪载台上的细胞的强 度图像，从而显示典型的靶细胞条件。左列显示完整的图像帧，右列 显示完整的图像帧的亚组。图A-(D：涂有F5TCR转导的CD8+T细 胞的M202靶细胞，显示靶细胞接近完全死亡。为了比较，(图A和 图B)示出与图3，图A-F中相同的视野。图C和图D示出单个活细 胞。图E和图F：涂有未转导的CD8+T细胞的M202靶细胞，显示 在成像18h之后在载台上的存活力和对于T细胞介导的细胞毒性的 同源TCR需要。图G和图H：涂有F5TCR转导的CD8+T细胞的 抗原不相关的PC-3前列腺癌靶细胞，显示F5TCR特异性。

图10，图A-J示出对于如在图5，图A中的CTL和对应的靶细 胞的质量对比时间曲线图。t＝0h是在细胞死亡开始时靶细胞从基底 脱离的点。CTL+靶细胞是指帧中的这两种细胞的总质量，在所述帧 中它们不会被单独测量，其原因通常为CTL与靶细胞之间的重叠。

相对于对照实验，图11A活化的T细胞和未响应的T细胞的质 量直方图和图11B活化的T细胞和未响应的T细胞的面积直方图。 活化的＝活化的/细胞毒性的F5TCR转导的T细胞，116个细胞，n＝ 3次实验。未活化的＝未活化的/未响应的F5TCR转导的T细胞，359 个细胞，n＝3次实验。F5neg＝涂有M202靶细胞的未转导的F5TCR 阴性的T细胞，530个T细胞，n＝2次实验。PC3＝涂有HLA错配 的抗原不相关PC-3前列腺癌细胞的F5TCR转导的T细胞，3,015个 T细胞，n＝3次实验。

图12示出用于分离T细胞的基底上的多个微孔的示意性说明。

详述

出于各种原因，鉴定针对已知或未知抗原的T细胞受体(TCR)是 癌症免疫疗法发展中的主要瓶颈，所述原因包括针对自体抗原的TCR 频率低、所需的TCR亲和力低以及每个患者可供使用的组织量少。 测量T细胞响应的现有方法依赖于批量或替代测定，不直接确定T 细胞介导的细胞毒性的有效性，并且对分离这些罕见的T细胞效率低 并且易出错。

本文描述了用于鉴定、分离和表征针对所需的抗原具有特异性的 所需的T淋巴细胞的改进方法。在各种实施方案中，所述方法使用了 无标记光学成像来鉴定细胞质量变化(例如，T细胞的质量增加和/或 靶细胞的质量减小)作为当使用具有同源抗原的靶细胞呈递T细胞时 T细胞活化的指示。

在各种实施方案中，提供了基底，在所述基底上设置多个靶细胞 (例如，癌细胞、被病原体感染的细胞、表达特征性标志物的细胞、 被构建体转染以重组表达蛋白质或肽的细胞等)。使靶细胞与细胞毒 性T淋巴细胞(CTL)接触，并且具有识别由靶细胞递呈的抗原/被由靶 细胞递呈的抗原活化的T细胞受体的那些CTL增加其质量。当靶细 胞被杀死时，所述细胞显示质量减小。因此，T细胞的质量增加和/ 或靶细胞的质量减小是T细胞具有由呈现于靶细胞上的抗原活化的T 细胞受体的指示。

通过使用例如本文所描述的无标记光学成像方法示踪T细胞和 靶细胞质量变化，所述方法允许直接测量在T细胞介导的细胞毒性过 程中的靶细胞和响应T细胞以促进TCR克隆用于针对癌症的适应性 免疫疗法。这些方法可以类似地用来鉴定由被病原体感染的细胞(例 如，被病毒、细菌、真菌等感染的细胞)活化的T细胞，鉴定表达(例 如，重组表达)特定肽或蛋白质的细胞等。

更确切来说，在各种实施方案中，本文描述的方法可以被利用以 通过以下步骤来鉴定响应于特异性靶细胞抗原的有用T淋巴细胞：1) 通过细胞活化增加其质量；和/或2)通过活化增加其质量积累速率； 和/或3)通过杀死靶细胞减小靶细胞质量。这是对现有技术的改进， 因为在单个细胞水平上直接定量了复杂群中的细胞毒性T淋巴细胞 的响应。

在各种实施方案中，使用各种干涉测量的和/或定量的相位成像 显微术技术来确定细胞质量的变化。说明性、但非限制性的成像方法 包括但不限于活细胞干涉测量术(LCI)、数字全息术和横向剪切干涉 测量术。然而，许多显微术系统和方法可以被适配用于与本文描述的 方法一起使用。因此，某些实施方案可以使用扫描光学显微镜、共聚 焦显微镜等。描述可以被适配用于与本文描述的方法一起使用的光学 图谱表征方法和材料的出版物的说明性和非限制性列表包括，但不限 于美国专利申请No.：2010/0284016；2005/0248770；2005/0225769； 2005/0200856；2005/0195405；2005/0122527；2005/0088663； 2004/0252310；2005/0117165；2003/0234936；2004/0066520； 2008/0018966；2005/0167578等。

