用于CT成像和光热治疗的金壳包裹碘代纳米粒子及其制备

摘要

本发明涉及一种用于CT成像和光热治疗的金壳包裹碘代纳米粒子及其制备。它是先合成一种含碘的小分子单体化合物，然后利用沉淀聚合反应获得碘代纳米粒子，随后对碘代纳米粒子进行表面修饰，使其表面带有正电荷，并将带负电荷的金纳米粒子通过静电吸附作用沉积于碘代纳米粒子表面，然后通过将氯金酸还原，在碘代纳米粒子表面生长成金壳，进而在其表面修饰上具有生物相容性的高分子化合物。从而得到兼具CT成像和光热治疗功能的金壳包裹的碘代纳米粒子复合物。本发明将肿瘤的CT成像和光热治疗作用成功的结合在了一起，有望用于肿瘤的早期诊断和治疗等领域，为肿瘤的早期诊断和治疗提供了可靠的理论基础和方法依据。

说明书

技术领域

用于CT成像和光热治疗的金壳包裹碘代纳米粒子及其制备。

背景技术

本发明涉及一种用于CT成像和光热治疗的金壳包裹碘代纳米粒子及其制备，具体说是一种用于CT成像和肿瘤光热治疗的用透明质酸稳定的金壳包裹的碘代纳米粒子造影剂的制备方法及其临床应用，属于医药领域。

发明内容

CT成像技术是基于人体的不同组织对X-射线的衰减能力的不同而对人体的骨骼和组织进行成像的高分辨率成像技术，目前已经作为一种十分便利和高效的影像检查技术成为临床上重要的影像学诊断方法。随着多层螺旋CT的广泛应用和不断发展，CT的空间分辨率得到了显著的提高，而且越来越接近于人类的解剖结构，从而在现代影像学诊断中发挥了重要的作用。CT成像是根据X-线扫描人体后的衰减系数值来反映不同的的组织密度，从而形成不同组织或器官的灰阶影像对比分布图，进而以病灶的相对位置、形状和大小等改变来对病情进行判断。但是由于某些结构或者器官与周围组织缺乏自然对比，一些病灶部位或组织就无法被发现或者进行明确的诊断。因此，CT的一些低组织分辨率就要求使用造影剂来增加病变组织与正常组织的密度差别，使得肿瘤或者器官显像。因此，发展多功能、高特异性和高灵敏度的CT影像学造影剂来提高肿瘤的早期诊断和疾病的精确诊断是当前医学和影像诊断学的发展趋势。理想的CT造影剂应该具备如下条件：X-线下有优良的显影效果；具有很好的生物相容性和体内稳定性；无细胞毒性；能特异地被肿瘤细胞内化或结合在细胞表面等。

临床上最常使用的CT造影剂是小分子碘类造影剂，碘元素密度高且对X-线具有良好的吸收性，能够显示出优异的对比增强效果。普通的水溶性小分子碘造影剂在体内易被肾脏清除而显影时间偏短。目前的X-射线造影剂有纳米级的碘油，包入脂质体的碘造影剂，在显影时间上能有所延长。碘化合物在临床诊断上的广泛使用促进了碘代纳米材料的发展，肿瘤新生血管有通透性增加和淋巴循环不良的特点，因此纳米级的CT造影剂能在肿瘤部位蓄积较长的时间，即肿瘤增强渗透滞留（EnhancedPermeationandRetention，EPR）效应。碘代的纳米粒子可以增加局部的碘浓度，显著的增加造影的效果。碘代纳米粒子的一个主要特点是它们的药代动力学与小分子碘造影剂明显不同，他们有更长的体循环时间，增加了造影剂与作用靶点结合的机率。有研究表明，纳米级造影剂不但能有效延长成像时间，而且能减弱对肾脏的毒、副作用。

