癫痫宁在制备预防或治疗阿尔茨海默病药物中的应用

摘要

本发明公开了癫痫宁的新用途，该用途为癫痫宁在制备预防或治疗阿尔茨海默病药物中的应用。癫痫宁为治疗癫痫的中成药，本发明经过动物实验结果证实，癫痫宁对阿尔茨海默病动物病理模型的麻痹表型具有明显的抑制作用，说明癫痫宁有预防或治疗阿尔茨海默病的潜力。本发明公开的癫痫宁的新用途扩大了癫痫宁的适应症，可在制备预防或治疗阿尔茨海默病药物中应用。

说明书

技术领域

本发明涉及癫痫宁的新用途，具体涉及癫痫宁在制备预防或治疗阿尔茨海 默病药物中的应用，属于中医药领域。

背景技术

阿尔茨海默病(Alazheimer’sdisease，AD)是一种以进行性认知障碍和记 忆损伤为主的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、 视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。 目前用于治疗阿尔茨海默病的药物主要分为两类：乙酰胆碱酯酶抑制剂(如加 兰他敏)和N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA受体)拮抗剂(如美金刚)，但上 述药物价格昂贵、副作用显著(幻觉、意识混沌、头晕、头痛和疲倦)，且只能 控制却不能逆转患者病情。

现代医学对阿尔茨海默病的发病机制进行了多年的研究，但是由于其病因 复杂，该病的发病机制至今仍不明确。目前较为主流的学说是β-淀粉样蛋白(A β)学说，该学说的核心是患者大脑中异常沉积的Aβ通过自由基反应、线粒 体氧化损伤和炎症反应等一系列级联反应，直接或者间接作用于神经元和神经 胶质细胞，最终导致神经元功能异常或者死亡，引发认知损伤及记忆衰退，最 终引起痴呆。

阿尔茨海默病患者的大脑皮层和海马出现β淀粉样蛋白(Aβ)聚集形成的 老年斑(SP)是阿尔茨海默病最为主要病理特征之一，β-淀粉样蛋白可以有效 削弱突触结构和功能，是引起阿尔茨海默病的重要物质。因此β淀粉样蛋白已 成为公认的筛选预防或治疗阿尔茨海默病药物的靶标。

阿尔茨海默病病因复杂且发病环节较多，目前西药针对阿尔茨海默病的某 一特定病理环节进行干预往往会出现耐药及严重不良反应。而中药具有多种活 性成分、多靶点的作用特征，使中药治疗阿尔茨海默病具有明显的优越性。

发明内容

本发明的目的在于提供癫痫宁的一种新用途，具体涉及癫痫宁在制备预防 或治疗阿尔茨海默病药物中的应用。

所述的癫痫宁剂型可以为片剂、丸剂、胶囊剂、口服液或颗粒剂。剂型不 同不影响癫痫宁在预防或治疗阿尔茨海默病方面的功能。

本发明公开的所述的癫痫宁在制备预防或治疗阿尔茨海默病药物中的应 用，所述的癫痫宁为癫痫宁片。

癫痫宁片剂是由蜘蛛香、石菖蒲、钩藤、牵牛子、千金子、缬草、甘松、 薄荷脑八味药经过现代制药工艺精制而成的中成药。目前，癫痫宁用于风痰上 扰癫痫病，或用于癔病、失眠等。

本发明将转基因秀丽线虫株系CL4176作为筛选预防或治疗阿尔茨海默病 药物的病理模型来评价癫痫宁预防或治疗阿尔茨海默病的作用，是基于：阿尔 茨海默病患者的大脑皮层和海马出现β淀粉样蛋白(Aβ)聚集形成的老年斑 (SP)是阿尔茨海默病最为主要病理特征之一，β-淀粉样蛋白可以有效削弱突 触结构和功能，是引起阿尔茨海默病的重要物质。转基因秀丽线虫品系CL4176 在25℃温度诱导下肌肉特异性表达人类Aβ，Aβ在肌肉组织聚集，最终导致 线虫麻痹。将药物作用于线虫株系CL4176，如果线虫群体麻痹状况得到改善， 具体表现为线虫的麻痹时间显著延滞，则说明药物具有预防或治疗阿尔茨海默 病作用。

秀丽隐杆线虫对外界环境变化反应敏感，利用秀丽线虫可以对药物的毒性 进行准确评价，体长是最为常用的发育毒性评价指标之一。药物作用于线虫后， 如果线虫体长显著减小，则说明药物对线虫具有显著的发育毒性。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明评估癫痫宁对秀丽隐杆线虫阿尔茨海默病模型麻痹表型的作用，结 果证实了癫痫宁对秀丽隐杆线虫阿尔茨海默病模型麻痹表型具有明显的抑制作 用，具有预防或治疗阿尔茨海默病的潜力。

