延龄草提取物及其中皂苷类化合物的制备方法及其在制备抗缺血性心脏病药物中的应用

摘要

本发明涉及一种延龄草提取物及其中皂苷类化合物的制备方法及其在制备抗缺血性心脏病药物中的应用。所制备的延龄草提取物本身是延龄草总提物上大孔吸附树脂的85％乙醇洗脱部位并且其总皂苷含量大于90％，主要包含偏诺皂苷含量66-75％、延龄草皂苷含量3-7％、薯蓣皂苷含量5-8％。所制备的延龄草皂苷类化合物本身是偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷中的一种或多种，因拥有共同的偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷等结构单元，而在人体中具有类似的治疗功效。

说明书

技术领域

本发明涉及延龄草提取物及其中皂苷类化合物的制备方法及其在制备抗缺血性心脏病药物中的应用，属于中医药制备技术领域。

背景技术

延龄草为百合科延龄草属植物延龄草TrilliumtschonoskiiMaxim.，俗名头顶一颗珠、芋儿七、狮儿七等，是传统的名贵中药，有延年益寿的功效。主治头晕目眩、失眠、跌打损伤、外伤出血、神经衰弱、高血压病、脑震荡后遗症等疾病，是恩施土家族著名民间药之一。目前国内外对延龄草属植物的药理活性研究表明延龄草有较强的抗炎、免疫调节、改善大鼠学习记忆功能和抗衰老等作用。发明人采用冠脉结扎致大鼠心肌缺血实验模型，从心电图、心肌梗死范围、血清肌酸激酶(CK)及血清乳酸脱氢酶(LDH)的活力等方面研究证实延龄草85％乙醇洗脱物对心肌缺血具有显著的防治作用。

化学研究表明，有效部位85％乙醇洗脱部位以甾体皂苷类成分为主，甾体皂苷总含量大于90％，其中主要为偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷，上述三种皂苷既是延龄草药材的指标性和特征性成分，又是有效部位85％乙醇洗脱部位的指标性和特征性成分。进一步药理研究证实有效部位中偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷为延龄草抗缺血性心脏病药物的有效成分。上述研究还没有报道，我们通过系统的体内外实验研究，首先发现其对抗缺血性心脏病具有良好的治疗作用。

发明内容

本发明目的是提供一种延龄草提取物及其中皂苷类化合物的制备方法及其在制备抗缺血性心脏病药物中的应用。

本发明采用了下述技术方案。

延龄草提取物的制备方法：将延龄草药材粉碎成粗粉，用0-100％乙醇浸泡0.5-2小时，4-12倍量溶剂加热回流提取2-4次，每次1-3小时，过滤，合并滤液。上述滤液与45-80℃减压浓缩至0.5-1.5g生药材/ml，0-4℃冷藏过夜，析胶，过滤，滤液再用正丁醇萃取回收得浸膏稀释上大孔吸附树脂或滤液直接上大孔吸附树脂AB-8型或D-101型或HPD-400或各种型号大孔吸附树脂富集，依次用乙醇水由0-50％洗脱，再用乙醇水由50-95％洗脱得到各洗脱部位，主要收集乙醇水60-85％的洗脱部位，各洗脱部位在45-80℃减压回收溶剂至乙醇适量浓度，用冷冻干燥法或喷雾干燥进行干燥，收集冻干粉或喷雾干燥粉，即得。

延龄草皂苷类化合物中偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷(pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside)、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷(pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside)和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷(pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside)的制备方法：将权利要求6所得延龄草提取物上硅胶柱，上样后依次用三氯甲烷∶甲醇或二氯甲烷∶甲醇或三氯甲烷∶甲醇∶水或二氯甲烷∶甲醇∶水梯度洗脱，以上述延龄草皂苷类化合物中偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷的3种皂苷作为对照品TLC或HPLC检测，合并相应流份。上述流份于45-80℃减压浓缩蒸干，用适量蒸馏水混悬或溶解，上反相硅胶OD5-C18柱色谱或SephadexLH-20柱色谱或制备高效液相色谱技术分离纯化，依次用乙醇水由0-50％洗脱，再用乙醇水50-95％洗脱，洗脱液用冷冻干燥法或喷雾干燥进行干燥，收集冻干粉或喷雾干燥粉，用10-95％乙醇结晶并重结晶，即得。

