CABYR-a/b在促进肿瘤细胞对VP16和TRAIL的敏感性中的应用

摘要

本发明公开了CABYR-a/b在促进肿瘤细胞对VP16和TRAIL的敏感性中的应用。本发明提供了CABYR蛋白抑制剂在如下(a)-(c)任一中的应用：(a)促进肿瘤细胞对VP16和/或TRAIL敏感性；(b)制备用于促进肿瘤细胞对VP16和/或TRAIL敏感性的产品；(c)制备用于协同VP16和/或TRAIL治疗肿瘤的产品。实验证明，沉默CABYR-a/b能够促进肿瘤细胞中DR5蛋白表达，增强VP16诱导所致肿瘤细胞中caspase3断裂，增强VP16和/或TRAIL诱导所致肿瘤细胞的凋亡。本发明研究结果表明CABYR-a/b蛋白抑制剂对于协同VP16和/或TRAIL治疗肿瘤(如肺癌)具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及CABYR-a/b在促进肿瘤细胞对VP16和TRAIL的敏感性中 的应用。

背景技术

钙离子结合酪氨酸磷酸化调节蛋白(calcium-bindingtyrosinephosphorylation-regulated protein，CABYR)，于2002年首次在精子中发现，其包括6个转录本编码5种蛋白亚型，包括 CABYR-a,-b,-c,-d,和-e(两个转录本同时编码相同的亚型，CABYR-c)。CABYR具有睾丸特异性， 其定位于精子细胞的胞质和成熟精子的鞭毛中。根据文献报道，CABYR在多种癌症中表达，如 脑癌、食管癌、肝癌和肺癌。然而关于CABYR生物学功能上的作用，只有在肝癌和肺癌中有极 少的报道，如在HepG2(人肝癌细胞)中沉默CABYR-c可使细胞生长速度减慢。CABYR的生 物功能有待于后续的实验进程中慢慢发掘。

Etoposide(依托泊甙，简称VP16)，主要作用于DNA拓扑异构酶(Topo)，抑制DNA的 合成，干扰Topo使DNA断裂重新连接，抑制有丝分裂，使细胞分裂停止在晚S期或早G2期， 是细胞周期特异性药物。

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)，可以在人类的多种肿瘤细胞中发挥强烈的诱 导凋亡的作用[7-10]。截至目前，TRAIL被发现存在5种受体，而只有其中的两种(DR4和DR5) 具有胞质死亡结构域，正是这些结构域可以与TRAIL结合激活胞外及胞内的凋亡通路。多种临 床药物可以上调TRAIL死亡受体的表达进而同TRAIL相互作用，如DR4-和DR5-竞争的单克隆 抗体可以实现肿瘤细胞凋亡的功能。TRAIL的死亡受体具有可以选择性的损伤肿瘤细胞而不会 造成正常细胞损伤的特点，引起了抗肿瘤治疗的广泛关注。由于一些肿瘤细胞的细胞特性，产生 了对TRAIL诱导凋亡不敏感的现象的原因依然得不到解释，然而研究发现，对TRAIL敏感的细 胞系其诱导凋亡的机制包括对死亡受体的修饰，Akt的活化和过表达一系列蛋白，如cFLIP、 X-linkedinhibitorofapoptosis(XIAP)、Bcl-xL、suvivin。蛋白的表达或个别试剂的加入可调节 TRAIL抗性的机制，进而提高TRAIL的杀伤效率。

目前为止，尚未见关于CABYR与VP16和TRAIL之间关系的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种CABYR-a/b抑制剂的新用途。

本发明提供了CABYR蛋白抑制剂在如下(a)-(c)任一中的应用：

(a)促进肿瘤细胞对VP16和/或TRAIL的敏感性；

(b)制备用于促进肿瘤细胞对VP16和/或TRAIL的敏感性的产品；

(c)制备用于协同VP16和/或TRAIL治疗肿瘤的产品。

本发明还提供了CABYR蛋白抑制剂在如下(a1)-(a3)至少一种中的应用：

(a1)增强VP16和/或TRAIL诱导所致肿瘤细胞凋亡，和/或制备用于增强VP16和/或TRAIL 诱导所致肿瘤细胞凋亡的产品；

(a2)增强VP16诱导所致肿瘤细胞内caspase3断裂，和/或制备用于增强VP16诱导所致 肿瘤细胞内caspase3断裂的产品；

(a3)促进肿瘤细胞内DR5蛋白表达，和/或制备促进肿瘤细胞内DR5蛋白表达的产品。

活性成分为如下(1)或(2)或(3)的产品也属于本发明的保护范围：

(1)CABYR蛋白抑制剂、VP16和TRAIL；

(2)CABYR蛋白抑制剂和VP16；

(3)CABYR蛋白抑制剂和TRAIL；

所述产品具有如下(b1)-(b4)功能中的至少一种：

(b1)治疗肿瘤；

(b2)促进肿瘤细胞凋亡；

(b3)促进肿瘤细胞内caspase3断裂；

(b4)促进肿瘤细胞内DR5蛋白表达。

所述产品中的各组分分别单独包装。

在本发明中，所述CABYR蛋白为a亚型CABYR蛋白和/或b亚型CABYR蛋白。

相应的，所述CABYR蛋白抑制剂为抑制a亚型CABYR蛋白表达的物质和/或抑制b亚型 CABYR蛋白表达的物质。

进一步，所述抑制a亚型CABYR蛋白表达的物质和所述抑制b亚型CABYR蛋白表达的 物质具体为如下(I)或(II)所示的shRNA或者编码所述shRNA的DNA：(I)将序列表中序 列6中的T均替换为U后所得序列所示的shRNA；(II)将序列表中序列7中的T均替换为U 后所得序列所示的shRNA；相应的，所述“编码所述shRNA的DNA”可为序列表中序列6或 序列7所示的DNA片段或含有所述DNA片段的表达盒或重组质粒。

所述a亚型CABYR蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列4所示；所述b亚型CABYR 蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列5所示。