因此，中成药癫痫宁可用于制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

图1为阳性药物盐酸美金刚对秀丽隐杆线虫阿尔茨海默病模型麻痹表型的 影响。

图2为癫痫宁片对秀丽隐杆线虫阿尔茨海默病模型麻痹表型的影响。

图3为蜘蛛香、石菖蒲、钩藤及其癫痫宁片的药效评价实验结果。

图4为蜘蛛香与癫痫宁片的毒性评价实验结果。

具体实施方式

以下提供具体实施例以实现本发明所述的癫痫宁在制备预防或治疗阿尔茨 海默病药物中的应用，但不限于这些实施例。

实施例一盐酸美金刚对秀丽隐杆线虫CL4176的作用

1.生物材料

(1)秀丽隐杆线虫CL4176购自CaenorhabditisGeneticsCenter；为转基因 品系，在25℃温度诱导下肌肉特异性表达人类Aβ，Aβ在肌肉组织聚集，最 终导致线虫麻痹，本实施例采用秀丽线虫品系CL4176作为筛选预防或治疗阿尔 茨海默病药物的病理模型。

(2)大肠杆菌OP50(尿嘧啶渗漏突变株)，购自CaenorhabditisGenetics Center，作为秀丽隐杆线虫的食物。

2.试剂

(1)盐酸美金刚(MEM)，化学名称：1-氨基-3，5-二甲基金刚烷胺盐酸盐， 分子式：C₁₂H₂₁N·HCl，购自百灵威科技，CAS：41100-52-1；盐酸美金刚为非 竞争性NMDA受体拮抗剂，用于治疗中重度至重度阿尔茨海默型痴呆，文献报 道美金刚(2.16mg/ml)能够显著抑制转基因线虫株系CL4176麻痹表型，本实 施例将其作为阳性药物。

(2)固体NGM(NematodeGrowthMedium)培养基成分与制作(以1升为 例)：

成分 含量 NaCl 3.00g K₂HPO₄2.34g KH₂PO₄17.23g 蛋白胨 2.50g 琼脂 17.00g 补充H₂O至 1000ml

固体NGM培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，在无菌操作台下 加入5mg/ml胆固醇1ml，1MMgSO₄1ml,1MCaCl₂1ml,摇匀，趁热倒入已灭菌的 9cm培养板，约20ml/板。静置等待培养基凝固，备用。

(3)配制含盐酸美金刚的NGM培养基

盐酸美金刚溶解于无菌水中，配制成为2.16mg/ml的母液；将美金刚母液加 入融化的NGM培养基中，配制为含盐酸美金刚终浓度为215.76μg/ml、107.88μ g/ml、21.58μg/ml、4.32μg/ml、0.86μg/ml的NGM培养基。

空白对照为同样条件下加入与盐酸美金刚等体积无菌水的NGM培养基。

上述培养基上均涂布大肠杆菌OP50作为线虫的食物。

(4)M9液配方

(5)裂解液的配制：6.4％NaClO₃溶液和1MNaOH溶液按体积比1:1混 合。

3.实施步骤

(1)线虫的培养：

将线虫接在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上，然后置于16℃的培养箱 中培养，当线虫长到成虫时进行同步化处理。

(2)线虫同步化：

挑选含有大量成虫并且有部分线虫卵已经孵出的NGM培养基，用M9液将 线虫从培养基上冲下，转移到离心管中，静置使线虫自由沉降至管底，弃上清。 视线虫量多少向离心管中加入线虫碱裂解液，在漩祸搅拌器上振荡5-7分钟待线 虫全部断裂时停止涡旋,并分装于1.5mL离心管中，用M9溶液洗线虫卵三次。

(3)盐酸美金刚(MEM)对秀丽隐杆线虫CL4176的作用

线虫同步化后将线虫卵转移到涂布有OP50并混合不同浓度盐酸美金刚的 NGM培养基上，空白对照为涂布有OP50并加有与盐酸美金刚等体积无菌水的 NGM培养基。每个培养基60条线虫，每个药物浓度以三个培养基作为平行， 16℃培养3天至L3期。

为了使线虫表达Aβ，将L3期线虫转至25℃下进行诱导，34h后开始计数 线虫麻痹条数。每两小时计数一次，直至所有线虫都麻痹(麻痹是指机械刺激 线虫身体时，线虫不能运动或者只有头部运动)，结果见图1。

由图1可以看出，水溶解的阳性药物盐酸美金刚在21.58μg/ml、4.32μg/ml、 0.86μg/ml时能够显著抑制CL4176麻痹表型，215.76μg/ml和107.88μg/ml盐 酸美金刚强烈抑制线虫发育。实验结果表明本实验体系正常，说明本发明能够 采用秀丽线虫品系CL4176作为筛选预防或治疗阿尔茨海默病药物。