前述方法制备的延龄草提取物及其中皂苷类化合物，其有效成分为偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-βD-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷中的一种或多种，或其该物质中的皂苷元的第21位和第27位的转化羟甲基的羟基或17位羟基或所有糖基的醇羟基被乙酰基、脂肪链烷烃基、芳香族取代基、酰胺基中的任意一种取代，或者是水解后会产生偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷的物质，可用于制备抗缺血性心脏病药物，所述药物包括口服液、胶囊、片剂、泡腾片、粉针剂、水针剂或注射剂或各种剂型制剂，所述药物还包括各种单方和复方制剂。

所涉及的缺血性心脏病是由心肌缺血导致并发生的冠心病、心绞痛和心肌梗死等缺血性心脏病的任意一种。

本发明的优点是：提供了一种延龄草提取物及其中皂苷类化合物的提取与制备方法，所得物质中有效成分主要为偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷中的一种或多种，所得物质可用于制备抗缺血性心脏病药物的口服液、胶囊、片剂、泡腾片、粉针剂、水针剂或注射剂或各种剂型制剂的原料药。

一种延龄草提取物及其中皂苷类化合物中偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷在体内外对由心肌缺血导致并发生的冠心病、心绞痛和心肌梗死等缺血性心脏病具有良好的治疗作用和较强的生物活性。

一种延龄草提取物及其中皂苷类化合物中偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷的制备方法主要通过从天然药物中提取，为纯天然组分与单体，具有良好的生物相容性。

附图说明

图1为偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷的分子结构式；

图2为偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷的分子结构式；

图3为偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷的分子结构式。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例1

一种延龄草提取物及其中偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷的制备方法：将延龄草药材粉碎成粗粉，用70％乙醇浸泡1小时，10倍量溶剂加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。上述滤液与65℃减压浓缩至1.0g生药材/ml，0-4℃冷藏过夜，析胶，过滤，滤液再用正丁醇等有机溶剂萃取，回收有机溶剂，得浸膏加水混悬，上AB-8型号大孔吸附树脂富集，依次用水、30％乙醇、60％乙醇和85％乙醇洗脱，得到各洗脱部位，用冷冻干燥法进行干燥，收集冻干粉，即得。其中85％的洗脱部位以甾体皂苷类成分为主，甾体皂苷总含量大于95％，即得延龄草提取物。将上述延龄草提取物既85％乙醇的洗脱部位的浸膏加入等量的100-200目硅胶拌匀，50℃减压挥干溶剂，研匀，干法上样，上常压硅胶柱(200-300目，硅胶量为浸膏的30倍)，上样后依次用三氯甲烷∶甲醇∶水梯度洗脱，主要收集三氯甲烷∶甲醇∶水为65∶35∶1的流份，以上述延龄草皂苷类物质中偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷的3种皂苷作为对照品TLC或HPLC检测，合并相应流份。上述流份于65℃减压浓缩蒸干，用适量蒸馏水混悬，上反相硅胶ODS-C18柱色谱，依次用乙醇水由0-50％洗脱，再用乙醇水50-95％洗脱，主要收集60％-80％洗脱液用冷冻干燥法进行干燥，收集冻干粉，用10-95％乙醇结晶并重结晶，即得。采用上述方法制备延龄草皂苷类物质中偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-βD-葡萄糖苷的得率为1.5-2.6g/kg，经HPLC检测纯度为99.0％；偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷的得率为0.8-1.9g/kg，经HPLC检测纯度为98.6％；偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷的得率依次分别为的得率为0.3-0.9g/kg，经HPLC检测纯度为98.2％；色谱条件UItimateRXB-C18色谱柱(4.6mm×150mm，3μm)，流动相为乙腈-水(10％-100％梯度洗脱)，检测波长为203nm，流速为1.0ml/min，柱温30℃，进样量20μl。

