ORY-1001联合放疗和化疗用于治疗人三阴性乳腺癌的用途

摘要

本发明涉及一种用于治疗三阴性乳腺癌的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的紫杉醇或其药学上可接受的盐，以及治疗有效量的LSD1的抑制剂，所述LSD1的抑制剂优选ORY-1001。本发明还提供ORY-1001在制备用于治疗三阴性乳腺癌的药物的应用。进一步地，本发明还提供ORY-1001在制备用于增强三阴性乳腺癌的预后的药物的应用。此外，本发明还提供了ORY-1001在人三阴性乳腺癌细胞放射治疗中应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小分子药物ORY-1001 联合放射疗法和/或化疗用于治疗乳腺癌，特别是人三阴性乳腺癌的 用途。

背景技术

人赖氨酸特异性去甲基化酶(Humanlysinespecificdemethylase l，LSD1)是胺氧化酶家族成员之一，在黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adeninedinucleotide，FAD)的参与下，LSD1特异性地去除组蛋白 H3上第四位(H3K4)和第九位(H3K9)赖氨酸残基上的二甲基和 一甲基修饰^[1]。此外，LSD1还能去除其它一些非组蛋白底物上的甲 基化修饰，例如p53、DNMT1和E2F1等^[2,3]。LSD1在多种肿瘤中 高表达，包括前列腺癌、未分化的成神经细胞瘤、雌激素阴性的乳 腺癌^[4]、膀胱癌和结直肠癌等。LSD1高表达与基底样乳腺癌细胞差 的预后相关，且对聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)抑制剂具有敏 感性^[5]。同时我们实验也发现，过表达LSD1能够增强促进三阴性乳 腺癌细胞生长和促进DNA双链断裂修复。因此，LSD1成为肿瘤等 疾病的重要的、潜在的药物作用靶标^[6-8]。

因此，利用选择性强、高效、低毒的去甲基化酶抑制剂来抑制 LSD1功能是治疗肿瘤的一种新途径。目前LSD1的抑制剂主要有反 苯环丙胺类抑制剂、底物多肽类似物和多胺类LSD1小分子抑制剂 等。由于LSD1属于胺氧化酶家族，因此胺氧化酶的抑制剂被首先 用来考察是否抑制LSD1。最早发现的LSD1抑制剂为反苯环丙胺又 名强内心百乐明(tranylcypromine,TCP，结构见图1)，TCP在临床 上被用来治疗抑郁症，它能够抑制LSD1活性，但是其对胺氧化酶 家族的选择性较差。由ORYZONGenomicsS.A.公司开发的高度选择 性、强劲的LSD1抑制剂ORY-1001，其IC₅₀<20nM，结合LSD1 能力是TCP的100倍，结构见图2。它是一个LSD1选择性抑制剂， 对其它依赖FAD的氧化酶类(MAO-A/B,IL4I1,KDM1B>100μM, SMOX7μM)没有显著的抑制活性。用该化合物处理急性髓性白血 病中的THP-1细胞，能够剂量依赖的促进THP-1细胞分化，并进一 步促进细胞调亡。ORY-1001能够抑制急性慢性白血病MV(4；11)细 胞的增殖和克隆形成，还能显著地抑制接种MV(4；11)小鼠模型的肿 瘤生长^[6,9]。

2014年，欧洲药品管理局(EuropeanMedicinesAgency，EMA) 批准了第一个LSD1特异型抑制剂ORY-1001进行I/IIA期临床试验， 用于治疗急性髓系白血病(AML)^[10]。药物抑制LSD1后会影响细 胞多个基因的表达，使得白血病母细胞转变为正常分化细胞，同时 也降低了白血病干细胞的增殖和存活能力。ORY-1001能够显著地降 低急性淋巴白血病(ALL)小鼠模型中肿瘤细胞的负荷和延长小鼠 的存活时间。三阴性乳腺癌(triplenegativebreastcancer,TNBC)为 雌激素受体(estrogenreceptor,ER)、孕激素受体(erogesterone receptor,PR)和人表皮生长因子受体2(HER-2)均阴性表达的乳腺 癌，约占乳腺癌的10％-22％，被认为是一种独立的临床病理类型， 具有侵袭性强、预后差和缺乏特异性治疗方法等特点^[11]。鉴于以上 ORY-1001对白血病细胞强的抑制作用，我们认为有必要在三阴性乳 腺癌细胞系中系统研究ORY-1001对放射治疗和联合紫杉醇化疗在 临床前的作用，为以后开展该药物对三阴性乳腺癌临床应用提供临 床前的相关实验基础和技术指导。