活细胞干涉测量术(或另一种定量相成像技术，包括数字全息显 微术、连接至具有活细胞成像能力的普通显微镜的横向剪切干涉测量 照相机等)可以用来对靶细胞和候选CTL的共培养物的质量响应进行 光学作图。在某些实施方案中，对设置在基底上的靶细胞进行筛选。 在某些实施方案中，可以在微孔阵列(例如，包括大于100个、或大 于1000个或大于10,000个微孔的阵列)上进行筛选，所述微孔通过蚀 刻到基底中或在聚合物(例如，PDMS、折射率约等于水的折射率的聚 合物如MY133，来自MY聚合物的紫外可固化聚合物等)中形成而制 成。在某些实施方案中，在具有约1,000或5,000个、或10,000至15,000 个或20,000个或25,000个在PDMS或MY133中微制作的微孔的阵 列上进行筛选(参见，例如图12)。

在LCI的某些实施方案中，靶细胞(或含有靶细胞的微孔)被设置 在反射基底(例如，反射硅基底)上。靶细胞可以在这种基底上和/或在 微孔中生长。然后可以添加(例如，以约每孔一个CD8+细胞的密度接 种于装置上)T细胞(例如，CD8+T细胞)。

微孔结构允许在细胞上灌注培养基而不允许T细胞漂浮出显微 镜视野。在某些实施方案中，如上所指示，特别在细胞生长在静态培 养基中的情况下微孔可以省略。

在某些实施方案中，对于靶细胞的筛选可以包括以下三个步骤中 的一个或多个以减少假阳性，所述假阳性将对TCR克隆努力带来不 必要的负担：

1.使用显微镜强度图像定性地监测靶细胞的死亡；和/或

2.检查靶细胞的质量减小动力学以确认其与细胞毒性事件一致； 和/或

3.检查活化T细胞的质量增加动力学以确认其行为与活化T细 胞的行为一致。

在某些实施方案中，可以例如使用显微操纵器将通过这种筛选方 法鉴定的靶CTLS从微孔中去除，并且存储用于TCR克隆或下游分 析，和/或可以在数据库中记录。

活细胞干涉测量术。

在某些实施方案中，使用活细胞干涉测量术(LCI)来检测T细胞 和/或靶细胞的质量变化。活细胞干涉测量术(LCI)为在数小时内定量 全细胞质量响应的无标记定量的相位显微术技术，并且独特地适于患 者样品以针对已知或未知抗原鉴定TCR。简单来说，当光穿过细胞 时光与物质相互作用使光变慢，从而产生相位上可测量的位移。通过 定量穿过整个细胞的这种相移，可以非常精确地测定细胞的质量。已 经显示LCI可以用来同时对在控制的培养条件下的成百上千的细胞 的质量响应或质量积累速率进行图谱表征(参见，例如PCT公开No： WO2013019984A1(PCT/US2012/049388))。在这里，我们使用了LCI 作为平台来在成千上万的靶细胞通过候选细胞毒性T细胞(CTL)作用 时探询所述靶细胞。如在图2-图5中所示，LCI的灵敏度能够使得基 于其对靶细胞质量(当靶细胞死亡时靶细胞质量减小)和在活化过程 中CTL本身质量(质量增加)的影响来鉴定CTL。LCI的高通量性质能 够使得鉴定各个CTL作为用于TCR克隆的靶标。

这种方法阐明了T细胞介导的细胞毒性的基本原则，包括在T 细胞响应过程中的T细胞质量积累的动力学和可变性以及由于T细 胞介导的细胞毒性而引起的靶细胞质量减小的动力学和可变性。

这种方法还提供了直接鉴定CTL而无需使用替代测定的通用平 台。通过直接测量活化过程中的淋巴细胞的质量响应，所述系统基于 关键生物物理参数如活化过程中的质量增加来提供广泛鉴定和选择 目标淋巴细胞的平台。