实施例2

一种延龄草提取物及其中偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-βD-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷的制备方法：将延龄草药材粉碎成粗粉，用60％乙醇浸泡2.0小时，12倍量溶剂加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。上述滤液与70℃减压浓缩至1g生药材/ml，0-4℃冷藏过夜，析胶，过滤，滤液上D101型号大孔吸附树脂富集，依次用水、30％乙醇、60％乙醇和85％乙醇洗脱，得到各洗脱部位，用喷雾干燥法进行干燥，收集喷雾干粉，即得。其中85％的洗脱部位以甾体皂苷类成分为主，甾体皂苷总含量大于92％，即得延龄草提取物。将上述延龄草提取物既85％乙醇的洗脱部位的浸膏加入等量的100-200目硅胶拌匀，50℃减压挥干溶剂，研匀，干法上样，上常压硅胶柱(200-300目，硅胶量为浸膏的25倍)，上样后依次用三氯甲烷∶甲醇∶水梯度洗脱，主要收集三氯甲烷∶甲醇∶水为60∶30∶1的洗脱流份，以上述延龄草皂苷类物质中偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-βD-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷的3种皂苷作为对照品TLC或HPLC检测，合并相应流份。上述流份于65℃减压浓缩蒸干，用适量蒸馏水混悬，上SephadexLH-20柱色谱，依次用乙醇水由0-50％洗脱，再用乙醇水50-95％洗脱，洗脱液用喷雾干燥进行干燥，收集喷雾干燥粉，用10-95％乙醇结晶并重结晶，即得。采用上述方法制备延龄草皂苷类物质中偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷的得率为1.5-2.6g/kg，经HPLC检测纯度为98.8％；偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷的得率为0.8-1.9g/kg，经HPLC检测纯度为98.5％；偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷的得率依次分别为的得率为0.3-0.9g/kg，经HPLC检测纯度为97.8％；色谱条件UItimateRXB-C18色谱柱(4.6mm×150mm，3μm)，流动相为乙腈-水(10％-100％梯度洗脱)，检测波长为203nm，流速为1.0ml/min，柱温30℃，进样量20μl。

实施例3

一种延龄草提取物及其中偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷的制备方法：将延龄草药材粉碎成粗粉，用50％乙醇浸泡1.0小时，8倍量溶剂加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液。上述滤液与70℃减压浓缩至1g生药材/ml，0-4℃冷藏过夜，析胶，过滤，滤液上HPD400型号大孔吸附树脂富集，依次用水、30％乙醇、50％乙醇和85％乙醇洗脱，得到各洗脱部位，用喷雾干燥法进行干燥，收集喷雾干粉，即得。其中85％的洗脱部位以甾体皂苷类成分为主，甾体皂苷总含量大于90％，即得延龄草提取物。将上述延龄草提取物既85％乙醇的洗脱部位的浸膏加入等量的100-200目硅胶拌匀，50℃减压挥干溶剂，研匀，干法上样，上常压硅胶柱(200-300目，硅胶量为浸膏的20倍)，上样后依次用三氯甲烷∶甲醇∶水梯度洗脱，主要收集三氯甲烷∶甲醇∶水为65∶35∶1的洗脱流份，以上述延龄草皂苷类物质中偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷的3种皂苷作为对照品TLC或HPLC检测，合并相应流份。上述流份于65℃减压浓缩蒸干，用制备高效液相色谱技术分离纯化，用乙醇水50-95％洗脱，洗脱液经适当浓缩用喷雾干燥进行干燥，收集喷雾干燥粉，用10-95％乙醇结晶并重结晶，即得。采用上述方法制备延龄草皂苷类物质中偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-βD-葡萄糖苷的得率为1.5-2.6g/kg，经HPLC检测纯度为99.3％；偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷的得率为0.8-1.9g/kg，经HPLC检测纯度为99.1％；偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷的得率依次分别为的得率为0.3-0.9g/kg，经HPLC检测纯度为98.8％；色谱条件UItimateRXB-C18色谱柱(4.6mm×150mm，3μm)，流动相为乙腈-水(10％-100％梯度洗脱)，检测波长为203nm，流速为1.0ml/min，柱温30℃，进样量20μl。

实施例4

发明人采用冠脉结扎致大鼠心肌缺血实验模型，从心电图、心肌梗死范围、血清肌酸激酶(CK)及血清乳酸脱氢酶(LDH)的活力等方面研究证实延龄草85％乙醇洗脱物对心肌缺血具有显著的防治作用和较强的生物活性。