所述TRAIL是氨基酸序列如序列表中序列1所示的蛋白质。

所述DR5蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列2所示。

所述caspase3是氨基酸序列如序列表中序列3所示的蛋白质；相应的，所述caspase3断裂 为在序列3所示蛋白质的第175位天冬氨酸处断裂。

在本发明中，所述肿瘤细胞凋亡主要为肿瘤细胞早期凋亡。

在本发明中，所述肿瘤具体可为肺癌；所述肿瘤细胞具体可为肺癌细胞；更加具体的，所 述肺癌细胞具体可为NCI-H460细胞或A549细胞。

在本发明中，以上所有的所述产品均可为药物。

在本发明中，所述VP16均指的是化疗药物Etoposide(依托泊甙)。

实验证明，沉默CABYR-a/b能够促进肿瘤细胞中DR5蛋白表达，增强VP16诱导所致肿 瘤细胞中caspase3断裂，增强VP16和/或TRAIL诱导所致肿瘤细胞的凋亡。本发明研究结果表 明CABYR-a/b蛋白抑制剂对于协同VP16和/或TRAIL治疗肿瘤(如肺癌)具有重要意义。

附图说明

图1为沉默NCI-H460细胞中CABYR-a/b的沉默效果的RT-PCR和westernblot检测结果。 其中，shRNA1表示转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞；shRNA2表示转入 沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的克隆细胞；sh-vec表示转入无义干扰序列的克隆细胞。

图2为采用MTT法检测肺癌细胞稳定沉默CABYR-a/b后细胞的存活率的结果(经VP16 处理)。其中，shRNA1和shRNA表示转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞； shRNA2表示转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的克隆细胞；sh-vec表示转入无义干扰 序列的克隆细胞。

图3为采用DAPI对沉默CABYR-a/b的肺癌细胞进行染色，而后用荧光显微镜观察凋亡细 胞结果(经VP16处理)。其中，A为NCI-H460相关细胞；B为A549相关细胞。shRNA1和shRNA 表示转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞；shRNA2表示转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的克隆细胞；sh-vec表示转入无义干扰序列的克隆细胞。

图4为AnnexinV/PI染色后采用流式分析仪定量检测细胞早期和晚期的凋亡率(经VP16处 理)。其中，A为NCI-H460相关细胞；B为A549相关细胞。shRNA1和shRNA表示转入沉默 载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞；shRNA2表示转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的克隆细胞；sh-vec表示转入无义干扰序列的克隆细胞。

图5为采用westernblot对沉默CABYR-a/b的肺癌细胞联合VP16处理后的凋亡相关的 caspase3进行检测。其中，A为NCI-H460相关细胞；B为A549相关细胞。shRNA1和shRNA 表示转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞；shRNA2表示转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的克隆细胞；sh-vec表示转入无义干扰序列的克隆细胞。

图6为沉默CABYR-a/b后可明显促进体内肺癌细胞对化疗药物VP16的敏感性(肿瘤体积 及重量)。其中，A为肿瘤直观形态图；B为荷瘤体积；C为肿瘤重量。shRNA表示转入沉默载 体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞；sh-vec表示转入无义干扰序列的克隆细胞。

图7为沉默CABYR-a/b后可明显促进体内肺癌细胞对化疗药物VP16的敏感性(肿瘤组织 TUNEL染色)。shRNA表示转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121克隆细胞；sh-vec表示转 入无义干扰序列的克隆细胞。

图8为采用MTT法检测TRAIL处理稳定沉默CABYR-a/b的NCI-H460细胞后的细胞存活 率。shRNA1表示转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞；shRNA2表示转入沉 默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的克隆细胞；shVec表示转入无义干扰序列的克隆细胞。

图9为AnnexinV/7-AAD染色后采用流式分析仪定量检测TRAIL处理稳定沉默CABYR-a/b 的NCI-H460细胞后的细胞凋亡情况。其中，A为未经TRAIL处理组的流式细胞图；B为经TRAIL 处理组的流式细胞图；C为根据B所得的柱形图。shRNA1表示转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞；shRNA2表示转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的克隆细胞；sh-vec表示转入无义干扰序列的克隆细胞。

图10为AnnexinV/7-AAD染色后采用流式分析仪定量检测TRAIL处理向稳定沉默 CABYR-a/b的NCI-H460细胞中重新转入CABYR-a/b后的细胞凋亡情况。其中，A为各组细胞 凋亡情况柱形图；B为各组细胞凋亡情况流式细胞图。其中“-vehicle”表示向相应细胞中导入 pCMV-Myc空载体；“-CA”和CABYR表示向相应细胞中导入用于过表达CABYR-a的重组 质粒pCMV-Myc-CABYR-a。

图11为沉默CABYR-a/b后可明显促进体内肺癌细胞对TRAIL的敏感性。其中，A为各组 小鼠的荷瘤体积；B为各组裸鼠的肿瘤重量；C为各组裸鼠肿瘤的直观形态；D为各组小鼠肿瘤 组织的TUNEL染色结果。shRNA表示转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121克隆细胞； sh-vec表示转入无义干扰序列的克隆细胞。

图12为沉默CABYR-a/b是通过上调DR5的表达提高肺癌细胞对TRAIL诱导的凋亡。其中， A为沉默CABYR-a/b可以增加DR5在mRNA和蛋白水平上的表达；B为利用DR5的特异性抗 体，经过流式细胞术检测细胞膜表面的DR5受体的表达量；D为AD5-10处理后用Annexin V-PE/7-AAD试剂盒检测细胞的凋亡率；C为根据D所得柱形图；E为将TRAIL处理后的细胞 加入100ng/mLDR5特异性抗体进行封闭，使用MTT法检测细胞的凋亡率；F为将TRAIL处理 后的细胞加入200ng/mLDR5特异性抗体进行封闭，使用MTT法检测细胞的凋亡率。E和F中， “-block”表示采用特异性抗DR5的抗体进行了封闭。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所有的定量实验结果均为平行实验的结果平均值。所有的实验均被重复两次及 两次以上。实验组和它们相应的对照组均使用GraphPad软件进行双尾T检验。其中，P值小于 0.05被认为是显著差异。

NCI-H460细胞：记载于“张晓娇,王雪莲,赵峰.鸦胆子油乳抑制肺癌NCI-H460细胞的增 殖及其机制.中国肿瘤生物治疗杂志,2011年05期”一文，公众可从申请人处获得，仅限用于重 复本发明实验使用。