活细胞干涉测量术(LCI)为测量全细胞响应的无标记光学显微术 技术。在某些实施方案中，LCI使用了米切尔森型干涉仪来比较样品 室中的活细胞的光学厚度与参考室中的流体的光学厚度，并且还定量 了细胞与其周围培养基之间的光学厚度差(Reed等(2011)Biophys.J. 101:1025-1031；Reed等(2008)ACSNano,2:841-846)(参见，例如图 1)。由于光与细胞生物质的相互作用所导致的光学厚度差与细胞的材 料密度成线性比例(Ross(1967)Phasecontrastandinterference microscopyforcellbiologists.London,:EdwardArnold,xxi,第238页)。 基于这种相互作用，细胞质量可以与测量的穿过每个细胞的光的相位 延迟相关，其中在总细胞质量上具有2％精确度(Reed等(2011)Biophys. J.101:1025-1031；Reed等(2008)ACSNano,2:841-846；Ross(1967) Phasecontrastandinterferencemicroscopyforcellbiologists.London,: EdwardArnold,xxi,第238页)。实际上，在成像1-5小时内的每个成 像位置同时产生100-400个细胞的质量和质量积累或损失速率的测量 值(Reed等(2011)Biophys.J.101:1025-1031)。针对每2-5分钟自动化 测量以允许在20-50个成像位置处在细胞毒性事件过程中的精确示踪 和质量测定，这种技术可以定量2,000至20,000个细胞的质量。

如在实施例中所说明，在LCI中，在成像收集之后，可校正光相 移数据的相位包裹误差，所述相位包裹误差由定量相位成像中固有的 整数波长模糊度引起(Ghiglia和Pritt,(1998)Two-DimensionalPhase Unwrapping.Theory,Algorithms,andSoftware:JohnWiley&Sons.)。结 果是可以换算成局部干质量密度的图的越过每个细胞的相移绘图(图 2B)。细胞的总干质量可以被定量为局部密度的总和(Reed等(2011) Biophys.J.101:1025-1031；Ross(1967)Phasecontrastandinterference microscopyforcellbiologists.London,:EdwardArnold,xxi,第238页； Mir等(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108:13124-13129)：

m＝k∫φdA，(1)

其中m为细胞干质量，φλ为测量的相移，k为质量换算因子，并 且A为投影区域。在某些实施方案中，作为每单位折射率变化的密度 变化的度量(Δρ/Δn)的质量换算因子(Barer(1952)Nature169: 366-367；Mir等(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108:13124-13129) 可以取作k＝5.56pg/μm³(Ross(1967)Phasecontrastandinterference microscopyforcellbiologists.London,:EdwardArnold,xxi,第238页)。 这个参数k可以被测量为相对于水的折射率的折射率变化，因此以此 方式测量的细胞质量是细胞干质量，或除了水以外的细胞内所有物质 的质量。

然而，将认识到不需要计算细胞的质量(m)。简单地检测质量变 化可以为本文描述的方法提供足够的读数。在某些实施方案中，这可 以通过相移(在细胞的整个投影区域(A)上积分的相移)的测量值，或作 为来源于任何这些测量值的多于一个参数来简单提供。

本文描述的方法在单个细胞水平上直接示踪了T淋巴细胞介导 的细胞毒性，而不需要通过定量各个CTL和其同源靶细胞的质量来 标记。使用质量数据，在混合群内随时间推移鉴定和评估了单个细胞 毒性事件，以便确认各个T细胞介导的细胞毒性事件。作为概念的证 明，我们展现出对针对由T淋巴细胞识别的黑色素抗原(MART1)具有 特异性的高达2,000个单独CTL的示踪，所述MART1对人白细胞抗 原(HLA)匹配的MART1+靶细胞响应(Johnson等(2006)J.Immunol. 177:6548-6559)(参见，实施例1)。通过LCI对靶细胞成像以建立基 线质量积累速率。然后将CTL放置于靶细胞上，并且各个细胞毒性 事件被鉴定为在与对应的T细胞接触之后靶细胞质量特征性减小。

已经充分确定的是T细胞在活化过程中尺寸增加(Rathmell等 (2000)Mol.Cell,6:683-692)。这种先前观察到的尺寸增加可以由与生 物质增加相反的细胞内的溶质浓度或重量摩尔渗透压浓度变化引起 (Tzur等(2011)PLoSOne,6:e16053)。直到现在，这种模糊度还尚未 解决，但这个结果为单一CTL活化机制提供了有价值的见解。使用 本文描述的方法，可以确定的是对应于同源靶细胞的CTL的尺寸增 加是由于生物质增加，并且所述生物质测量值为活化的T细胞提供有 力鉴定。测量单一CTL的质量的能力开启了数个潜在的下游应用， 包括除了潜在用于适应性免疫疗法方案的CTL分析以外的属于代谢 或分化状态的T细胞生物研究。