1药材提取：将干燥的延龄草根及根茎30kg，粉碎成粗粉，以70％乙醇回流提取3次，每次2.0小时，滤过，合并提取液，减压回收，得干膏(总提物)。将干膏水混悬后经过AB-8型大孔吸附树脂分离，依次用水、30％乙醇、60％乙醇、85％乙醇洗脱，得到各洗脱部位。将延龄草70％乙醇总提取物(1g相当于生药6.7g)、水洗脱物(1g相当于生药12.2g)、30％乙醇洗脱物(1g相当于生药83.3g)、60％乙醇洗脱物(1g相当于生药55.6g)、85％乙醇洗脱物(1g相当于生药26.7g)，分别用2％聚山梨酯水溶液制备供试液。

2动物分组及给药：大鼠60只，按体重随机分为假手术组、模型组、阳性组(地奥心血康胶囊为60mg/kg)、85％乙醇洗脱物高剂量组为88mg/kg、85％乙醇洗脱物中剂量组为44mg/kg，给药量为20ml/kg，假手术组、模型组灌予等量蒸馏水，每天1次，连续14天。

3模型制备：于末次给药1h后，腹腔注射3％戊巴比妥钠45mg/kg麻醉动物，将动物仰卧位固定于鼠台上，剪开喉部皮肤，钝性分离皮下筋膜、肌肉，找到气管，行气管插管术，并接动物呼吸机辅助呼吸。于胸部去毛、消毒、沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第4、5肋间钝性分离肌层，打开胸腔，用自制圆形取心环掏出心脏。在肺动脉圆锥与左心耳下缘可以看见左冠脉前降支起始部，距左心耳下缘1～2mm处，用6/0缝合线结扎。进针深度控制在2mm左右，宽度约为2mm，结扎后将心脏放回胸腔，排除胸腔里的空气后迅速用止血钳关闭胸腔。假手术组只穿线不予结扎。

4观察指标：

4.1II导联心电图动物麻醉仰卧位固定于鼠台上，四肢皮下插入心电图针状电极，记录正常II导联心电图及冠脉结扎后半小时心电图(结扎后心电图ST段弓背明显抬高，且结扎心肌色泽变浅可代表结扎成功)，观察结扎后心电图、30minST段及T波的变化。

4.2心肌梗塞范围腹主动脉取血后，迅速取出心脏，用PBS缓冲液冲洗干净心脏内余血，用滤纸吸去水分，于-20℃冰箱内冷冻8min后取出心脏，迅速将左心室结扎线下部分心肌平行切成厚度约为2mm的片状，片状心肌恢复室温后置现配的1％TTC缓冲液中避光染色，并37℃恒温水浴15min，期间振荡4次以便充分染色。然染色后将心肌组织置于10％福尔马林中浸泡24h，正常心肌被染为红色，梗塞区心肌不着色。将心肌组织按顺序排好拍照，使用ImageProPlus6.0医学图像分析系统对拍照的心肌梗死区面积进行分析，使用countandmeasureabjects工具计算梗死区面积及整个心肌面积，梗死范围＝梗死区面积/心脏总面积×100％。

4.3CK、LDH活力的检测心肌梗塞3h后腹主动脉取血6ml，静置2h后4000r/min离心20min取上清液。试剂盒检测CK、LDH的活力。

5统计处理方法：

结果均用表示，心电图以不同时点测定值与结扎前基础值之差值表示。利用SPSS13.0统计软件单因素方差分析方法进行组间比较。

6试验结果：

6.1延龄草85％乙醇洗脱物对心肌缺血大鼠II导联心电图ST段及T波变化的影响

结果见表1、表2。假手术组相比，模型组大鼠在冠脉结扎后5、10、15、30min心电图ST段、T波均显著升高。与模型组相比较，阳性药组、延龄草85％乙醇洗脱物高剂量组和延龄草85％乙醇洗脱物中剂量组均可显著对抗结扎冠脉导致大鼠ST段、T波的升高(p＜0.05或p＜0.01)。

6.2延龄草85％乙醇洗脱物对心肌缺血大鼠心肌梗塞范围的影响

结果见表3。与假手术组相比较，模型组大鼠心肌梗塞范围显著升高；与模型组相比较，阳性药组、延龄草85％乙醇洗脱物高剂量组、延龄草85％乙醇洗脱物中剂量组均能显著降低心肌梗塞范围(p＜0.01)，说明阳性药组、延龄草85％乙醇洗脱物高剂量组、延龄草85％乙醇洗脱物中剂量组均能增加缺血区血液供应，降低心肌缺血性损害。