近年来，人们发现金纳米材料有相对于碘剂较高的X-线吸收系数及良好的生物相容性，有望成为未来临床CT造影剂。典型的金纳米颗粒一般是以金纳米粒子为核心且外层包裹上具有生物相容性的有机高分子层，通过改变该分子层的化学性质并对其进行不同的化学修饰，便可改变金纳米颗粒的稳定性和分散性，也可以连接上不同的功能基团，使金纳米粒子在体内具有良好的生物相容性和组织器官靶向性。目前，对于金纳米材料的研究已经取得了很大的进步，人们不但制备出不同尺寸大小的纳米粒子，而且还可以对其反应条件加以控制，制备出不同形貌特征的金纳米材料。金纳米壳就是一种新型的金纳米材料，其拥有金纳米颗粒具备的物理性质，尤其是光照下金属集体电子反应的强吸收性。而且，金纳米壳在近红外区有强大的表面等离子体共振吸收，可以用于癌症或其它生物系统疾病的热成像和光热治疗。

本发明是制备了一种碘代的纳米粒子，并对其表面进行一系列的修饰，最后在还原剂的作用下将金壳包裹在碘代纳米粒子的表面，并对金壳表面修饰上具有生物相容性和靶向性的多糖分子，使合成的纳米粒子具有良好的分散性、生物相容性，从而达到体内CT成像和光热治疗的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于CT成像和光热治疗的金壳包裹碘代纳米粒子及其制备，具体说是一种用于CT成像和肿瘤光热治疗的用透明质酸稳定的金壳包裹的碘代复合纳米粒子造影剂的制备方法及其临床应用。将具有造影诊断功能的碘代纳米粒子和兼具有造影和光消融热疗作用的纳米金结合在一起，制备一类集肿瘤造影诊断和治疗于一体的多功能纳米材料复合物，实现诊断和治疗的一体化，能同时满足肿瘤诊断和治疗的需要。

本发明提供的用于CT成像和光热治疗的金壳包裹碘代复合纳米粒子为：金纳米粒子负载在碘代纳米粒子的表面并且形成纳米金壳层，在金壳表面具有修饰的高分子多糖；

制备方法：氨基碘代化合物为单体，在引发剂和交联剂的作用下进行聚合反应形成的碘代纳米粒子；然后碘代纳米粒子经表面修饰后吸附金纳米粒子，最后进行金壳生长和高分子多糖化合物修饰。

所述的金纳米粒子粒径为1-20nm。

所述的金壳包裹碘代纳米粒子粒径为100-300nm。

本发明提供的一种用于CT成像和光热治疗的金壳包裹碘代复合纳米粒子的制备方法包括的步骤：

1）首先将有机溶剂溶液中氨基碘代化合物（如3-氨基-2,4,6-三碘苯甲酸）与一端含有双键的酰氯进行化学合成反应（如甲基丙烯酰氯），形成用于制备碘代纳米粒子的单体化合物。

2）碘代纳米粒子的单体化合物在引发剂和交联剂的作用下，加热进行沉淀聚合反应。

3）对所形成的碘代纳米粒子进行表面修饰，使其表面带有正电荷，然后利用静电吸附作用，使带正电荷的金纳米粒子沉积在碘代纳米粒子的表面。

4）将沉积有金纳米的碘代纳米粒子与氯金酸混合，在还原剂的作用下，将氯金酸还原，使金壳沉积在碘代纳米粒子的表面。随后在超声和搅拌的作用下将多糖化合物修饰在其表面上，得到了具有CT成像和光热治疗性能的复合纳米粒子。

所述的酰氯是甲基丙烯酰氯或丙烯酰氯等含有双键的酰氯化合物。

所述的含有氨基碘代化合物是3-氨基-2,4,6-三碘苯甲酸及其所有的含有氨基的三碘苯甲酸结构或者三碘苯甲酸酯类结构的化合物。

所述的引发剂是偶氮二异丁腈，偶氮二异庚腈，过氧化二苯甲酰，叔丁基过氧化氢，过氧化二碳酸二环己酯，偶氮二异丁酸二甲酯等；

所述的交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，乙二醇二甲基丙烯酸脂等；所述的溶剂为乙腈，乙醇，乙酸，甲苯等。