在通常的实施方案中，LCI方法可以使用活细胞干涉测量术系统 来进行，所述活细胞干涉测量术系统包括可操作地耦合至显微镜的检 测器、包括被适配成含有细胞的观察室的样品组件、包含被适配成含 有参考细胞的参考室的参考组件以及用于使来自光源的光束分成测 试束和参考束的分束器。在某些实施方案中，观察室包括至少一个被 适配成在室内使细胞培养基循环的灌注导管。在一些实施方案中，活 细胞干涉测量术系统包括被适配成处理和存储细胞的一个或多个图 像的处理器元件和记忆存储元件。在实施方案中，在多个时间下确定 一个或多个细胞的质量以便观察细胞质量在一段时期内如何变化，并 且任选地提供此类变化的动力学。任选地，例如，随时间推移观察细 胞的质量性质的变化，以便观察时间性的质量图谱(例如，细胞质量 在一段时期内变化的特殊方式)。某些实施方案包括比较观察到的时 间性质量图谱与时间性质量图谱的数据库的步骤，其中时间性质量图 谱的数据库被选择成包括特征在于T细胞活化和/或靶细胞杀死的时 间性质量图谱。

横向剪切干涉测量术。

在某些实施方案中，可以使用横向剪切干涉测量术来确定细胞尺 寸的变化(例如，通过细胞尺寸变化引入的光学相移)。横向剪切干涉 测量术是用来在一个方向上测量相位梯度的技术。入射波前被复制成 两个相同但倾斜的波前。在传播之后，例如使用CCD照相机记录它 们的相互干涉图案。借助于在干涉图条纹频率周围的傅里叶去卷积， 从条纹变形中恢复相位梯度。

多波干涉测量术(Primot和Sogno(1995)J.Opt.Soc.Am.A,12(12): 2679)将这个原则延伸至多于一个梯度方向。在四波横向剪切干涉测 量术(QWLSI)中，通过特殊的2D衍射光栅创建四个复制品。在这种 情况下，测量沿着两个垂直方向的两个梯度并且然后积分以确定场强 度和相位(Primot和Guérineau(2000)Appl.Opt.39(31),5715-5720)。可 使用波或几何光学中断干涉图变形。Bon等(2009)OpticsExpress 17(15):13080-13094)描述了使用四波横向剪切干涉测量术用于活细 胞的定量相位显微术的方法。另外，在常规显微镜上实施QWLSI的 装置是商业上可获得的(参见，例如来自PhasicsS.A.,Marseille,France 的)。

数字全息显微术

数字全息显微术提供了光程长度分布的定量测量，所述光程长度 分布允许活细胞在具有衍射限制的横向分辨率和子波长轴向准确度 的情况下被描述(参见，例如Marquet等(2005)Opt.Lett.30(5): 468-470)。作为定量相位对比成像方法的数字全息显微术是一种检测 与穿过所测试的对象的光相关的相位延迟的光学干涉测量术。当穿过 相对可穿透的样品时，光的强度变化非常小，而穿过样品的光的速度 加快或减缓并且带来对应的相位变化。相位延迟或提前取决于样品与 周围环境之间的折射率关系。因为相位信息与光程长度(光学厚度)成 比例，所以可以计算样品的深度图谱和/或尺寸/质量。因此，数字全 息术特别适用于测量相位目标如活细胞和微光学元件。

在DHM中，源自目标的光波前信息被数字记录为全息图，从所 述全息图中计算机通过使用数值重建算法来计算目标图像。

为了创建干涉图案(即全息图)，在DHM中，使用相干(单色)光 源(例如，激光器)照亮细胞。激光被分成目标束和参考束。扩展的目 标束照亮样品以创建目标波前。在通过显微镜物镜收集目标波前之 后，通过分束器将目标波前和参考波前结合以干涉并且创建全息图。 使用数字记录的全息图，计算机用作数字透镜并且计算来源于其中的 可视图像或信息(例如，细胞质量)。

适合的DHM方法包括，但不限于离轴菲涅耳DHM、傅里叶 DHM、图像平面DHM、串联DHM、伽柏DHM以及相移数字全息 术。

例如由Pan等(2012)OpticsExpress,20(10):11496-11505,2012； Zhang等(2011)ChinesePhysicsLetters,28(11):114209；Kemper等 (2006)BiophotonicsandNewTherapyFrontiers,6191:61910T-1-8和 Wang等(2013)ComputationalandMathematicalMethodsinMedicine 2013,文章ID715843描述了细胞的数字全息显微术。

实施例

提供以下实施例来说明，但并非限制所要求保护的发明。

实施例1

定量抗原特异性细胞毒性过程中的单个CD8+T细胞的生物质变化

定量细胞毒性T细胞响应的现有方法依赖于妨碍直接鉴定目标 单一活化T细胞的批量测量或替代测量。单个细胞显微术或流式细胞 术方法通常依赖于荧光标记，这限制了对原代细胞如人来源的T淋巴 细胞的适用性。在这里，我们引入一种定量方法以使用活细胞干涉测 量术(LCI)(维持细胞存活力的无标记显微术技术)来在混合细胞群内 示踪单个T淋巴细胞介导的细胞毒性事件。LCI通过测量由光与细胞 内生物质相互作用引起的相移来定量单个细胞内的质量分布。使用 LCI，我们对杀死同源靶细胞的细胞毒性T细胞成像。除了在被T细 胞攻击后经过1-4h特征性靶细胞质量减小20％-60％以外，T细胞质 量相对于未响应的T细胞质量显著增加2-3倍。对CD8+T和靶细胞 质量变化的直接无标记测量提供了T细胞活化的动力学定量评价和 鉴定用于癌症免疫疗法中的应用的特异性活化的患者来源的T细胞 的相对快速的方法。