表3延龄草85％乙醇洗脱物对心肌缺血大鼠心肌梗塞范围的影响(n＝11)

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

6.3延龄草85％乙醇洗脱物对心肌缺血大鼠血清酶CK、LDH的影响

结果见表4。与假手术组相比较，模型组大鼠在结扎冠脉后血清中CK、LDH活力显著升高；与模型组相比较，阳性药组、延龄草85％乙醇洗脱物高剂量组、延龄草85％乙醇洗脱物中剂量组的血清中CK、LDH活性显著降低(p＜0.01)，提示阳性药组、延龄草85％乙醇洗脱物高剂量组、延龄草85％乙醇洗脱物中剂量组对心肌的缺血损伤有保护作用。

表4延龄草85％乙醇洗脱物对心肌缺血大鼠血清酶CK、LDH活力的影响(n＝11)

注：与假手术组比较，##P＜0.01，与模型组比较，**P＜0.01。

7实验小结：

心肌缺血是由于心脏血和氧的供需失去平衡所致，是冠心病等缺血性心脏病发生的主要病理生理机制。在心肌缺血有关实验研究中，实验动物的心电图改变是重要的观察指标之一，ST段及T波高度的变化是心肌缺血最早期出现的、最敏感和确切的指标一，常用于判断心肌缺血模型的复制是否成功及评价药物的抗心肌缺血药效。心肌缺血时心电图所表现出的ST段抬高是由于心外膜缺血区内部分发生去极化的心肌细胞与非缺血区心肌细胞之间形成的一过性损伤电流所引起的，T波升高是由于心内膜下心肌缺血。因此，通常将ST段及T波的变化值作为评价大鼠心肌缺血损伤的主要指标。

CK是一个与细胞内能量转运、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆的催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。主要分布在骨骼肌、心肌和脑细胞中。其主要功能为：在三磷酸腺苷(ATP)作用下，催化肌酸磷酸化，形成磷酸肌酸和二磷酸腺苷(ADP)，以及催化磷酸肌酸的高能磷酸键转移给二磷酸腺苷(ADP)生成三磷酸腺苷(ATP)，并形成肌酸。心肌缺血后细胞膜受到不同程度的损伤，肌酸激酶会从受损细胞中释放入血，使血清中肌酸激酶水平迅速提高，肌酸激酶是心肌梗死的重要血生化指标。

LDH是一种寡聚酶，可催化乳酸及丙酮酸的可逆转化。该酶广泛分布在心肌、红细胞、骨骼肌和肝脏中，它在细胞液中的含量非常丰富，因而所催化的反应非常迅速，是细胞呼吸链上的重要生物酶。组织缺氧时，细胞糖酵解作用旺盛，丙酮酸在LDH作用下转变成乳酸的过程加强，LDH活性的升高意味着无氧酵解过程加强，有氧氧化过程受抑制，能量供应障碍。所以血清中LDH的活性可反映心肌缺血损伤的范围和严重程度，其活性越高，反映心肌损伤越重。

本实验研究发现，大鼠左冠脉前降支结扎后，心电图ST段、T波均显著升高，心肌梗塞范围显著增加，血清中CK、LDH活力明显升高，提示心肌缺血造模成功。延龄草85％乙醇洗脱物高剂量组、延龄草85％乙醇洗脱物中剂量组均能显著降低模型大鼠ST段和T波的异常抬高，减少心肌缺血大鼠的心肌梗塞范围，抑制血清中CK、LDH的活力，提示延龄草85％乙醇洗脱物对冠脉结扎所致心肌缺血有一定的防治作用。

实施例5

延龄草成分分析与质量标准研究，课题组在对延龄草成分的研究中，发现其中的延龄草偏诺皂苷B₃(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-βD-葡萄糖苷)、B₁(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷)、B₂(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷)含量较大，是延龄草中的专属性成分与特征性成分，且在203nm处有紫外吸收，可以直接用紫外检测器进行含量测定，方法简便。本文采用HPLC法测定延龄草中延龄草皂苷B₂、B₁、B₃的含量，为研究和制定延龄草药材的质量标准提供依据。

B₃：偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-βD-葡萄糖苷(pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside)，其分子结构式见图1。

B₁：偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷(pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside)，其分子结构式见图2。

B₂：偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷(pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside)，其分子结构式见图3。