实施例二癫痫宁片对秀丽隐杆线虫CL4176的作用

1.生物材料同实施例一。

2.试剂

(1)癫痫宁片：生产厂家：昆明中药厂，批准文号：国药准字Z53020771。

(2)固体NGM(NematodeGrowthMedium)培养基成分与制作(以1升为 例)：同实施例一。

(3)配制含水溶解的癫痫宁片NGM培养基

火焰加热癫痫宁片，剥去糖衣。将癫痫宁片用研钵研成粉末，溶解于无菌水 中，并配置成为150mg/ml癫痫宁片水溶液，室温下超声30min，并于10000rpm 下离心10min，取上清，于4℃保存。将癫痫宁片水溶液加入融化的NGM培养基 中，配制成为含癫痫宁片终浓度为1.0mg/ml、5.0mg/ml、15.0mg/ml的NGM培 养基。

空白对照为同样条件下加入与癫痫宁片水溶液等体积无菌水的NGM培养基。

上述培养基上均涂布大肠杆菌OP50作为线虫的食物。

(4)M9液配方：同实施例一。

(5)裂解液的配制：同实施例一。

3.实施步骤

(1)线虫的培养：同实施例一。

(2)线虫同步化：同实施例一。

(3)癫痫宁片对秀丽隐杆线虫CL4176的作用

线虫同步化后将线虫卵转移到涂布有OP50并混合不同浓度的癫痫宁片水 溶液的NGM培养基上，空白对照为涂布有OP50并加有与癫痫宁片水溶液等体 积无菌水的NGM培养基，每个培养基60条线虫，每个药物浓度三个培养基作 为平行，16℃培养3天至L3期。

为了使线虫表达Aβ，将L3期线虫转在25℃下进行诱导，34h后开始计数 线虫麻痹条数。每两小时计数一次，直至所有线虫都麻痹(麻痹是指机械刺激 线虫身体时，线虫不能运动或者只有头部运动)，结果见图2。

由实验结果可以看出，水溶解的癫痫宁片在15mg/ml、5mg/ml能显著抑制 转基因秀丽线虫Aβ过度表达引起的麻痹，尤其是15mg/ml癫痫宁片极为显著 地抑制Aβ引起的线虫麻痹表型(p＜0.001)，且上述各组均呈现出一定的量效 关系。

总之，由上述实施例可以看出，癫痫宁对阿尔茨海默病动物病理模型秀丽 隐杆线虫Aβ聚集引起的麻痹表型具有明显的抑制作用，说明癫痫宁具有预防 或治疗阿尔茨海默病的潜力。本发明的新用途扩大了癫痫宁的适应症，可在制 备预防或治疗阿尔茨海默病药物中应用。

实施例三癫痫宁片的药效及毒性对比评价实验

1.生物材料同实施例一。

2.试剂

(1)癫痫宁片：昆明中药厂(生产厂家)，批准文号：国药准字Z53020771。

(2)蜘蛛香、石菖蒲、钩藤购自兰州惠仁堂药业连锁有限责任公司。

(3)固体NGM(NematodeGrowthMedium)培养基成分与制作(以1升为 例)：同实施例一。

(4)配制含癫痫宁片的NGM培养基

火焰加热癫痫宁片，剥去糖衣。将癫痫宁片用研钵研成粉末，溶解于无菌水 中，并配置成为150mg/ml癫痫宁片水溶液，室温下超声30min，并于10000rpm 下离心10min，取上清，于4℃保存。将癫痫宁片水溶液加入融化的NGM培养基 中，配制成为含癫痫宁片终浓度为15.0mg/ml的NGM培养基。

(5)制备蜘蛛香提取物及其含蜘蛛香提取物NGM培养基

蜘蛛香总重量的3/5重量份提取挥发油，药材残渣加水煎煮1-2次，优选为 2次；每次1-2小时，优选为1.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度 为1.26-1.30的浸膏，优选相对密度为1.28的浸膏；蜘蛛香总重量的2/5重量 份粉碎成细粉备用。将以上挥发油、浸膏和细粉混匀，加入无菌水溶解，配置为 蜘蛛香水溶液，室温下超声30min，并于10000rpm下离心10min，取上清，于4℃ 保存。将蜘蛛香水溶液加入融化的NGM培养基中，使培养基中的蜘蛛香浓度与含 癫痫宁片的NGM培养基中的蜘蛛香浓度一致。

(6)制备石菖蒲提取物及其含石菖蒲提取物NGM培养基

石菖蒲提取挥发油，药材残渣加水煎煮1-2次，优选为2次；每次1-2小时， 优选为1.5小时，滤过，合并滤液；减压浓缩至相对密度为1.26-1.30的浸膏， 优选相对密度为1.28的浸膏。将以上挥发油和浸膏混匀，加入无菌水溶解，配 置为石菖蒲水溶液，室温下超声30min，并于10000rpm下离心10min，取上清， 于4℃保存。将石菖蒲水溶液加入融化的NGM培养基中，使培养基中的石菖蒲浓 度与含癫痫宁片的NGM培养基中的石菖蒲浓度一致。