材料和方法

细胞系和PBMC。

使用DMEM或RPMI1640培养基，将M202、M207(Sondergaard 等(2010)J.TranslationalMed.8:39)PC-3、PG13和293T细胞(ATCC) 常规维持在37℃下在8％CO₂中，所述培养基补充有5％FBS、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mmol/l-谷氨酰胺。从UCLA的 AIDS研究病毒学核心实验室中心获得来源于匿名健康供体的HLA A2.1+PBMC，并且在收集之后冷冻。在逆转录病毒感染之前，在完 全培养基(CM)加上抗CD3/2/28珠粒中使解冻的PBMC复活，持续4 天。CM由AIM-V培养基(Invitrogen,USA)组成，补充有25mmol/L HEPES、5.5x10-5mol/L[β]-巯基乙醇和300IU/mLIL-2。在所有成 像实验之前，使PBMC培养总共7-10天。在LCI成像平台上，将细 胞维持在完全培养基中。

MART1特异性CD8+T细胞的产生。

从被修饰成产生由具有针对MART1ELAGIGLTV肽片段的特异 性的F5TCR组成的逆转录病毒载体的PG13细胞收集F5逆转录病 毒，所述F5逆转录病毒由用于细胞毒性实验中的M202和M207细 胞系表达。简单来说，用包装载体pCL-Eco和基于MSCV的逆转录 病毒载体RV-MSCV-F5MART1TCR转染293T细胞。所得到的上清 液用来转导鼠PG13逆转录病毒包装细胞系用于长臂猿白血病病毒 (GaLV)假型被膜产生。根据制造商的方案，在Retronectin(Takara, Japan)存在下用含有PG13上清液的逆转录病毒感染PBMC。在感染 后48-72小时，将细胞用MART1特异性四聚体(BeckmanCoulter,USA) 染色并且通过流式细胞术(FACSCanto,BDBiosciences,USA)分析。通 过阴性富集(StemCellTechnologies,USA)分离CD8+T细胞，并且通 过流式细胞术证实富集效率。

通过流式细胞术的IFNg测量。

为了证实DMF5转导的CD8+T细胞的功能特异性，在37℃和 8％CO₂下，在加湿的孵育器中在96孔平板中用200μl的完全培养基 将总共1x10⁵个T细胞与1x10⁵个靶细胞(M202或M207)共培养， 持续18小时。遵循制造商的方案(eBioscience,USA目录号 BMS8228FF)，使用人IFNgFlowCytomixSimplex试剂盒通过流式细 胞术来确定上清液中的IFN-γ的浓度。

LCI质量测量。

以约2.5x10⁴个细胞/cm²的密度，将靶细胞放置在用聚-1-赖氨酸 (Sigma)的0.01％溶液处理的20mmx20mm硅载玻片上，并且允许 其在成像实验开始之前在细胞培养孵育器中生长持续48小时。将具 有附着的靶细胞的硅载玻片放置到定制的基于温度和CO₂控制的灌 注的活细胞成像室中，并且在添加T细胞之前成像持续约1.5h。对T 细胞-靶细胞共培养物连续成像18h。基于硅基底上的靶细胞的适合 的密度选择30个成像位置，并且约每3至4分钟一次收集图像。在 20x放大倍数(数值孔径0.28)下，使用具有0.55x缩小透镜以增加视 野同时保存分辨率的改进型GT-X8光学轮廓仪(Bruker)来进行成像。 使用米切尔森型干涉仪来产生干涉条纹，所述米切尔森型干涉仪由分 束器、参考反射镜和补偿穿过样品室的光程长度的参考流体室组成。 使用相移干涉测量术(PSI)方法和来自530nm光纤耦合的LED (Thorlabs)的照明来获取图像。强度图像表示不具有米切尔森相位成 像所必要的干涉条纹的图像的平均强度。

相位展开。

为了去除在定量相位成像中固有的整数波长相位模糊度(Ghiglia 和Pritt,(1998)Two-DimensionalPhaseUnwrapping.Theory,Algorithms, andSoftware:JohnWiley&Sons.)，我们使用在Matlab(Mathworks)中 实施的自定义脚本进行相位展开。首先，我们基于Flynn最小不连续 方法进行展开(同上)。接下来，通过手动地对相位数据的约200个子 图像施加单一波长校正来构建训练数据集，其被选择目标靶细胞和T 细胞的外观。这个训练数据集用于线性判别分析(LDA)中以基于16 组图像统计学鉴定落在相位包裹区边界上的像素，包括原始图像本 身、计算的强度图像和施加到包裹相位图像上的各种边缘寻找滤波器 的结果。在LDA之后进行遗传优化以提炼用于确定相位包裹区边界 的LDA结果和分水岭算法阈值。由施加到最终LDA结果的分水岭算 法确定的边界内区域通过一个波长的相移来移动(校正)，并且使用3 的内核尺寸来进行中值滤波。