对照品延龄草皂苷B₂(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷)、B₁(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷)、B₃(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-βD-葡萄糖苷)由本实验室自制，经过高效液相峰面积归一化法测定质量分数99％。延龄草药材采自湖北省神农架地区，经江西中医药大学左月明副教授鉴定为百合科延龄草属植物延龄草TrilliumtschonoskiiMaxim.。乙腈为色谱纯(天津四友生物医学技术有限公司)，水为二次蒸馏水(自制)。

样品测定称取延龄草药材粉末(过4号筛，低温烘干至恒重)约1.0g，按照供试品溶液的制备方法制备，精密吸取样品溶液20μl，注入高效液相色谱仪测定，根据外标两点法计算样品中的延龄草皂苷B₂、B₁、B₃的含量分别为0.13％、0.19％和0.28％(n＝3)。

HPLC法测定延龄草血中移行成分的初步研究

本课题组还开展了延龄草的含药血清色谱指纹图谱研究，但仅初步建立了含药血清的制备方法和检测方法，初步确定延龄草入血成分为B₁(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷)和B₃(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-βD-葡萄糖苷)，从而使延龄草的质量评价方法更加完善，为明确其药效物质基础和作用机理提供更广泛的科学依据。

实施例6

发明人采用冠脉结扎致大鼠心肌缺血实验模型，从心电图、心肌梗死范围、血清肌酸激酶(CK)及血清乳酸脱氢酶(LDH)的活力等方面研究证实延龄草85％乙醇洗脱物有效部位中的偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷对心肌缺血具有显著的防治作用和较强的生物活性。

1药品与试剂：延龄草皂苷1(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-βD-葡萄糖苷)、延龄草皂苷2(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷)、延龄草皂苷3(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷)均为白色粉末，由笔者实验室自行分离得到，质量分数大于98％。

2实验方法：

2.1动物分组及给药：大鼠90只，按体重随机分为假手术组、模型组、阳性组(地奥心血康胶囊浓度为6mg/ml)、苷1高剂量组(29.14mg/kg)、苷1中剂量组(14.57mg/kg)、苷2高剂量组(17.14mg/kg)、苷2中剂量组(8.86mg/kg)、苷3高剂量组(26.86mg/kg)、苷3中剂量组(14.28mg/kg)，每组10只老鼠。给药量为10ml/kg，假手术组、模型组灌予等量蒸馏水，每天1次，连续14天。

2.2模型制备：于末次给药1h后，腹腔注射3％戊巴比妥钠45mg/kg麻醉动物，将动物仰卧位固定于鼠台上，剪开喉部皮肤，钝性分离皮下筋膜、肌肉，找到气管，行气管插管术，并接动物呼吸机辅助呼吸。于胸部去毛、消毒、沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第4、5肋间钝性分离肌层，打开胸腔，用自制圆形取心环掏出心脏。在肺动脉圆锥与左心耳下缘可以看见左冠脉前降支起始部，距左心耳下缘1～2mm处，用6/0缝合线结扎。进针深度控制在2mm左右，宽度约为2mm，结扎后将心脏放回胸腔，排除胸腔里的空气后迅速用止血钳关闭胸腔。假手术组只穿线不予结扎。

2.3观察指标：

2.3.1II导联心电图动物麻醉仰卧位固定于鼠台上，四肢皮下插入心电图针状电极，记录正常II导联心电图及冠脉结扎后半小时心电图(结扎后心电图ST段弓背明显抬高，且结扎心肌色泽变浅可代表结扎成功)，观察结扎后心电图、30minST段及T波的变化。

2.3.2心肌梗塞范围腹主动脉取血后，迅速取出心脏，用PBS缓冲液冲洗干净心脏内余血，用滤纸吸去水分，于-20℃冰箱内冷冻8min后取出心脏，迅速将左心室结扎线下部分心肌平行切成厚度约为2mm的片状，片状心肌恢复室温后置现配的1％TTC缓冲液中避光染色，并37℃恒温水浴15min，期间振荡4次以便充分染色。然染色后将心肌组织置于10％福尔马林中浸泡24h，正常心肌被染为红色，梗塞区心肌不着色。将心肌组织按顺序排好拍照，使用ImageProPlus6.0医学图像分析系统对拍照的心肌梗死区面积进行分析，使用countandmeasureabjects工具计算梗死区面积及整个心肌面积，梗死范围＝梗死区面积/整个心肌总面积×100％。