A549细胞：记载于“刘平.艾烟可吸入颗粒物对人肺腺癌A549细胞增殖及基因表达谱的影 响.北京中医药大学,2013年博士论文”一文，公众可从申请人处获得，仅限用于重复本发明实 验使用。

化疗药物VP16，即Etoposide(依托泊甙)：Sigma公司产品，货号E1383。

rhTRAIL：Peprotech公司产品，货号310-04-100。

实施例1、沉默CABYR-a/b可以促进肺癌细胞对化疗药物VP16的敏感性

本实施例会涉及CABYR-a/b蛋白和caspase3蛋白。其中，CABYR-a蛋白(即a亚型CABYR 蛋白)的氨基酸序列如序列表中序列4所示；CABYR-b蛋白(即b亚型CABYR蛋白)的氨基 酸序列如序列表中序列5所示；caspase3蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示；cleaved caspase3是指在序列3所示蛋白质的第175位天冬氨酸处发生断裂。

一、沉默肺癌细胞中的CABYR-a/b

1、构建沉默载体

(1)沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的构建

人工合成如下两条单链DNA分子CABYR-a/b-S1和CABYR-a/b-A1，并将其退火为双链。 然后将pGPH1/Neo载体(上海吉玛制药技术有限公司产品)用限制性内切酶BbsI和BamHI进 行双酶切，回收酶切产物后，将上述退火所得双链与其连接，得到重组载体。将所得重组载体命 名为pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121，其结构描述为：将pGPH1/Neo载体上位于酶切位点BbsI和 BamHI之间的小片段替换为 “5’-GCTGCTCCTCTTGTGTGTTCTTTCAAGAGAAGAACACACAAGAGGAGCAGCTTTTTT G-3’(序列6)”所示DNA片段的重组质粒。

CABYR-a/b-S1：

5’-CACCGCTGCTCCTCTTGTGTGTTCTTTCAAGAGAAGAACACACAAGAGGAGCAGC TTTTTTG-3’；

CABYR-a/b-A1：

5’-GATCCAAAAAAGCTGCTCCTCTTGTGTGTTCTTCTCTTGAAAGAACACACAAGAGG AGCAGC-3’。

由于沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121是针对CABYR-a基因(Genbank：NM_012189.3) 和CABYR-b基因(Genbank：NM_153768.2)的保守部分进行的设计，因此该载体既可以用于 沉默CABYR-a基因也可用于沉默CABYR-b基因。

(2)沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的构建

人工合成如下两条单链DNA分子CABYR-a/b-S2和CABYR-a/b-A2，并将其退火为双链。 然后将pGPH1/Neo载体(上海吉玛制药技术有限公司产品)用限制性内切酶BbsI和BamHI进 行双酶切，回收酶切产物后，将上述退火所得双链与其连接，得到重组载体。将所得重组载体命 名为pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303，其结构描述为：将pGPH1/Neo载体上位于酶切位点BbsI和 BamHI之间的小片段替换为 “5’-GCAGGCTGATATTGAGGTTATTTCAAGAGAATAACCTCAATATCAGCCTGCTTTTTTG-3 ’(序列7)”所示DNA片段的重组质粒。

CABYR-a/b-S2：

5’-CACCGCAGGCTGATATTGAGGTTATTTCAAGAGAATAACCTCAATATCAGCCTGCTT TTTTG-3’；

CABYR-a/b-A2：

5’-GATCCAAAAAAGCAGGCTGATATTGAGGTTATTCTCTTGAAATAACCTCAATATCAG CCTGC-3’。

由于沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303是针对CABYR-a基因(Genbank：NM_012189.3) 和CABYR-b基因(Genbank：NM_153768.2)的保守部分进行的设计，因此该载体既可以用于 沉默CABYR-a基因也可用于沉默CABYR-b基因。

2、沉默肺癌细胞中的CABYR-a/b

待转染肺癌细胞：NCI-H460细胞和A549细胞。

将步骤1构建的沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303分别 按照Lipofectamin^TM2000转染试剂盒(美国Invitrogen公司产品)的操作说明对NCI-H460细胞 进行转染。将步骤1构建的沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121按照Lipofectamin^TM2000转染 试剂盒(美国Invitrogen公司产品)的操作说明对A549细胞进行转染。转染24小时后，将转染 的细胞1：3传代，待细胞贴壁后，加入0.4毫克/毫升G418筛选，直至挑出阳性单克隆细胞株。

实验以携带无义干扰序列的重组质粒pGPH1/Neo-Nonsense替代沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121或pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303，作为阴性对照。

其中，携带无义干扰序列的重组质粒pGPH1/Neo-Nonsense的构建方法如下：

人工合成如下两条单链DNA分子Nonsense-S和Nonsense-A，并将其退火为双链。然后将 pGPH1/Neo载体(上海吉玛制药技术有限公司产品)用限制性内切酶BbsI和BamHI进行双酶 切，回收酶切产物后，将上述退火所得双链与其连接，得到重组载体。将所得重组载体命名为 pGPH1/Neo-Nonsense，其结构描述为：将pGPH1/Neo载体上位于酶切位点BbsI和BamHI之间 的小片段替换为 “GTTCTCCGAACTGTGCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG”所示 DNA片段的重组质粒。

Nonsense-S：

5’-CACCGTTCTCCGAACTGTGCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTT TTG-3’；

Nonsense-A：

5-’GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAG AAC-3’。

3、CABYR-a/b基因沉默效果检测

A.RNA水平RT-PCR检测

从步骤2获得的五个克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列，以及向A549细胞 中分别转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和无义干扰序列)中分别提取总RNA，将其反 转录为cDNA，以所得cDNA作为模板进行PCR扩增，检测各单克隆中CABYR-a/b基因在转录 水平上的表达量。实验同时设置NCI-H460细胞和A549细胞作为阴性对照。

用于扩增CABYR-a/b基因的引物序列如下：

CABYR-a/bF：5’-CGGAATTCATTTCTTCAAAGCCCAGACTT-3’；

CABYR-a/bR：5’-TCATGGGCCCTTATTCAGCTGTTGATTC-3’。

由于该引物对是针对CABYR-a基因(Genbank：NM_012189.3)和CABYR-b基因(Genbank： NM_153768.2)的保守部分进行的设计，因此该引物对既可以用于检测CABYR-a基因也可用于 检测CABYR-b基因。