质量示踪。

使用在Matlab(Mathworks)中实施的自定义脚本来进行单个细胞 质量测量。简单来说，在基于Otsu阈限法的图像分割之前对相位校 正的图像进行高斯低通滤波。最后，基于Crocker和Grier(1996) Science179:12的颗粒示踪算法，使用DanielBlair和EricDufresne 的适配用于Matlab的颗粒示踪代码来示踪由图像分割鉴定的目标。 基于定量相位图像中的200像素邻近地区，使用局部自适应阈值来确 定细胞区域。

统计学。

使用具有不等方差和样本容量的双尾Welch学生T检验来进行统 计学分析。

结果

用于定量成像T细胞介导的细胞毒性的LCI

我们通过建立针对HLA匹配的靶细胞系的健康人供体CD8+富 集的淋巴细胞的抗原特异性来开发用于分析细胞毒性事件的模型系 统。用F5抗MART1TCR转导外周血单核细胞(PBMC)，所述F5抗 MART1TCR是针对MART1具有特异性的高亲和力TCR(Johnson等 (2006)J.Immunol.177:6548-6559)。在LCI载台上在活细胞观察室中 共培养表达MART1的靶细胞和抗原定义的CD8+富集的T细胞，并 且成像持续18h的时期。(图2A)。通过在8％CO₂下连续灌注培养基 来控制观察室的温度并且维持pH。在成像收集之后，对于相位包裹 误差校正光相移数据，所述相位包裹误差由定量相位成像中固有的整 数波长模糊度引起(Ghiglia和Pritt,(1998)Two-DimensionalPhase Unwrapping:Theory,Algorithms,andSoftware:JohnWiley&Sons.)。结 果是可以转化成局部干重密度图的越过每个细胞的相移图(图2B)。细 胞的总干质量被定量为局部密度的总和(Reed等(2011)Biophys.J.101: 1025-1031；Ross(1967)Phasecontrastandinterferencemicroscopyfor cellbiologists.London,:EdwardArnold,xxi,第238页；Mir等(2011) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108:13124-13129)：

m＝k∫φλdA，(1)

其中m为细胞干质量，φλ为测量的相移，k为质量换算因子，并 且A为投影区域。作为每单位折射率变化的密度变化的度量(Δρ/Δn) 的质量换算因子(Barer(1952)Nature169:366-367；Mir等(2011)Proc. Natl.Acad.Sci.USA,108:13124-13129),取作k＝5.56pg/μm³(Ross (1967)Phasecontrastandinterferencemicroscopyforcellbiologists. London,:EdwardArnold,xxi,第238页)。这个参数k被测量为相对于 水的折射率的折射率变化，因此以此方式测量的细胞质量是细胞干质 量，或除了水以外的细胞内所有物质的质量。针对这个方程，在(图 2B)中的活化T细胞的测量的干质量为240pg，靶细胞质量为840pg 并且未活化的T细胞的平均干质量为65pg。

抗原特异性T细胞和在成像平台上存活力的维持

为了产生抗原定义的CTL，我们通过逆转录病毒转导用F5TCR 感染HLAA2.1+健康供体PBMC，并且通过磁性分离以去除磁性标记 的非CD8+细胞来富集CD8+细胞(图3，图A-B)。虽然CD8+T细胞 具有内源性TCR，但F5抗MART1TCR的异位表达导致外源性α链 和β链的过表达以允许优选配对和表面表达。大多数分离的细胞为其 中在表面上75％表达F5TCR的CD8+，如成像之前通过MART1肽 四聚体染色所确定。我们测量了在18h共培养时期之后的上清液中 的干扰素γ(IFNg)积累，以便证实F5重新引导的CD8+T细胞对同源 靶细胞有特异性。通过流式细胞术分析的基于珠粒的免疫测定的结果 表明，与和HLA-错配的对照细胞系共培养相比，当与HLA匹配的 MART1+M202靶细胞共培养时从F5转导的CTL中释放的IFNg显 著高3.5倍(图3，图C)。

在开始每个实验之前在标准培养基中对靶细胞成像持续1.5小 时，以便确认活细胞培养物成像平台在不存在CTL的情况下维持靶 细胞的存活力。M202靶细胞显示正的质量积累速率，从而表明健康 的群和细胞存活力的维持。(图3，图D-E；图7，图B)。对照实验展 现出在长时间成像时期中T细胞和靶细胞存活力的维持(图7和图8)。