2.3.3CK、LDH活力的检测心肌梗塞3h后腹主动脉取血6mi，静置2h后4000r/min离心20min取上清液。试剂盒检测CK、LDH的活力。

2.4统计处理方法

结果均用表示，心电图以不同时点测定值与结扎前基础值之差值表示。利用SPSS13.0统计软件单因素方差分析方法进行组间比较。

3实验结果：

3.1延龄草皂苷对心肌缺血大鼠II导联心电图ST段及T波变化的影响

结果见表1、表2。与假手术组相比，模型组大鼠在冠脉结扎后5、10、15、30min心电图ST段、T波均显著升高。与模型组相比较，阳性药组、延龄草皂苷1(延龄草皂苷2、3)高、中剂量组均可显著对抗结扎冠脉导致大鼠ST段、T波的升高(p＜0.05或p＜0.01)。

3.2延龄草皂苷对心肌缺血大鼠心肌梗塞范围的影响

结果见表3。与假手术组相比较，模型组大鼠心肌梗塞范围显著升高；与模型组相比较，阳性药组、延龄草皂苷1(延龄草皂苷2、3)高、中剂量组均能显著降低心肌梗塞范围(p＜0.01或p＜0.05)，说明阳性药组、延龄草皂苷1(延龄草皂苷2、3)高、中剂量组均能增加缺血区血液供应，降低心肌缺血性损害。

表3延龄草皂苷对心肌缺血大鼠心肌梗塞范围的影响(n＝8)

注：与假手术组比较，^##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3延龄草皂苷对心肌缺血大鼠血清酶CK、LDH的影响

结果见表4。与假手术组相比较，模型组大鼠在结扎冠脉后血清中CK、LDH活力显著升高；与模型组相比较，阳性药组、延龄草皂苷1(延龄草皂苷2、3)高、中剂量组血清中CK、LDH活性显著降低(p＜0.05或p＜0.01)，提示阳性药组、延龄草皂苷1(延龄草皂苷2、3)高、中剂量组对心肌的缺血损伤有保护作用。

表4延龄草皂苷对心肌缺血大鼠血清酶CK、LDH活力的影响(n＝8)

注：与假手术组比较，^##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

4实验小结：

心肌缺血是由于心脏血和氧的供需失去平衡所致，是冠心病等缺血性心脏病发生的主要病理生理机制。在心肌缺血有关实验研究中，实验动物的心电图改变是重要的观察指标之一，ST段及T波高度的变化是心肌缺血最早期出现的、最敏感和确切的指标一，常用于判断心肌缺血模型的复制是否成功及评价药物的抗心肌缺血药效。心肌缺血时心电图所表现出的ST段抬高是由于心外膜缺血区内部分发生去极化的心肌细胞与非缺血区心肌细胞之间形成的一过性损伤电流所引起的，T波升高是由于心内膜下心肌缺血。因此，通常将ST段及T波的变化值作为评价大鼠心肌缺血损伤的主要指标。

CK是一个与细胞内能量转运、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆的催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。主要分布在骨骼肌、心肌和脑细胞中。其主要功能为：在三磷酸腺苷(ATP)作用下，催化肌酸磷酸化，形成磷酸肌酸和二磷酸腺苷(ADP)，以及催化磷酸肌酸的高能磷酸键转移给二磷酸腺苷(ADP)生成三磷酸腺苷(ATP)，并形成肌酸。心肌缺血后细胞膜受到不同程度的损伤，肌酸激酶会从受损细胞中释放入血，使血清中肌酸激酶水平迅速提高，肌酸激酶是心肌梗死的重要血生化指标。

LDH是一种寡聚酶，可催化乳酸及丙酮酸的可逆转化。该酶广泛分布在心肌、红细胞、骨骼肌和肝脏中，它在细胞液中的含量非常丰富，因而所催化的反应非常迅速，是细胞呼吸链上的重要生物酶。组织缺氧时，细胞糖酵解作用旺盛，丙酮酸在LDH作用下转变成乳酸的过程加强，LDH活性的升高意味着无氧酵解过程加强，有氧氧化过程受抑制，能量供应障碍。所以血清中LDH的活性可反映心肌缺血损伤的范围和严重程度，其活性越高，反映心肌损伤越重。