以GAPDH为内参，其扩增引物序列如下：

GAPDHF：5’-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’；

GAPDHR：5’-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3’。

结果显示：

(1)与作为阴性对照的NCI-H460细胞相比，步骤2获得的向NCI-H460细胞中转入沉默 载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的两种单克隆细胞中 CABYR-a/b基因的表达量明显降低，表达微弱。而步骤2获得的向NCI-H460细胞中转入无义 干扰序列的克隆细胞中CABYR-a/b基因的表达量与阴性对照(NCI-H460细胞)基本一致，无 统计学差异。具体如图1所示。

(2)与作为阴性对照的A549细胞相比，步骤2获得的向A549细胞中转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞中CABYR-a/b基因的表达量明显降低，表达微弱。而步 骤2获得的向A549细胞中转入无义干扰序列的克隆细胞中CABYR-a/b基因的表达量与阴性对 照(A549细胞)基本一致，无统计学差异。

B.蛋白水平Westernblot检测

分别收集步骤2获得的五个克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列，以及向A549细胞 中分别转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和无义干扰序列)，裂解之后把等量蛋白通过 10％的SDS-PAGE胶对其进行蛋白分离，将与凝胶等大小的PVDF膜进行恒流转膜。将一抗由1： 100到1：1000稀释后，进行一抗孵育过夜。TBST洗三次，每次五分钟。二抗孵育37℃，1小 时后，TBST洗三次，每次五分钟。进行化学曝光显影。β-actin作为蛋白量是否一致的衡量标准。 实验同时设置NCI-H460细胞和A549细胞作为阴性对照。

其中，用于检测CABYR-a/b蛋白的一抗为本实验室自行制备，具体是以CABYR-a蛋白和 CABYR-b蛋白的共同部分，即序列4所示CABYR-a蛋白第181-493位(也为序列5所示CABYR-b 蛋白第163-475位)氨基酸所示多肽，为免疫原，免疫BALB/c小鼠后所得的抗血清，参考文献 “ChonglinLuo,XueyuanXiao,DanhuiLiu,etal.CABYRIsaNovelCancer-TesisAntigeninLung Cancer.ClinCancerRes,2007；13(4)”；用于检测β-actin的一抗为鼠抗人β-actin抗体(美国SantaCruz 公司产品，其产品目录号为sc-4778)；二抗为anti-IgG(H+LChains)(Mouse)(HRP)(日本MBL 公司产品，其产品目录号为330)。

结果显示：

(1)与作为阴性对照的NCI-H460细胞相比，步骤2获得的向NCI-H460细胞中转入沉默 载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的两个克隆细胞中CABYR-a/b 蛋白的表达量明显降低，表达微弱。而步骤2获得的向NCI-H460细胞中转入无义干扰序列的克 隆细胞中CABYR-a/b蛋白的表达量与阴性对照(NCI-H460细胞)基本一致，无统计学差异。 具体如图1所示。

(2)与作为阴性对照的A549细胞相比，步骤2获得的向A549细胞中转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞中CABYR-a/b蛋白的表达量明显降低，表达微弱。而步 骤2获得的向A549细胞中转入无义干扰序列的克隆细胞中CABYR-a/b蛋白的表达量与阴性对 照(A549细胞)基本一致，无统计学差异。

二、采用MTT法检测肺癌细胞稳定沉默CABYR-a/b后细胞的存活率

将步骤一2获得的五个克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列，以及向A549细胞 中分别转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和无义干扰序列)分别以8000个/孔接种到96 孔板中。贴壁过夜后，将不同浓度的化疗药物VP16加入到每个孔中，0.1％(0.1g/100ml)BSA 作为对照。每个浓度有四个平行。培养24小时。将待测孔的培养基吸干净后，加入100微升新 鲜培养基，避光加入1毫克/毫升的MTT，37℃孵育3小时后加入SDS裂解液，放置14小时， 酶标仪测定OD_450/630值。将对照细胞的OD值作为对照，从而得出存活率曲线。

实验同时设置NCI-H460细胞和A549细胞作为阴性对照。

结果显示：

(1)与作为阴性对照的NCI-H460细胞相比，当VP16浓度大于10μM时，步骤一2获得的 向NCI-H460细胞中转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303 的两个克隆细胞的存活率明显降低(P<0.01)。而步骤一2获得的向NCI-H460细胞中转入无义 干扰序列的克隆细胞的存活率与阴性对照(NCI-H460细胞)基本一致，无统计学差异。具体如 图2所示。

(2)与作为阴性对照的A549细胞相比，当VP16浓度大于50μM时，步骤一2获得的向 A549细胞中转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞的存活率明显降低(P<0.01)。 而步骤2获得的向A549细胞中转入无义干扰序列的克隆细胞的存活率与阴性对照(A549细胞) 基本一致，无统计学差异。具体如图2所示。

三、采用DAPI对沉默CABYR-a/b的肺癌细胞进行染色，而后用荧光显微镜观察凋亡细胞

供试细胞：步骤2获得的五个克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列，以及向A549细胞 中分别转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和无义干扰序列)，以及NCI-H460细胞和A549 细胞。

将各供试细胞分别以30×10⁴个/孔接种到6孔板中。贴壁过夜后，将化疗药物VP16加入到 每个孔中至其终浓度为30μmol/L。培养24小时后按照如下采用DAPI进行染色，而后用荧光显 微镜观察凋亡细胞。具体如下：药物处理细胞24小时后，甲醇固定细胞，DAPI染色，用荧光 显微镜观察细胞核形态学变化。凋亡的细胞会形成凋亡小体，而正常细胞没有。在荧光显微镜下 每组观察20个视野，计数正常细胞和凋亡细胞，最后统计每组凋亡细胞占总细胞的％。

实验同时设置不经化疗药物VP16处理的对照组(Control)。

结果如图3所示，对于步骤一2获得的五个克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载 体、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列，以及向A549细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和无义干扰序列)，以及NCI-H460细胞和A549细胞而言，不经化 疗药物VP16处理均不会引起细胞凋亡。而经化疗药物VP16处理后，向NCI-H460细胞和A549 细胞中转入无义干扰序列的克隆细胞，以及NCI-H460细胞和A549细胞均未见细胞凋亡，但是 向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的两个克隆细胞，以及向A549细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞均有明显的细胞凋亡(图3中箭头所示细胞即为凋亡细 胞)。由此可见，仅仅沉默CABYR-a/b不引起细胞凋亡，但沉默CABYR-a/b可促进肺癌细胞对 化疗药物VP16诱导凋亡的敏感性。