(7)制备钩藤提取物及其含钩藤提取物NGM培养基

钩藤加水煎煮1-2次，优选为2次；每次1-2小时，优选为1.5小时，滤过， 合并滤液；减压浓缩至相对密度为1.26-1.30的浸膏，优选相对密度为1.28的 浸膏。向浸膏中加入无菌水溶解，配置为钩藤水溶液，室温下超声30min，并于 10000rpm下离心10min，取上清，于4℃保存。将钩藤水溶液加入融化的NGM培 养基中，使培养基中的钩藤浓度与含癫痫宁片的NGM培养基中的钩藤浓度一致。

(8)制备蜘蛛香、石菖蒲、钩藤组方提取物及其含组方NGM培养基

取配方2中蜘蛛香总重量的3/5重量份和石菖蒲分别提取挥发油，将所得残 渣与钩藤合并，加水煎煮1-2次，优选为2次；每次1-2小时，优选为1.5小时， 滤过，合并滤液；减压浓缩至相对密度为1.26-1.30的浸膏，优选相对密度为 1.28的浸膏。蜘蛛香总重量的2/5重量份粉碎成细粉备用。将以上挥发油、浸 膏和细粉混匀，加入无菌水溶解，配制为蜘蛛香、石菖蒲、钩藤组方提取物的水 溶液，室温下超声30min，并于10000rpm下离心10min，取上清，于4℃保存。 将蜘蛛香、石菖蒲、钩藤组方提取物的水溶液加入融化的NGM培养基中，使培养 基中的蜘蛛香、石菖蒲、钩藤浓度与含癫痫宁片NGM培养基中的蜘蛛香、石菖蒲、 钩藤的浓度一致。

空白对照为同样条件下加入与癫痫宁片水溶液等体积无菌水的NGM培养基。

上述培养基上均涂布大肠杆菌OP50作为线虫的食物。

(9)M9液配方：同实施例一。

(10)裂解液的配制：同实施例一。

3.实施步骤

(1)线虫的培养：同实施例一。

(2)线虫同步化：同实施例一。

(3)对癫痫宁片的药效对比评价

线虫同步化后将线虫卵转移到涂布有OP50并混合癫痫宁片的NGM培养 基、蜘蛛香提取物的NGM培养基、石菖蒲提取物的NGM培养基、钩藤提取物 的NGM培养基；空白对照为涂布有OP50并加有与癫痫宁片水溶液等体积无菌 水的NGM培养基，每个培养皿60条线虫，16℃培养3天至L3期。

为了使线虫表达Aβ，将L3期线虫转在25℃下进行诱导，34h后开始计数 线虫麻痹条数。每两小时计数一次，直至所有线虫都麻痹(麻痹是指机械刺激 线虫身体时，线虫不能运动或者只有头部运动)，结果见图3。

由实验结果可以看出，蜘蛛香、钩藤和石菖蒲都会显著抑制Aβ引起的线 虫麻痹表型(p＜0.001)，其中，蜘蛛香抑制Aβ引起的线虫麻痹表型效果最好， 几乎与癫痫宁片效果相当；钩藤与石菖蒲对线虫麻痹表型抑制效果不及癫痫宁 片(P＜0.001)。

(4)对癫痫宁片的毒性对比评价

麻痹实验结束后立即将线虫置于50℃处理15min，以使线虫身体伸直便于 测量。在显微镜下观察并使用MvImage图像处理系统拍照并测量线虫体长。结 果见图4。

由实验结果可以看出，与空白对照及其癫痫宁片相比，蜘蛛香组线虫体长 显著降低，表明蜘蛛香对线虫生长发育具有显著地抑制作用，毒性较癫痫宁片 大。

蜘蛛香、钩藤和石菖蒲及其癫痫宁片均能显著抑制Aβ聚集引起的线虫麻 痹表型，其中蜘蛛香与癫痫宁片效果最优；由本实施例的毒性评价实验可以看 出，与空白对照及其癫痫宁片相比，蜘蛛香显著抑制线虫生长发育，毒性显著 高于癫痫宁片，而癫痫宁片对线虫体长几乎没有影响，表明癫痫宁片毒性显著 低于蜘蛛香。

总之，本实施例结果表明癫痫宁在预防或治疗阿尔茨海默病方面具有效果 显著、毒性小的特点，说明癫痫宁具有预防或治疗阿尔茨海默病的潜力，本发 明的新用途扩大了癫痫宁的适应症，可在制备预防或治疗阿尔茨海默病药物中 应用。