本实验研究发现，大鼠左冠脉前降支结扎后，心电图ST段、T波均显著升高，心肌梗塞范围显著增加，血清中CK、LDH活力明显升高，提示心肌缺血造模成功。延龄草皂苷1(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-βD-葡萄糖苷)、延龄草皂苷2(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷)和延龄草皂苷3(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷)的高、中剂量组均能显著降低模型大鼠ST段和T波的异常抬高，显减少心肌缺血大鼠的心肌梗塞范围，抑制血清中CK、LDH的活力，提示延龄草皂苷1(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-βD-葡萄糖苷)、延龄草皂苷2(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷)和延龄草皂苷3(偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷)的高、中剂量组对冠脉结扎所致心肌缺血有一定的防治作用。

实施例7

延龄草皂苷类物质中偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-βD-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-βD-葡萄糖苷的波谱数据信息与解析。

1.偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷(pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside)，无色针晶(甲醇)，分子式为C₃₉H₆₂O₁₃。¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)：δ0.76(3H，d，J＝6.0Hz，CH₃-27)，0.83(3H，s，CH₃-18)，0.87(3H，s，CH₃-19)，1.04(3H，brs，CH₃-21)，1.19(3H，m，RhaCH₃-6″)；5.36(1H，s，H-6)，3.62(2H，m，H-26)，4.85(1H，d，GlcH-1′)，5.92(1H，s，RhaH-1″)。¹³C-NMR(CDCl₃，100MHz)：δ36.8(C-1)，31.4(C-2)，80.5(C-3)，37.1(C-4)，141.4(C-5)，121.9(C-6)，33.6(C-7)，31.3(C-8)，54.1(C-9)，36.1(C-10)，22.4(C-11)，31.7(C-12)，43.8(C-13)，51.3(C-14)，30.6(C-15)，90.5(C-16)，90.3(C-17)，16.8(C-18)，19.1(C-19)，46.9(C-20)，18.6(C-21)，110.0(C-22)，33.9(C-23)，26.9(C-24)，30.3(C-25)，66.9(C-26)，16.7(C-27)，99.8(C-1′)，79.2(C-2′)，77.9(C-3′)，73.7(C-4′)，77.1(C-5′)，62.7(C-6′)，100.8(C-1″)，72.3(C-2″)，71.8(C-3″)，71.7(C-4″)，68.5(C-5″)，19.2(C-6″)。分子结构式见图1。

2.偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷(pennogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]一β-D-glucopyranoside)，白色针晶(甲醇)，分子式为C₄₅H₇₁O₁₇。¹H-NMR(CDCl₃，400MHz)：δ0.76(3H，d，J＝6.0Hz，CH₃-27)，0.83(3H，s，CH₃-18)，0.87(3H，s，CH₃-19)，1.04(3H，brs，CH₃-21)，1.20(3H，d，J＝6.0Hz，Rha′CH₃-6)，1.23(3H，d，J＝6.8HzRha″CH₃-6)，5.36(1H，brs，H-6)，4.88(1H，d，GlcH-1)，5.49(1H，s，Rha′H-1)，6.17(1H，s，Rha″H-1)。¹³C-NMR(CDCl₃，100MHz)：δ36.8(C-1)，31.3(C-2)，80.5(C-3)，37.2(C-4)，141.4(C-5)，121.9(C-6)，33.6(C-7)，31.4(C-8)，54.1(C-9)，36.1(C-10)，22.4(C-11)，31.7(C-12)，43.8(C-13)，51.3(C-14)，30.8(C-15)，90.5(C-16)，90.3(C-17)，16.8(C-18)，19.1(C-19)，46.9(C-20)，18.6(C-21)，110.2(C-22)，33.9(C-23)，26.9(C-24)，30.3(C-25)，66.9(C-26)，16.8(C-27)，100.2(GlcC-1′)，79.2(C-2′)，77.9(C-3′)，76.7(C-4′)，77.1(C-5′)，62.7(C-6′)，101.8(Rha′C-1″)，72.3(C-2″)，71.8(C-3″)，71.0(C-4″)，69.7(C-5″)，19.2(C-6″)，102.5(Rha″C-1″′)，72.7(C-2″′)，72.4(C-3″′)，77.1(C-4″′)，70.6(C-5″′)，19.2(C-6″′)。分子结构式见图2。