四、AnnexinV/PI染色后采用流式分析仪定量检测细胞早期和晚期的凋亡率

供试细胞：步骤一2获得的五种单克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列，以及向A549细胞 中分别转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和无义干扰序列)，以及NCI-H460细胞和A549 细胞。

将各供试细胞分别以60×10⁴个/孔接种到6孔板中。贴壁过夜后，将化疗药物VP16加入到 每个孔中至其终浓度为30μmol/L。培养24小时后按照如下进行AnnexinV/PI染色后采用流式分 析仪定量检测细胞早期和晚期的凋亡率：加入化疗药物VP16处理24h后，1000rpm离心10min 收集细胞，PBS洗三次。500μL孵育缓冲液重悬后，分别加入10μLAnnexinV-FITC，再加入10μL PI(碘化丙啶)，室温染色15-20min，流式细胞仪检测凋亡情况。统计早期凋亡和晚期凋亡的比 率。

结果如图4所示，经化疗药物VP16处理后，无论是对于NCI-H460细胞而言，还是对于 A549细胞而言，向其中转入无义干扰序列的克隆细胞仅有少量细胞发生凋亡，但当沉默了 CABYR-a/b后，细胞凋亡率显著提高，特别是早期凋亡细胞比例明显升高(参见图4中流式细 胞图的右下象限)。NCI-H460细胞和A549细胞的凋亡情况与向其中转入无义干扰序列的克隆细 胞组基本一致，无统计学差异。由此可见，沉默CABYR-a/b有助于增强化疗药物VP16诱导肺 癌细胞凋亡，特别是早期凋亡。

五、采用westernblot对沉默CABYR-a/b的肺癌细胞联合VP16处理后的凋亡相关的caspase3 进行检测

供试细胞：步骤一2获得的五个克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列，以及向A549细胞 中分别转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和无义干扰序列)，以及NCI-H460细胞和A549 细胞。

将各供试细胞分别以60×10⁴个/孔接种到60mm平皿中。贴壁过夜后，用50μmol/L的caspase 抑制剂Z-VAD-FMK(德国Merck公司产品，其产品目录号为627610)进行预处理1h(同时设 置不经Z-VAD-FMK处理组作为对照)，然后将化疗药物VP16加入到每个孔中至其终浓度为 20μmol/L。培养24小时后，提取细胞的总蛋白。后按照如下采用westernblot对沉默CABYR-a/b 的肺癌细胞联合VP16处理后的凋亡相关的caspase3进行检测。

Westernblot方法如下：制备分离胶，灌入垂直的玻璃板之间，上层用水封，凝胶后，将水 倒掉，用吸水纸吸干。灌入事先配好的浓缩胶，插入梳子，待浓缩胶凝固后，拔出梳子，将板子 放入电泳槽中，加入电泳缓冲液。取等量蛋白即预染蛋白Marker上样，通过10％的SDS-PAGE 对蛋白进行分离，80V恒压进行浓缩胶电泳，120V恒压进行分离胶电泳，直至溴酚蓝跑至分离 胶前沿时即可终止电泳，进行转膜。将与凝胶等大小的PVDF膜和滤纸浸泡在转移buffer中， PVDF膜用甲醇预先激活。打开转膜用的夹子，黑色一面水平，依次放上海绵垫，3层滤纸，PAGE 胶，PVDF膜，3层滤纸，海绵垫，用玻璃棒赶出旗袍。350mA恒流转膜2h。取出PVDF膜，1 ×丽春红染色，观察膜上条带是否清晰；按照分子量剪膜，TBS漂洗脱色，5％脱脂奶粉室温封 闭1h。取出膜，放入杂交袋中，加入一抗，4℃孵育过夜。TBS洗膜3次，每次5分钟。取出膜， 放入杂交袋，加入二抗，37℃孵育1h。TBS洗膜3次，每次5分钟。DAB显色或化学曝光显影。 其中，用于检测PARP的一抗为兔抗人PARP抗体(美国CST公司产品，其产品目录号为9532)； 二抗为anti-IgG(H+LChains)(Rabbit)(HRP)(日本MBL公司产品，其产品目录号为458)。用于检 测cleavedPARP的一抗为兔抗人cleavedPARP抗体(美国CST公司产品，其产品目录号为9532)； 二抗为anti-IgG(H+LChains)(Rabbit)(HRP)(日本MBL公司产品，其产品目录号为458)。用于检 测caspase3的一抗为兔抗人caspase3抗体(美国CST公司产品，其产品目录号为9663)；二抗 为anti-IgG(H+LChains)(Rabbit)(HRP)(日本MBL公司产品，其产品目录号为458)。用于检测 cleavedcaspase3的一抗为兔抗人cleavedcaspase3抗体(美国CST公司产品，其产品目录号为 9663)；二抗为anti-IgG(H+LChains)(Rabbit)(HRP)(日本MBL公司产品，其产品目录号为458)。 以β-actin为内参，用于检测β-actin的一抗为鼠抗人β-actin抗体(美国SantaCruz公司产品，其 产品目录号为sc-4778)；二抗为anti-IgG(H+LChains)(Mouse)(HRP)(日本MBL公司产品，其 产品目录号为330)。

结果如图5所示，由图可见，CABYR-a/b沉默联合化疗药物VP16可明显促进caspase3的 断裂，并且上述caspase3的活性可被Z-VAD-FMK所抑制。

六、沉默CABYR-a/b后可明显促进体内肺癌细胞对化疗药物VP16的敏感性

供试细胞：步骤一2获得的向NCI-H460细胞中转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121 和无义干扰序列的克隆细胞。

所有的实验动物均为4-6周龄雌性BALA/c裸鼠，来自于北京维通利华实验动物技术有限公 司，均在北京大学动物中心实验室进行培养。每只裸鼠的双侧腋下分别接种100微升2×10⁷个/ 毫升的供试细胞。待肿瘤直径长到0.5cm时，开始尾静脉注射化疗药物VP16(10mg/Kg小鼠体 重)，以等体积生理盐水作为对照，每天测量荷瘤大小，19天后处死裸鼠，取出荷瘤，称重。分 析方法均使用Mann-Whitney双边检验和T检验分析。并采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定法(TUNEL)对各处理的肿瘤组织凋亡情况进行检测，具体根据美国Fisher Scientific公司TUNEL试剂盒方法进行操作，使用ZeissAxio进行成像分析。