之前我们发明了一种连续低剂量辐射富集乳腺癌干细胞的方法 (CN104152434A)。在该研究基础之上，我们增加ORY-1001药物 处理，然后进行连续低剂量辐射，利用细胞克隆形成实验和流式细 胞技术FACS筛选标记的乳腺癌干细胞技术，研究ORY-1001是否影 响由连续低剂量辐射富集得到的乳腺癌干细胞的比例和它们的辐射 抗性，这对于该药物能否用于以后乳腺癌临床辐射治疗有着重要的 指导意义。

表观遗传药物与化疗药物的联合应用能提高肿瘤的临床治疗效 果。例如低剂量硫唑嘌呤(acetazolamide，AZA)联合组蛋白去乙 酰化酶抑制剂HDACi(Entinostat)可以延长非小细胞肺癌患者的生 存时间，并可增加肿瘤对紫杉醇等化疗药物的敏感性^[12]。因此，我 们利用细胞增殖实验、克隆形成实验和小鼠异种移植模型，研究 LSD1抑制剂ORY-1001联合紫杉醇化疗药物是否对三阴性乳腺癌细 胞的生长和原位异种移植小鼠模型肿瘤的增长有抑制作用。

总之，在已有的研究基础之上，发明人模拟临床放射治疗和联 合药物化疗手段，利用体内外的细胞学实验和小鼠模型，充分研究 ORY-1001应用在乳腺癌治疗方面的临床前作用，旨在为以后该药物 应用于三阴性乳腺癌甚至其它实体肿瘤的临床治疗提供较为扎实的 实验依据和技术方案，从而达到治疗肿瘤延长病人预后的根本目的。 发明内容

本发明的目的是提供一种人赖氨酸特异性去甲基化酶LSD1/ KDM1A的抑制剂ORY-1001应用在人乳腺癌放射治疗和/或联合化 疗中临床前的方法。

为了达到上述目的，本发明提供一种ORY-1001分别在人三阴 性乳腺癌细胞放射治疗和该药物与紫杉醇药物联合在人乳腺癌细胞 化疗中应用的方法。

另一方面，本发明提供一种用于治疗三阴性乳腺癌的药物组合 物，所述药物组合物包括治疗有效量的紫杉醇或其药学上可接受的 盐，以及治疗有效量的LSD1的抑制剂，所述LSD1的抑制剂优选 选自反苯环丙胺类抑制剂、底物多肽类似物和多胺类LSD1小分子 抑制剂，更优选选自式I所示的LSD1抑制剂ORY-1001：

在本发明的一个实施方案中，其中所述治疗有效量的紫杉醇或 其药学上可接受的盐和治疗有效量的LSD1的抑制剂按照顺序依次 给药于需要的受试者。

在本发明的又一个实施方案中，其中所述治疗有效量的紫杉醇 或其药学上可接受的盐的给药发生在治疗有效量的LSD1的抑制剂 的给药之前。

在本发明的另一个实施方案中，其中所述组合物具有治疗性的 协同作用。

在本发明的又一个方面，本发明提供所述的药物组合物在制备 用于治疗三阴性乳腺癌的药物的应用。

在本发明的另一个方面，本发明提供所述的药物组合物在制备 用于增强三阴性乳腺癌的预后的药物的应用。

在本发明的又一个方面，本发明提供LSD1的抑制剂在制备联 合放射疗法和/或化疗用于治疗乳腺癌，特别是人三阴性乳腺癌的试 剂中的用途。

在本发明的另一个实施方案中，其中LSD1的抑制剂优选选自 反苯环丙胺类抑制剂、底物多肽类似物和多胺类LSD1小分子抑制 剂，更优选选自式I所示的LSD1抑制剂ORY-1001：

在本发明的另一个方面，本发明的ORY-1001在人三阴性乳腺 癌细胞放射治疗中应用的方法包括：1)培养乳腺癌细胞系，经过 ORY-1001药物处理，培养一段时间后，连续多次低剂量辐射处理细 胞，通过细胞克隆形成实验和流式细胞技术，发现ORY-1001降低 原来低剂量辐射富集的乳腺癌干细胞的比例和乳腺癌干细胞对辐射 的抗性。

优选地，所述低剂量辐射处理为通过⁶⁰Co进行低剂量辐射处理。

优选地，所述低剂量为1.5-4Gy。

优选地，所述培养一段时间为培养1-2周。

优选地，所述共计辐射次数为三次。

在本发明的又一个方面，本发明的ORY-1001与紫杉醇药物联 合在人三阴性乳腺癌细胞化疗中应用的方法包括：2)ORY-1001联 合紫杉醇作用乳腺癌细胞，通过CCK-8细胞增殖实验和细胞克隆形 成实验，发现两者联合用药显著抑制乳腺癌细胞体外的增殖和克隆 形成；通过小鼠原位异种移植实验，发现两者联合用药显著抑制体 内小鼠模型中肿瘤的生长。