所述的修饰剂为聚乙烯亚胺，聚氨基酯，壳聚糖，聚ε-赖氨酸等，所述的金纳米粒子粒径为1-20nm。

所述的还原剂为盐酸羟胺，抗坏血酸，硼氢化钠等，多糖化合物为透明质酸、阿拉伯胶、海藻酸、肝素等，分子量为10000~200000。优选透明质酸、肝素。

本发明提供的一种用于CT成像和光热治疗的金壳包裹碘代复合纳米粒子的制备方法包括的步骤：

1）在N,N’-二甲基乙酰胺溶液中，3-氨基-2,4,6-三碘苯甲酸与甲基丙烯酰氯于25－50℃温度下搅拌反应8-12h，反应液在室温下加入水中，搅拌反应4-5h后，得到沉淀产物，无水乙醇重结晶并于真空烘箱干燥，得到2－甲基丙烯酰（3－胺－2，4，6－三碘苯甲酸）（2-Methacryl(3-amide-2,4,6-triiodobenzoicacid)，MATIB）产物；3-氨基-2,4,6-三碘苯甲酸与甲基丙烯酰氯质量/摩尔比：1:1～1:8。

2）在乙腈与乙醇混合溶剂（v/v10:1）中，2－甲基丙烯酰（3－胺－2，4，6－三碘苯甲酸），N,N’-二甲基双丙烯酰胺，偶氮二异丁腈加热回流反应30-40min，离心(12000转/分钟，20min)分离出沉淀，沉淀产物用乙腈至少洗三遍，得到碘代纳米粒子(Poly(2-methacryl(3-amide-2,4,6-triiodobenzoicacid)),PMATIB)，分散到水中保存。2－甲基丙烯酰（3－胺－2，4，6－三碘苯甲酸），N,N’-二甲基双丙烯酰胺，偶氮二异丁腈的质量比为10-100：1-10：1-5。

3）PMATIB溶液加入到聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine,PEI）中反应1-2h，将反应液离心(13000转/分钟，30min)弃去上清，得到沉淀产物PMATIB/PEI，用水超声分散，离心除去未反应的PEI，并将PMATIB/PEI分散至水中，4℃保存待用。PMATIB与PEI的质量比为1：5-50。

4）将上述的PMATIB/PEI溶液加入到新制备的金纳米粒子（Goldnanoparticles，AuNPs）中吸附4-6h之后离心，除去其中多余的AuNPs，得到复合纳米粒子PMATIB/PEI/AuNPs。PMATIB/PEI与AuNPs的质量比为1：0.5-5。

AuNPs制备方法：用超纯水将0.58mL的HAuCl₄溶液（1%w/v）稀释成200mL，在剧烈搅拌之下，加入6mL的柠檬酸钠溶液（1%w/v），2mL的硼氢化钠(0.075%w/v)的柠檬酸钠溶液（1%w/v）溶液迅速加入，将上述溶液继续搅拌5min后，储于4℃待用。

5）PMATIB/PEI/AuNPs的溶液中加入柠檬酸钠溶液和HAuCl₄溶液，搅拌和超声，然后加入盐酸羟胺，反应20-30min，再加入透明质酸搅拌6-10h，金壳覆盖于PMATIB/PEI/AuNPs的表面并修饰多糖化合物，得到纳米粒子产物用水通过三次超声和离心循环纯化，最后得到金壳包裹碘代复合纳米粒子。PMATIB/PEI/AuNPs，柠檬酸钠，HAuCl₄和盐酸羟胺的质量比为400-500：2：1：280，金壳包裹的金纳米粒子与透明质酸(Hyaluronicacid,HA)的质量比为：1：10-50。纳米粒子粒径为100～300nm。

本发明提供了用于CT成像和光热治疗的金壳包裹碘代复合纳米粒子的制备方法。本发明合成的基于CT成像和肿瘤光热治疗的金壳包裹碘代复合纳米粒子的显著优点是：

1、本发明是制备一种用于CT成像的造影剂，所制备的纳米复合物与小分子碘代造影相比，具有如下显著的优点：良好的生物相容性，不会引起人体的不良反应；具有强X射线衰减系数，能够应用于X线CT成像；具有良好的稳定性，较长的体内循环时间；可通过被动靶向富集于肿瘤部位。

2、本发明是一种金壳包裹的碘代纳米粒子CT造影剂，当金与碘这两种不透X-射线元素结合在一起时，二者具有协同作用，显示出显著增强的X射线衰减效应，更加有利于CT成像。