杀死的靶细胞的质量减小

在靶细胞对照测量之后1.5h，将F5MART1反应性CTL(图3， 图A-B)添加至活细胞成像室中并且连续成像18h。这个实验持续时 间类似于通常通过ELISPOT(Hobeika等(2005)J.Immunother.28: 63-72)测量T细胞活性所需要的时期。通过定性分析强度图像数据， 将杀死各个靶细胞的单一CTL鉴定为在与CTL长时间接触之后靶细 胞外观的变化(图4，图A-D)。尽管在更宽泛的群内存在非特异性或 未响应性T细胞，但细胞毒性事件为可检测的。LCI提供了T细胞介 导的细胞毒性事件期间靶细胞内的质量分布的定量图(图4，图E-H)。 可以对来自连续图像帧的这些质量分布积分以得到随时间推移的靶 细胞质量的测量值(方程1和图4，图I)。由于CTL的识别而引起的 各个细胞毒性事件通过在与对应的CTL长时间接触(30m至2h)之后 靶细胞质量特征性减小来确认(图4，图I和在图6A-6F中示出的影片、 图像)。

与没有被CTL杀死时经过4h总靶细胞质量增加15％相比，当 被CTL成功攻击时经过1-4h的时期靶细胞质量减小20％至60％(图 4，图I-J)。尽管在T细胞与靶细胞之间接触，但在使用HLA错配的 抗原不相关的靶细胞(缺乏MART1)或非特异性T细胞的对照实验中 不存在响应(图4，图K-M；图7，图C-D，以及图9，图C-D)。这表 明靶细胞死亡是由于存在抗原特异性的CTL，并且由于T细胞介导 的细胞毒性而引起的靶细胞质量减小的速率和程度是使用LCI可直 接定量的。在前30min内T细胞介导的细胞毒性为明显的并且在添 加CTL之后的前2-4h内得以确认，从而表明LCI方法在测量T细 胞介导的细胞毒性方面的速度(影片图6A-6F)。至添加CTL之后18h， 估计有95％的靶细胞死亡，而在18h时大于95％的对照靶细胞看起 来似乎健康(图4，图K-L；图9)。

活化CTL的质量增加

在靶细胞质量减小的同时，至细胞毒性事件结束时，各个活化的 CTL的总体尺寸增加(图5)。可以通过其相互作用的持续时间来示踪 各个CTL和靶细胞质量(图5，图A；图10)。在图5，图B中概括了 10种此类事件的CTL质量对比时间数据，其中CTL质量相对于当在 死亡事件开始时靶细胞的形态急剧变化(“成球(balled-up)”)时的质量 归一化，这被定义为t＝0h。在通常的迹线中，靶细胞最初显示与健 康细胞的生长速率一致的质量增加(图4，图M)。在这个时期(t<0h) 中，CTL显示相对慢的生长速率(图5，图C)。然后，靶细胞“成球” 并且在经过前1-2小时质量非常快速损失之前立即从基底脱离。在这 个初始时期(约100分钟)中，T细胞质量积累速率显著增加(图5，图 C)。随着经过下一个2-5小时靶细胞质量损失和中心细胞主体压缩， T细胞的质量以慢于初始时期中的速率继续增加(图5，图C)。

质量积累速率的这种变化引起细胞质量比周围未响应的T细胞 显著高2至4倍(图5，图D)。将在每个细胞毒性事件终点处的116 个CTL的总细胞质量与在实验过程中没有杀死靶标的3,900个对照T 细胞比较。平均来说，与其非特异性或未响应性对应物相比，CTL 的质量高2.8倍(图5，图E；图11，图A)。这种质量增加持续高达4 h，所述4h是一段受活化的T细胞被洗掉(由于通过观察室连续灌注 培养基)之前的平均观察时期限制的持续时间。

计算响应对比未响应的T细胞的二维(2D)区域以确定是否存在 与总体尺寸相关的显著差异。所观察到的2D区域增加1.4倍小于总 细胞质量相差2.8倍，并且与对照相比在p<0.05水平下没有达到统 计学显著性(图5，图F；图11，图B)。这些结果显示CD8+T细胞的 质量变化是比细胞区域的变化更有力的活性指示。另外，对于球形T 细胞，所观察到的质量增加1.4倍对应于体积增加1.7倍，这基本上 低于所观察到的质量增加2.8倍。因此，这些结果表明在活化过程中 还存在T细胞密度增加，虽然用LCI测量的当前配置不可能进行密 度定量。