结果显示：与体外的结果一致，沉默CABYR-a/b后可明显促进体内肺癌细胞对化疗药物 VP16的敏感性。荷瘤体积的从小到大依次为：沉默CABYR-a/b+VP16<沉默CABYR-a/b<空载 对照+VP16<空载对照组，见图6和表1。采用TUNEL染色检测荷瘤组织中的凋亡情况，发现沉 默CABYR-a/b+VP16组的凋亡细胞最多，其次是空载对照+VP16组，而没有VP16药物处理的 沉默CABYR-a/b及其空载对照组荷瘤组织中未见凋亡细胞，见图7。其中，空载对照指的即是 向NCI-H460细胞中转入无义干扰序列的克隆细胞。

表1不同处理组小鼠的荷瘤体积及肿瘤重量比较

注：a表示sh-vec组裸鼠肿瘤重量的抑制率；b表示shRNA组裸鼠肿瘤重量的抑制率。sh-vec 对应的是向NCI-H460细胞中转入无义干扰序列的克隆细胞；shRNA对应的是向NCI-H460细胞 中转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞。

实施例2、沉默CABYR-a/b可以促进肺癌细胞对TRAIL的敏感性

本实施例除了涉及CABYR-a/b蛋白外，还涉及TRAIL蛋白和DR5蛋白。其中，TRAIL蛋 白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；DR5蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

一、沉默NCI-H460细胞中的CABYR-a/b

参见实施例1步骤一，最终获得三种单克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列)。

二、采用MTT法检测TRAIL处理稳定沉默CABYR-a/b的NCI-H460细胞后的细胞存活率

将步骤一获得的三种单克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列)分别以8000个/孔 接种到96孔板中。贴壁过夜后，将不同浓度的rhTRAIL加入到每个孔中，0.1％(0.1g/100ml) BSA作为对照。每个浓度有四个平行(实验同时设置不经TRAIL处理的对照)。培养时间设置 两平行，即12小时和24小时。培养结束后，将待测孔的培养基吸干净后，加入100微升新鲜培 养基，避光加入1毫克/毫升的MTT，37℃孵育3小时后加入SDS裂解液，放置12、24小时， 酶标仪测定OD_450/630值。将对照细胞的OD值作为对照，从而得出存活率。

实验同时设置NCI-H460细胞作为阴性对照。

结果如图8所示，单独沉默CABYR-a/b，不经rhTRAIL处理，没有引起细胞凋亡。但经 rhTRAIL处理后，无论是培养12h还是培养24h，与作为阴性对照的NCI-H460细胞相比，步骤 一获得的向NCI-H460细胞中转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的两种单克隆细胞的存活率明显降低(P<0.01)。而步骤一获得的向 NCI-H460细胞中转入无义干扰序列的克隆细胞的存活率与阴性对照(NCI-H460细胞)基本一 致，无统计学差异。

三、AnnexinV/7-AAD染色后采用流式分析仪定量检测TRAIL处理稳定沉默CABYR-a/b的 NCI-H460细胞后的细胞凋亡情况

供试细胞：步骤一获得的三种单克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列)，以及NCI-H460细 胞。

将各供试细胞分别以30×10⁴个/孔接种到6孔板中。贴壁过夜后，将rhTRAIL加入到每个 孔中至其终浓度为20ng/mL。培养6小时后按照如下进行AnnexinV/7-AAD染色后采用流式分 析仪定量检测细胞凋亡：加入rhTRAIL处理6h后，1000rpm离心10min收集细胞，PBS洗三次。 500μL孵育缓冲液重悬后，分别加入10μLAnnexinV-PE，再加入10μL7-AAD，室温染色15-20min， 流式细胞仪检测凋亡情况。统计早期凋亡和晚期凋亡的比率。

结果如图9所示，当细胞经过20ng/mL的rhTRAIL处理6小时后，向NCI-H460细胞中转 入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞的平均凋亡率从5.65％增加到37.02％，向 NCI-H460细胞中转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的克隆细胞的平均凋亡率从5.53％ 增加到29.52％，向NCI-H460细胞中转入无义干扰序列的克隆细胞的平均凋亡率从5.53％增加到 9.09％。从各组平均凋亡细胞比例的增加幅度可以明确看出，沉默CABYR-a/b增强了rhTRAIL 诱导所致肿瘤细胞凋亡。

四、步骤三的挽救实验

针对步骤三的检测结果，本发明的发明人进行了挽救实验，即在稳定沉默CABYR的H460 细胞和对照细胞中过表达CABYR-a。

1、向沉默了CABYR-a/b的NCI-H460细胞中重新转入CABYR-a

供试细胞：步骤一获得的三个克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列)，以及作为阴性对照 的NCI-H460细胞。

向各供试细胞中分别转入用于过表达CABYR-a的重组质粒pCMV-Myc-CABYR-a(具体构 建方法参见下文)，具体按照Lipofectamin^TM2000转染试剂盒(美国Invitrogen公司产品)说明书 进行转染。转染24小时后，将转染的细胞1：3传代，待细胞贴壁后，加入0.4毫克/毫升G418 筛选，直至挑出阳性克隆细胞株。