3、本发明合成的是一种金壳包裹的碘代纳米粒子，一方面作为CT造影剂，可以对小病灶进行显示；另一方面，由于金在近红外区有强大的表面等离子体共振吸收，不仅通过热疗杀伤肿瘤效果明确，而且绿色环保，无辐射，无化疗毒副作用，可以用于CT影像指导下的癌症或其它生物系统疾病的热成像和光热治疗。

总之，本发明提供的制备方法简便高效、可行，而且可控性比较强。并且根据本发明方法所得产品有很好的生物相容性，低毒性，而且可以根据需要来调控碘代纳米粒子及其复合物的尺寸大小，使其可以进入肿瘤细胞或结合在肿瘤细胞的表面，来达到对于肿瘤部位的造影和进行光热治疗的效果。这对于碘代的CT造影剂和肿瘤的光热治疗领域都具有很大的实际应用意义。

附图说明

图1、实施例1中合成的含碘小分子化合物的核磁图谱。

图2、实施例1中合成的碘代纳米粒子的电镜图。

图3、实施例1中合成的聚乙烯亚胺修饰碘代纳米粒子的电镜图。

图4、实施例1中合成的金纳米粒子修饰的碘代纳米粒子的电镜图。

图5、实施例1中合成的透明质酸修饰的金壳包裹碘代纳米粒子的电镜图。

图6、实施例1中合成的碘代纳米粒子（PMATIB）、聚乙烯亚胺修饰碘代纳米粒子（PMATIB/PEI）、金纳米粒子修饰的碘代纳米粒子（PMATIB/PEI/AuNPs）和透明质酸修饰的金壳包裹碘代纳米粒子（PMATIB/PEI/AuNPs/HA）的红外光谱图

图7、实施例1中合成的碘代纳米粒子（PMATIB）、聚乙烯亚胺修饰碘代纳米粒子（PMATIB/PEI）、金纳米粒子修饰的碘代纳米粒子（PMATIB/PEI/AuNPs）和透明质酸修饰的金壳包裹碘代纳米粒子（PMATIB/PEI/AuNPs/HA）的紫外可见吸收光谱图。

图8、实施例1中合成的透明质酸修饰的金壳包裹碘代纳米粒子（PMATIB/PEI/AuNPs/HA）在近红外激光照射下的光热转换曲线（808nm,1.4W/cm²）。

图9、实施例1中合成的碘代纳米粒子（PMATIB）和透明质酸修饰金壳包裹的碘代纳米粒子（PMATIB/PEI/AuNPs/HA）X-射线衰减效率图。

图10、实施例1中合成的透明质酸修饰的金壳包裹碘代纳米粒子（PMATIB/PEI/AuNPs/HA）对人乳腺癌细胞MCF-7的毒性作用及其体外对肿瘤细胞的光热治疗性能。

图11、实施例1中合成的透明质酸修饰的金壳包裹碘代纳米粒子通过尾静脉注射到接种有人乳腺肿瘤的小鼠体内后0h，6h，24h的CT成像图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，它们只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制。除特别标明外，所用试剂和测试设备均为市售。

实施例1：

第一步：用化学合成的方法合成含碘的小分子化合物2－甲基丙烯酰（3－胺－2，4，6－三碘苯甲酸（MATIB）：3-氨基-2,4,6-三碘苯甲酸4.0g，溶解于16mL干燥的N,N’-二甲基乙酰胺溶液中，在25℃温度下，将2.5mL的甲基丙烯酰氯缓慢滴加到溶解有3-氨基-2,4,6-三碘苯甲酸的N,N’-二甲基乙酰胺的溶液中，滴加完成之后，将该反应体系温度升高到50℃，并继续反应12h，反应结束后，将上述反应液在25℃下缓慢滴入80mL水中，搅拌反应5h后，得到沉淀即为产物，沉淀在无水乙醇中重结晶并于真空烘箱干燥，计算得产率约为75.3%。此单体的核磁图见附图1。

第二步：用沉淀聚合的方法制备碘代纳米粒子（PMATIB）：称取第一步中制得的化合物MATIB450mg，N,N’-二甲基双丙烯酰胺75mg，偶氮二异丁腈10mg，溶解于72mL乙腈、7.2mL乙醇（v/v10:1），加热使该反应体系在30min内沸腾，保持40min后终止反应。将反应液离心(12000转/分钟，20min)，沉淀用乙腈至少洗三遍。最后将得到的PMATIB分散到10mL水中保存。碘代纳米粒子PMATIB的电镜图见附图2。