优选地，所述细胞学实验中ORY-1001浓度为5-20μM，紫杉醇 浓度为100nM。

优选地，所述细胞学实验中ORY-1001浓度为10μM，紫杉醇浓 度为100nM。

优选地，所述小鼠模型中小鼠为BALB/c(nu/nu)裸鼠。

优选地，所述小鼠模型中ORY-1001所用浓度为10-30μg/kg/天， 给药方式为灌胃给药；紫杉醇浓度为10-30mg/kg，给药方式为尾静 脉注射，一周两次。

优选地，所述小鼠模型中ORY-1001所用浓度为20μg/kg/天，给 药方式为灌胃给药；紫杉醇浓度为20mg/kg，给药方式为尾静脉注 射，一周两次。

本发明的有益效果：

由于当前对于三阴性乳腺癌尚无有效的治疗方法来改善患者的 预后，本发明一方面提供了LSD1抑制剂ORY-1001应用在三阴性乳 腺癌放射治疗和联合紫杉醇化疗方法中的临床前作用，为后续该药 物应用在乳腺癌临床治疗提供了实验依据并具有一定的指导意义； 一方面提供了一种系统、可靠的ORY-1001小分子应用在三阴性乳 腺癌辐射治疗和联合紫杉醇化疗的方法，为后续进一步改善三阴性 乳腺癌的良好预后提供了依据。

附图说明

图1为反苯环丙胺的结构式。

图2为ORY-1001的结构式。

图3显示ORY-1001处理前后乳腺癌细胞系的甲基化变化情况。

图4显示ORY-1001降低了由连续低剂量辐射引起的乳腺癌细胞 系中的肿瘤干细胞的富集比例。

图5显示MDA-MB-231细胞在ORY-1001联合紫杉醇处理之后生 长被显著抑制。

图6显示三阴性乳腺癌细胞在接受ORY-1001联合紫杉醇处理后 细胞的生长增殖受到明显抑制。

图7显示ORY-1001联合紫杉醇有效抑制小鼠肿瘤生长。

具体实施方式

可以通过以下两种方法鉴定ORY-1001是否能够降低由低剂量辐 射富集的乳腺癌干细胞的比例或者ORY-1001是否降低乳腺癌干细胞 对辐射的抗性也就是ORY-1001是否提高由乳腺癌干细胞对辐射的敏 感性：

鉴定方法一：

将经过ORY-1001给药的乳腺癌细胞再经连续低剂量辐射照射处 理后进行生物学鉴定，首先是通过抗体识别乳腺癌肿瘤干细胞表面特 异性抗原CD44⁺CD24^-/low，利用流式细胞仪对细胞系中CD44⁺CD24^-/low的比例进行分析，若细胞系中的CD44⁺CD24^-/low比例降低，则说明相 比对照组，经过ORY-1001给药后降低了细胞中乳腺癌干细胞比例和 数目。

鉴定方法二：

以一定数目乳腺癌细胞接种到6孔板，经过ORY-1001给药处理 后，再用连续低剂量辐射处理该细胞，培养一段时间后，对形成的细 胞克隆固定染色统计数目。理论上讲肿瘤干细胞的比例降低之后细胞 增殖及克隆形成能力都会减弱，所以只要实验中ORY-1001细胞克隆 数目减少克隆变小也可以认为乳腺癌干细胞比例减少。

可以通过以下三种方法鉴定ORY-1001联合化疗药紫杉醇是否抑 制体内外的乳腺癌细胞的生长和肿瘤的增长。

鉴定方法一：CCK-8细胞增殖实验

分别对乳腺癌细胞系经过适当浓度药物ORY-1001、紫杉醇及 ORY-1001联合紫杉醇、双阴性处理后，以一定数目将细胞接种到96 孔板进行CCK-8细胞增殖实验，24小时培养后，每天固定时间加入 CCK-8药物检测细胞的OD值，对实验结果进行统计分析。如果 ORY-1001联合化疗药紫杉醇抑制细胞的生长，通过CCK-8实验绘制的 生长曲线我们会观察到联合用药组的细胞生长显著被抑制。

鉴定方法二：细胞克隆形成实验

分别对乳腺癌细胞系进行适当浓度药物ORY-1001、紫杉醇及 ORY-1001联合紫杉醇、双阴性处理后，以一定数目将细胞接种到六 孔板进行细胞克隆形成实验，经过2周的细胞培养，最后对细胞形成 的克隆进行固定染色后统计克隆数目。如果ORY-1001联合化疗药紫 杉醇抑制细胞的生长，通过细胞克隆形成实验我们会观察到联合用药 组的细胞形成的细胞克隆数目是最少的。