讨论

LCI通过对细胞毒性事件过程中的单一效应子T细胞和其影响的 靶细胞进行灵敏生物质测量提供了定量的无标记细胞毒性测定(图 2)。可以随时间推移示踪杀死的靶细胞的质量，以便确认与细胞毒性 损害一致的经过1至4h质量减小20％至60％(图4)。我们发现在识 别和杀死同源靶细胞之后效应子T细胞的总质量显著平均增加2.8倍 (图5)。T细胞的质量变化被发现是比单独2D区域变化的测量值更显 著的对T细胞活化状态的指示。

我们在活化CTL中观察到的质量增加可能伴随有由代谢变化驱 动的生物合成增加。已经展现出T细胞使用葡萄糖和谷氨酰胺作为其 主要能量来源。活化的淋巴细胞产生能量以通过从细胞外环境中显著 增加葡萄糖、氨基酸和脂肪酸摄取来满足蛋白质合成需要(Fox等 (2005)Nat.Rev.Immunol.5:844-852)。葡萄糖缺失研究已经显示，活 化的T细胞需要葡萄糖来增殖并且甚至在足够水平谷氨酰胺的存在 下存活(Michalek和Rathmell(2010)Immunol.Rev.236:190-202)。TCR 信号传导在调节葡萄糖运载蛋白Glut1的转录方面起关键作用，从而 能够使得用活化增强葡萄糖摄取(Maciver等(2008)J.Leukoc.Biol.84: 949-957)。研究已经显示，TCR激动剂如抗CD3抗体或引起CD3蛋 白交联的化合物会引起Glut1表达的快速和最大的诱导(Michalek和 Rathmell(2010)Immunol.Rev.236:190-202；Maciver等(2008)J. Leukoc.Biol.84:949-957)。

在此呈现的LCI技术的潜在应用为用于鉴定和分离单一的和潜 在罕见的CTL。越来越多的工作主体集中在鉴定具有TCR识别自体 肿瘤细胞的肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)上(Rosenberg等(2008)Nat.Rev. Cancer,8:299-308；Cheever等(2009)Clin.CancerRes.15: 5323-5337)。最近的研究表明这些CTL以相对低的频率出现，从而使 采用批量或替代细胞毒性测定来确认其存在和从混合群分离变得困 难(Elkord等(2006)Clin.Immunol.120:91-98；Whiteside(2004)Dev. Biol.(Basel)116:219-228；讨论229-236)。LCI方法使用CTL与靶细 胞之间的细胞毒性相互作用作为潜在肽-MHC-TCR识别事件的天然 放大器，这避免了由于非特异性结合而引起的假阳性。LCI成像平台 基本上与分段的培养系统相容，所述分段的培养系统将允许在当前开 放灌注细胞培养系统中缺少的对罕见细胞的分离。因此，LCI可以为 鉴定和分离杀死自体肿瘤细胞或HLA匹配的癌细胞系的罕见效应子 T细胞提供可行的替代方案。

如果针对自体抗原产生了针对癌症相关的抗原的T细胞并且假 定逃脱了胸腺选择和耐受诱导，它们通常被预期具有较低亲和力TCR (Wooldridge等(2009)Immunology126:147-164)。TCR与肽-MHC之 间的亲和力被认为在T细胞刺激的结果上起决定性作用(Stone等 (2009)Immunology126:165-176)。评价TCR-肽-MHC亲和力的经典 方法必需使用表面等离子体共振测量结合速率和解离速率。表面结合 的肽-MHC-TCR相互作用不能准确地模拟在由CTL对靶细胞进行识 别过程中发生的多受体介导的相互作用。证据表明，这些测量提供了 关于淋巴细胞效应子功能的有限信息(Stone等(2009)Immunology126: 165-176；Edwards和Evavold(2011)Immunol.Res.50:39-48)。在转染 系统中，被工程化对同源肽-MHC配体具有更高亲和力的TCR与其 野生型对应物相比表现出增加的CTL活性(Edwards和Evavold(2011) Immunol.Res.50:39-48)。亲和力模型表明T细胞的活化与所参与的 受体数目相关。更高亲和力相互作用需要较少TCR-肽-MHC参与以 便使T细胞活化进入细胞毒性状态(Tian等(2007)J.Immunol.179: 2952-2960)。可以想到，更高亲和力TCR-肽-MHC相互作用驱动比其 较低亲和力对应物更快速的响应，并且LCI方法还可以潜在地在这些 相互作用之间加以区别。

致谢

我们感谢Ribas博士实验室(UCLA)供应细胞系，并且感谢Dian Huang(UCLA)对数据分析的帮助。在没有AIDS研究病毒学核心实验 室的UCLA中心和其供应健康HLAA2.1+PBMC的供体的情况下， 将不可能进行本项工作。

应该理解本文所描述的实施例和实施方案仅出于说明目的，并且 将建议本领域技术人员根据它们进行各种修改或变化，并且它们被包 括在本申请的精神和范围以及随附权利要求书的范围之内。出于所有 目的，本文所引用的所有出版物、专利和专利申请特此以引用的方式 整体并入。