第三步：对第二步中的碘代纳米粒子进行表面的修饰：将29μg/mL的PMATIB溶液，缓慢逐滴加入到1mL，1mg/mL的聚乙烯亚胺（PEI）中，使其吸附两小时后，将反应液离心(13000转/分钟，30min)弃去上清，沉淀多次洗涤，之后将PMATIB/PEI分散至1mL水中，4℃保存待用。复合纳米粒子PMATIB/PEI的电镜图见附图3。

第四步：将第三步中的PMATIB/PEI碘代纳米粒子进行吸附金纳米粒子（AuNPs）：首先进行AuNPs的制备：用超纯水将0.58mL的HAuCl₄溶液（1%w/v）稀释成200mL，在剧烈搅拌之下，加入6mL的柠檬酸钠溶液（1%w/v），2mL的硼氢化钠(0.075%w/v)的柠檬酸钠溶液（1%w/v）溶液迅速加入，将上述溶液继续搅拌5min后，储于4℃待用。将1mL的PMATIB/PEI溶液逐滴加入到100mL的AuNPs溶液中吸附4h之后离心，除去其中多余的AuNPs。复合纳米粒子PMATIB/PEI/AuNPs的电镜图见附图4。

第五步：将第四步中吸完AuNPs的碘代纳米粒子（PMATIB/PEI/AuNPs）进行金壳生长并修饰透明质酸：在机械搅拌和超声的共同作用下，0.6mL的柠檬酸钠溶液（1%w/v）和0.353mL的HAuCl₄溶液（1%w/v）加入到60mL的PMATIB/PEI/AuNPs的溶液中（0.048μg/mL），之后0.3mL的盐酸羟胺（80mM）逐滴加入到反应体系中，反应持续30min，50mLHA（0.2mg/mL）滴加到反应体系当中，持续搅拌6h。产物用水通过三次超声和离心纯化。

这样，HAuCl₄就在还原剂盐酸羟胺的作用下还原成了金壳，覆盖于PMATIB/PEI/AuNPs的表面。另外，HA修饰在金壳的表面，使其有很好的分散性，并且，也可以降低其毒性。复合纳米粒子的电镜图见附图5。

复合纳米粒子的粒径为100-300nm。

复合纳米粒子的红外光谱、紫外可见近红外光谱、光热转化效率和X线衰减效率检测结果分别参见附图6、7、8、9。

第六步：测定不同浓度下的透明质酸修饰的金壳对于人乳腺癌细胞（MCF-7）的毒性：采用MTT的方法对PMATIB/PEI/AuNPs/Aushell/HA的体外毒性进行表征。取对数生长期细胞以8×10³个/孔接种于96孔板，每组设6个复孔。将不同浓度的PMATIB/PEI/AuNPs/Aushell/HA碘代纳米粒子分别与MCF-7细胞孵育6h后，其中每组的三个复孔给以激光照射（1.4W/cm²，10min），另三个复孔不做处理。继续孵育18h后，加入20μL四甲基偶氮唑盐溶液（5mg/mL）进行孵育3.5-4h后，吸出孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪（Bio-Rad,iMarkMicroplateReader）在490nm处测量各孔的吸光值。该复合纳米粒子的细胞毒性结果参见附图10。

第七步：碘代纳米粒子PMATIB/PEI/AuNPs/Aushell/HA的体内肿瘤部位的CT成像及其对于肿瘤细胞的热疗作用：300μL，15.2mgAu/mL的PMATIB/PEI/AuNPs/Aushell/HA通过尾静脉注射到接种有人乳腺肿瘤的小鼠体内，并在注射后0h，6h，24h后对其进行CT成像的扫描，以此可以观察各个时间点小鼠各部位及其肿瘤部位成像的变化和CT值的大小。该复合纳米粒子的体内CT成像结果参见附图11。