其中，用于过表达CABYR-a的重组质粒pCMV-Myc-CABYR-a是按照如下方法构建获得的： 以序列表中序列8所示DNA片段(即CABYR-a基因CDS)为模板，采用引物 pCMV/Myc-CABYR-a-sense和pCMV/Myc-CABYR-a-anti进行PCR扩增，将所得PCR产物进行 EcoRI和SalI双酶切，所得酶切产物与经过同样双酶切的pCMV-Myc载体(Clontech公司产品) 骨架大片段相连，得到重组质粒。将经测序表明在pCMV-Myc载体的酶切位点EcoRI和SalI之 间插入了序列表中序列8所示DNA片段的重组质粒命名为pCMV-Myc-CABYR-a。

pCMV/Myc-CABYR-a-sense：5’-CGGAATTCTCATTTCTTCAAAGCCCAGAC-3’；

pCMV/Myc-CABYR-a-anti：5’-ACGCGTCGACTTATTCAGCTGTTGATTCC-3’。

实验同时设置向各供试细胞中转入pCMV-Myc空载体的对照。

2、CABYR-a/b基因表达水平检测

A.RNA水平RT-PCR检测

从步骤1获得的各克隆细胞(向步骤一获得的三种克隆细胞和作为阴性对照的NCI-H460细 胞中分别转入用于过表达CABYR-a的重组质粒pCMV-Myc-CABYR-a和pCMV-Myc空载体) 中分别提取总RNA，将其反转录为cDNA，以所得cDNA作为模板进行PCR扩增，检测各单克 隆中CABYR-a/b基因在转录水平上的表达量。实验同时设置步骤一获得的三个克隆细胞(向 NCI-H460细胞中分别转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303 和无义干扰序列)，以及NCI-H460细胞作为阴性对照。具体引物序列参见实施例1步骤一。

结果显示：

(a1)对于步骤一获得的转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的两个克隆细胞而言，当转入用于过表达CABYR-a的重组质粒 pCMV-Myc-CABYR-a后，其中CABYR-基因的表达量明显提高；而当转入pCMV-Myc空载体 后，其中CABYR-a基因的表达量基本没有变化。

(a2)对于步骤一获得的转入无义干扰序列的克隆细胞而言，当转入用于过表达CABYR-a 的重组质粒pCMV-Myc-CABYR-a后，其中CABYR-a基因的表达量显著提高；而当转入 pCMV-Myc空载体后，其中CABYR-a基因的表达量基本没有变化。

(a3)对于作为阴性对照的NCI-H460细胞而言，当转入用于过表达CABYR-a的重组质粒 pCMV-Myc-CABYR-a后，其中CABYR-a基因的表达量显著提高；而当转入pCMV-Myc空载体 后，其中CABYR-a基因的表达量基本没有变化。

B.蛋白水平Westernblot检测

分别收集步骤1获得的各单克隆细胞(向步骤一获得的三种单克隆细胞和作为阴性对照的 NCI-H460细胞中分别转入用于过表达CABYR-a的重组质粒pCMV-Myc-CABYR-a和 pCMV-Myc空载体)，裂解之后把等量蛋白进行Westernblot检测，具体操作参见步骤一3B。实 验同时设置步骤一获得的三个克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列)，以及NCI-H460细 胞作为阴性对照。

结果显示：

(b1)对于步骤一获得的转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的两个克隆细胞而言，当转入用于过表达CABYR-a的重组质粒 pCMV-Myc-CABYR-a后，其中CABYR-a蛋白的表达量明显提高；而当转入pCMV-Myc空载体 后，其中CABYR-a蛋白的表达量基本没有变化。

(b2)对于步骤一获得的转入无义干扰序列的克隆细胞而言，当转入用于过表达CABYR-a 的重组质粒pCMV-Myc-CABYR-a后，其中CABYR-a蛋白的表达量显著提高；而当转入 pCMV-Myc空载体后，其中CABYR-a蛋白的表达量基本没有变化。

(b3)对于作为阴性对照的NCI-H460细胞而言，当转入用于过表达CABYR-a的重组质粒 pCMV-Myc-CABYR-a后，其中CABYR-a蛋白的表达量显著提高；而当转入pCMV-Myc空载体 后，其中CABYR-a蛋白的表达量基本没有变化。

3、AnnexinV/7-AAD染色后采用流式分析仪定量检测TRAIL处理后的细胞凋亡情况

供试细胞：步骤1获得的各单克隆细胞(向步骤一获得的三种单克隆细胞和作为阴性对照的 NCI-H460细胞中分别转入用于过表达CABYR-a的重组质粒pCMV-Myc-CABYR-a和 pCMV-Myc空载体)。

具体操作参见步骤三进行。

结果如图10所示，细胞经过rhTRAIL处理后发现，当向步骤一获得的转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121和pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的两个克隆细胞中转入用于过表达 CABYR-a的重组质粒pCMV-Myc-CABYR-a后，细胞的凋亡率有明显回降。这一结果进一步证 实了CABYR-a/b的表达水平影响了rhTRAIL在NCI-H460细胞诱导凋亡的程度。

五、沉默CABYR-a/b后可明显促进体内肺癌细胞对TRAIL的敏感性

所有的实验动物均为4-6周龄雌性BALA/c裸鼠，来自于北京维通利华实验动物技术有限公 司，均在北京大学动物中心实验室进行培养。每只裸鼠的双侧腋下分别接种100微升2×10⁷个/ 毫升的步骤一获得的向NCI-H460细胞中转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121后获得的克 隆细胞，或者等量的步骤一获得的向NCI-H460细胞中转入无义干扰序列后获得的克隆细胞。当 肿瘤直径达到0.3cm时，将这些裸鼠随即分成两组：(i)0.9％(质量分数)NaCl(对照组)和(ii) rhTRAIL(10mg/kg小鼠体重/次)。NaCl和rhTRAIL对裸鼠进行隔天一次的尾静脉注射，同时用 游标卡是测量荷瘤体积。经过11天对所有裸鼠的处理，将所有的裸鼠处死，测量实体荷瘤重量。 分析方法均使用Mann-Whitney双边检验和T检验分析。并采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)对各处理的肿瘤组织凋亡情况进行检测，具体根据美国 FisherScientific公司TUNEL试剂盒方法进行操作，使用ZeissAxio进行成像分析。

结果如图11所示，可见：在第7天时，经过rhTRAIL处理的向NCI-H460细胞中转入沉默 载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121后获得的克隆细胞组小鼠(shRNA+TRAIL)荷瘤大小较向 NCI-H460细胞中转入无义干扰序列后获得的克隆细胞组小鼠(sh-Vec+Nacl)荷瘤大小已经受到 了很强烈的抑制(P<0.01)，同样，经过rhTRAIL处理的向NCI-H460细胞中转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121后获得的克隆细胞组小鼠(shRNA+TRAIL)的肿瘤重量也是几组中 最低的。为了进一步检测肿瘤体积大小的差异是否是由于rhTRAIL引起的凋亡来实现的，本发 明的发明人进一步采用了TUNEL染色的方法，经过对荷瘤的切片、染色，发现rhTRAIL处理 的沉默了CABYR-a/b的细胞的凋亡率要远大于其他组别。以上实验结果证实了在体内，沉默 CABYR-a/b可以增加TRAIL介导的肿瘤细胞的凋亡。