鉴定方法三：小鼠原位异种移植实验

选择6周龄的BALB/c(nu/nu)裸鼠作为实验动物，实验分为四组： 双阴性对照组、ORY-1001实验组、紫杉醇实验组、ORY-1001+紫杉醇 组联合用药实验，每组实验小鼠6只以上。首先在每只小鼠第四对乳 房垫注射MDA-MB-231细胞，每个乳房垫注射10μL含10⁵个乳腺癌细 胞使之原位成瘤。小鼠成瘤后固定时间连续测量小鼠肿瘤的体积，待 肿瘤负荷达到一定时杀死小鼠取出肿瘤测量小鼠重量。如果 ORY-1001联合化疗药紫杉醇抑制细胞的生长，通过细胞克隆形成实 验我们会观察到联合用药组的小鼠肿瘤生长得最慢，并且长出来的肿 瘤相对其它三组重量最轻。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1ORY-1001处理过的三阴性乳腺癌细胞再进行电离辐射

乳腺癌细胞系MDA-MB-231经过10μM浓度的ORY-1001处理后 常规培养，经过同位素⁶⁰Co放射源、2Gy照射处理(以139.09cGy/min 的剂量处理1分17秒)，处理后常规培养1-2周，待细胞生长状况稳定， 再次接受⁶⁰Co、2Gy照射处理，如此重复照射，分别收集辐射1*2Gy、 2*2Gy和3*2Gy的细胞(n*2Gy)。

实施例2利用流式细胞术分析乳腺癌干细胞的富集比例

将实施例1所获得的细胞，分别通过CD24-APC和CD44-FITC两种 抗体对细胞进行孵育，利用流式细胞仪分析发现在两种细胞系中连续 低剂量辐射能将CD44⁺CD24^-/low的比例提升，尤其是在MDA-MB-231 细胞系中，肿瘤干细胞的比例降低(见图4)，因此说明利用ORY-1001 处理后降低了由连续低剂量辐射引起的乳腺癌细胞系中的肿瘤干细 胞的富集比例。

上述流式细胞术实验过程简述如下：利用流式细胞仪分选的方 法，首先分别收集不同批次处理的细胞，用磷酸缓冲液PBS清洗干净 之后，用CD24-APC和CD44-FITC两种抗体对细胞进行孵育，分别选 用635nm和488nm激发光，对比阴性对照和单阳对照进行象限分析。

实施例3通过细胞增殖实验分析ORY-1001联合化疗药物紫杉醇抑 制乳腺癌细胞的生长

为了分析ORY-1001联合化疗药物紫杉醇抑制乳腺癌细胞的生长 情况，发明人利用CCK-8实验方法分别对ORY-1001、紫杉醇、 ORY-1001+紫杉醇及双阴性对照处理的细胞OD值进行了检测。检测 结果显示：MDA-MB-231细胞在ORY-1001联合紫杉醇处理之后，细 胞生长曲线处于下方，生长被显著抑制(见图5)。

实施例4通过细胞克隆形成实验分析ORY-1001联合化疗药物紫杉 醇抑制乳腺癌细胞的生长

为了分析ORY-1001联合化疗药物紫杉醇抑制乳腺癌细胞的生长 情况，发明人利用细胞克隆形成实验方法对ORY-1001、紫杉醇、 ORY-1001+紫杉醇及双阴性对照处理细胞形成的克隆数目进行了检 测。实验流程如下：接种细胞，首先分别经过ORY-1001、紫杉醇、 ORY-1001+紫杉醇及双阴性对照处理细胞正常培养72小时后，用培养 基稀释到一定比例，利用血球计数板计数，接种到六孔板(细胞密度 为400/孔)，进行连续培养两周后，观察并统计细胞形成的克隆情况。 根据观察统计，可以看出三阴性乳腺癌细胞在接受ORY-1001联合紫 杉醇处理后，细胞克隆数目最少，细胞的生长增殖受到明显抑制(见 图6)。

实施例5通过原位异种移植小鼠模型分析ORY-1001联合化疗药物 紫杉醇抑制小鼠体内肿瘤的增长

为了研究ORY-1001联合化疗药物紫杉醇对小鼠体内肿瘤的增长 情况，发明人选择6周龄的BALB/c(nu/nu)裸鼠作为实验动物，实验 分为四组：双阴性对照组、ORY-1001实验组、紫杉醇实验组、 ORY-1001+紫杉醇联合用药实验组，每组实验小鼠6只以上。首先在 每只小鼠第四对乳房垫注射MDA-MB-231细胞，每个乳房垫注射 10μL含10⁵个乳腺癌细胞使之原位成瘤。小鼠成瘤后固定时间连续测 量小鼠肿瘤的体积，待肿瘤负荷达到一定时杀死小鼠取出肿瘤测量小 鼠重量。通过对小鼠肿瘤体积的测量和最后肿瘤大小的称量，发现联 合用药组的小鼠肿瘤生长得最慢，并且长出来的肿瘤相对其它三组重 量最轻(见图7)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了 详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这 对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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