实施例2

第一步：用化学合成的方法合成含碘的小分子化合物2－甲基丙烯酰（3－胺－2，4，6－三碘苯甲酸（MATIB）：3-氨基-2,4,6-三碘苯甲酸4.0g，溶解于16mL干燥的N,N’-二甲基乙酰胺溶液中，在25℃温度下，将2.5mL的甲基丙烯酰氯缓慢滴加到溶解有3-氨基-2,4,6-三碘苯甲酸的N,N’-二甲基乙酰胺的溶液中，滴加完成之后，将该反应体系温度升高到50℃，并继续反应12h，反应结束后，将上述反应液在25℃下缓慢滴入80mL水中，搅拌反应5h后，得到沉淀即为产物，沉淀在无水乙醇中重结晶并于真空烘箱干燥，计算得产率约为75.3%。

第二步：用沉淀聚合的方法制备碘代纳米粒子（PMATIB）：称取第一步中制得的化合物MATIB450mg，N,N’-二甲基双丙烯酰胺75mg，偶氮二异丁腈10mg，溶解于72mL乙腈、7.2mL乙醇（v/v10:1），加热使该反应体系在30min内沸腾，保持40min后终止反应。将反应液离心(12000转/分钟，20min)，沉淀用乙腈至少洗三遍。最后将得到的PMATIB分散到10mL水中保存。

第三步：对第二步中的碘代纳米粒子进行表面的修饰：将29μg/mL的PMATIB溶液，缓慢逐滴加入到1mL，1mg/mL的壳聚糖（CS）中，使其吸附两小时后，将反应液离心(13000转/分钟，30min)弃去上清，沉淀多次洗涤，之后将PMATIB/CS分散至1mL水中，4℃保存待用。

第四步：将第三步中的PMATIB/CS碘代纳米粒子进行吸附金纳米粒子（AuNPs）：首先进行AuNPs的制备：用超纯水将0.58mL的HAuCl₄溶液（1%w/v）稀释成200mL，在剧烈搅拌之下，加入6mL的柠檬酸钠溶液（1%w/v），2mL的硼氢化钠(0.075%w/v)的柠檬酸钠溶液（1%w/v）溶液迅速加入，将上述溶液继续搅拌5min后，储于4℃待用。将1mL的PMATIB/CS溶液逐滴加入到100mL的AuNPs溶液中吸附4h之后离心，除去其中多余的AuNPs。

第五步：将第四步中吸完AuNPs的碘代纳米粒子（PMATIB/CS/AuNPs）进行金壳生长并修饰透明质酸：在机械搅拌和超声的共同作用下，0.6mL的柠檬酸钠溶液（1%w/v）和0.353mL的HAuCl₄溶液（1%w/v）加入到60mL的PMATIB/CS/AuNPs的溶液中（0.048μg/mL），之后0.3mL的盐酸羟胺（80mM）逐滴加入到反应体系中，反应持续30min，50mLHA（0.2mg/mL）滴加到反应体系当中，持续搅拌6h。产物用水通过三次超声和离心纯化。

第六步：测定不同浓度下的透明质酸修饰的金壳对于人乳腺癌细胞（MCF-7）的毒性：采用MTT的方法对PMATIB/CS/AuNPs/Aushell/HA的体外毒性进行表征。取对数生长期细胞以8×10³个/孔接种于96孔板，每组设6个复孔。将不同浓度的PMATIB/CS/AuNPs/Aushell/HA碘代纳米粒子分别与MCF-7细胞孵育6h后，其中每组的三个复孔给以激光照射（1.4W/cm²，10min），另三个复孔不做处理。继续孵育18h后，加入20μL四甲基偶氮唑盐溶液（5mg/mL）进行孵育3.5-4h后，吸出孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪（Bio-Rad,iMarkMicroplateReader）在490nm处测量各孔的吸光值。

第七步：碘代纳米粒子PMATIB/CS/AuNPs/Aushell/HA的体内肿瘤部位的CT成像及其对于肿瘤细胞的热疗作用：300μL，15.2mgAu/mL的PMATIB/CS/AuNPs/Aushell/HA通过尾静脉注射到接种有人乳腺肿瘤的小鼠体内，并在注射后0h，6h，24h后对其进行CT成像的扫描，以此可以观察各个时间点小鼠各部位及其肿瘤部位成像的变化和CT值的大小。