六、沉默CABYR-a/b是通过上调DR5的表达提高肺癌细胞对TRAIL诱导的凋亡

为了进一步探索沉默CABYR-a/b的NCI-H460细胞对TRAIL诱导的凋亡更加敏感的机制， 发明人检测了步骤一获得的三个克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列)中死亡受体DR4 和DR5的表达。细胞表面受体DR4和DR5的表达情况的不同，可以解释细胞对rhTRAIL的敏 感性和抗性的差异。

1、mRNA水平和蛋白水平检测DR5的表达情况

RT-PCR和westernblot的具体操作参见实施例1步骤一3进行。

RT-PCR中用于检测DR5的扩增引物序列如下：

DR5F：5’-TAAAGGTGGCTAAAGCTGAGGCAGC-3’；

DR5R：5’-TCAAAGTACGCACAAACGGAATGAT-3’。

以GAPDH为RT-PCR的内参，具体扩增引物序列通实施例1步骤一3。

westernblot中，用于检测DR5蛋白的一抗为兔抗人DR5单抗(香港Abcam公司产品，其 产品目录号为ab47179)；二抗为anti-IgG(H+LChains)(Rabbit)(HRP)(日本MBL公司产品，其 产品目录号为458)。以β-actin为内参，用于检测β-actin的一抗为鼠抗人β-actin抗体(美国 SantaCruz公司产品，其产品目录号为sc-47778)；二抗为anti-IgG(H+LChains)(Mouse)(HRP)(日 本MBL公司产品，其产品目录号为330)。

结果如图12中A所示，可见沉默CABYR-a/b可以增加DR5在mRNA和蛋白水平上的表 达，经检测其他受体并没有发生变化，其他受体的表达量经检测并没有发生明显的变化。

2、利用DR5的特异性抗体，经过流式细胞术检测细胞膜表面的DR5受体的表达量

供试细胞：步骤一获得的三个克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列)，以及NCI-H460细 胞。

取各供试细胞1×10⁶个，加入10μg/mL的兔抗人DR5单抗(香港Abcam公司产品，其产品 目录号为ab47179)，冰上孵育1h，PBS洗3次，每次5分钟。加入FITC标记的羊抗兔的二抗 (美国CST公司产品，其产品目录号为sc-2012)，避光，4℃孵育45分钟。PSB洗3次，每次 5分钟后，流式上机检测。

同时以IgG替代DR5特异性抗体作为对照。

结果如图12中B所示，可见利用DR5的特异性抗体，经过流式细胞术检测向NCI-H460细 胞中分别转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的两种单克隆 细胞的细胞膜表面的DR5受体的表达量明显高于向NCI-H460细胞中转入无义干扰序列的单克 隆细胞，同时IgG做对照的对照组并没有发现类似的现象。

3、进一步利用AD5-10抗体处理细胞流式细胞术检测细胞凋亡

为了证实DR5的表达升高是引起CABYR-a/b沉默的细胞对TRAIL更敏感的原因，发明人 利用AD5-10抗体处理细胞。AD5-10是DR5的竞争性单克隆抗体，其可以特异性的结合DR5 进而诱导细胞的凋亡。

供试细胞：步骤一获得的三个克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列)，以及NCI-H460细 胞。将各细胞分别以30×10⁴个/孔接种到6孔板中。贴壁过夜后，将AD5-10(由杂交瘤细胞株 CGMCCNo.1192分泌产生，该杂交瘤细胞株参见已授权中国专利ZL200410070093.1)加入到 每个孔中至其终浓度为200ng/mL。培养24小时后按照如下进行AnnexinV/7-AAD染色后采用 流式分析仪定量检测细胞凋亡：加入AD5-10抗体处理24h后，1000rpm离心10min收集细胞， PBS洗三次。500uL孵育缓冲液重悬后，分别加入10μLAnnexinV-PE，再加入10μL7-AAD，室 温染色15-20min，流式细胞仪检测凋亡情况。统计早期凋亡和晚期凋亡的比率。

同时以IgG替代AD5-10抗体作为对照。

结果如图12中C和D所示，与非特异性IgG对照组相比，经200ng/mL的AD5-10处理24 小时，向NCI-H460细胞中转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121的克隆细胞的平均凋亡率 从6.07％增加到32.73％，向NCI-H460细胞中转入沉默载体pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303的克隆 细胞的平均凋亡率从6.41％增加到26.75％，而向NCI-H460细胞中转入无义干扰序列的克隆细胞 的平均凋亡率从6.18％增加到10.88％。因此，AD5-10可以效仿TRAIL在沉默CABYR-a/b的细 胞中发挥的凋亡作用。

4、使用了特异性抗DR5的抗体去进行封闭实验MTT法检测细胞凋亡率

供试细胞：步骤一获得的三个克隆细胞(向NCI-H460细胞中分别转入沉默载体 pGPH1/Neo-CABYR-a/b-121、pGPH1/Neo-CABYR-a/b-303和无义干扰序列)，以及NCI-H460细 胞。

将各供试细胞分别以8000个/孔接种到96孔板中。贴壁过夜后，将兔抗人DR5单抗(香港 Abcam公司产品，其产品目录号为ab47179)加入到每个孔中，至其终浓度为100ng/mL、 200ng/mL。24小时后，将rhTRAIL加入到每个孔中至其终浓度为20、50、100、200ng/mL。24 小时后，将待测孔中的培养基吸干净，每孔加入100μl的新鲜完全培养基，避光加入10μlMTT， 培养箱中孵育4-6小时，加入100μlSDS-HCl裂解液，14-16小时后，酶标仪测定OD_450/630值。

同时以IgG替代特异性抗DR5抗体作为对照。

结果如图12中E和F显示，增加不同浓度的抗DR5的抗体可以部分的封闭TRAIL介导的 凋亡。根据上述实验结果，可以得到结论，DR5的表达上调对于TRAIL诱导的沉默CABYR-a/b 细胞敏感性的改变有很重要的作用。