实施例3

第一步：用化学合成的方法合成含碘的小分子化合物2－甲基丙烯酰（3－胺－2，4，6－三碘苯甲酸（MATIB）：3-氨基-2,4,6-三碘苯甲酸4.0g，溶解于16mL干燥的N,N’-二甲基乙酰胺溶液中，在25℃温度下，将2.5mL的甲基丙烯酰氯缓慢滴加到溶解有3-氨基-2,4,6-三碘苯甲酸的N,N’-二甲基乙酰胺的溶液中，滴加完成之后，将该反应体系温度升高到50℃，并继续反应12h，反应结束后，将上述反应液在25℃下缓慢滴入80mL水中，搅拌反应5h后，得到沉淀即为产物，沉淀在无水乙醇中重结晶并于真空烘箱干燥，计算得产率约为75.3%。

第二步：用沉淀聚合的方法制备碘代纳米粒子（PMATIB）：称取第一步中制得的化合物MATIB450mg，N,N’-二甲基双丙烯酰胺75mg，偶氮二异丁腈10mg，溶解于72mL乙腈、7.2mL乙醇（v/v10:1），加热使该反应体系在30min内沸腾，保持40min后终止反应。将反应液离心(12000转/分钟，20min)，沉淀用乙腈至少洗三遍。最后将得到的PMATIB分散到10mL水中保存。

第三步：对第二步中的碘代纳米粒子进行表面的修饰：将29μg/mL的PMATIB溶液，缓慢逐滴加入到1mL，1mg/mL的PEI中，使其吸附两小时后，将反应液离心(13000转/分钟，30min)弃去上清，沉淀多次洗涤，之后将PMATIB/PEI分散至1mL水中，4℃保存待用。

第四步：将第三步中的PMATIB/PEI碘代纳米粒子进行吸附金纳米粒子（AuNPs）：首先进行AuNPs的制备：用超纯水将0.58mL的HAuCl₄溶液（1%w/v）稀释成200mL，在剧烈搅拌之下，加入6mL的柠檬酸钠溶液（1%w/v），2mL的硼氢化钠(0.075%w/v)的柠檬酸钠溶液（1%w/v）溶液迅速加入，将上述溶液继续搅拌5min后，储于4℃待用。将1mL的PMATIB/PEI溶液逐滴加入到100mL的AuNPs溶液中吸附4h之后离心，除去其中多余的AuNPs。

第五步：将第四步中吸完AuNPs的碘代纳米粒子（PMATIB/PEI/AuNPs）进行金壳生长并修饰肝素（HP）：在机械搅拌和超声的共同作用下，0.6mL的柠檬酸钠溶液（1%w/v）和0.353mL的HAuCl₄溶液（1%w/v）加入到60mL的PMATIB/PEI/AuNPs的溶液中（0.048μg/mL），之后0.3mL的盐酸羟胺（80mM）逐滴加入到反应体系中，反应持续30min，50mLHP（0.2mg/mL）滴加到反应体系当中，持续搅拌6h。这样，产物用水通过三次超声和离心纯化。

第六步：测定不同浓度下的肝素修饰的金壳对于人乳腺癌细胞（MCF-7）的毒性：采用MTT的方法对PMATIB/PEI/AuNPs/Aushell/HP的体外毒性进行表征。取对数生长期细胞以8×10³个/孔接种于96孔板，每组设6个复孔。将不同浓度的PMATIB/PEI/AuNPs/Aushell/HP碘代纳米粒子分别与MCF-7细胞孵育6h后，其中每组的三个复孔给以激光照射（1.4W/cm²，10min），另三个复孔不做处理。继续孵育18h后，加入20μL四甲基偶氮唑盐溶液（5mg/mL）进行孵育3.5-4h后，吸出孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪（Bio-Rad,iMarkMicroplateReader）在490nm处测量各孔的吸光值。

第七步：碘代纳米粒子PMATIB/PEI/AuNPs/Aushell/HP的体内肿瘤部位的CT成像及其对于肿瘤细胞的热疗作用：300μL，15.2mgAu/mL的PMATIB/PEI/AuNPs/Aushell/HP通过尾静脉注射到接种有人乳腺肿瘤的小鼠体内，并在注射后0h，6h，24h后对其进行CT成像的扫描，以此可以观察各个时间点小鼠各部位及其肿瘤部位成像的变化和CT值的大小。